Universidad Nacional Autnoma de Mxico Facultad de Estudios Superiores Zaragoza

Equipo 8: Alatriste Solano Edgar, Coln Castro Julieta, Cruz Hernndez Carlos, Merino Gonzlez Carlos Alberto

Caractersticas tintoriales de los hongos

HONGOS
Son hetertrofos (quimioorganotrofos), se alimentan de materia orgnica. Son eucariotas, presentan ncleo diferenciado con membrana bien organizada. Presentan una pared celular formada por polisacridos, polipptidos y quitina.

Se tienen hongos pluricelulares y unicelulares La estructura fngica (pluricelular) consta de un complejo llamado talo o micelio, que a su vez esta constituido por mltiples filamentos o hifas.

Los hongos (levaduras) son microscpicos, poseen forma redonda, estos se reproducen por gemacin

Estructura de los Hongos

Las hifas son tubos de longitud variable formadas por una pared celular rgida, en la que fluye protoplasma. Las hifas no constan de clulas, sino de compartimientos

Estructura de la clula fngica

Poseen: Ncleo con doble membrana Nuclolo Mitocondrias Retculo endoplsmico Vacuolas Ribosomas Aparato de Golgi Inclusiones cristalinas (ergosterol)

Pared celular
La pared es un exoesqueleto rgido que protege a la clula y condiciona la nutricin absortiva ya que no permite la endocitosis. Algunos hongos unicelulares producen cpsulas constituidas por polisacridos mucilaginosos con apacidadinmungena y accin antifagocitaria.

Composicin de la pared celular

Esta formada por capas de polisacridos Glucanos (polmeros -1,6, ramificados de glucosa) Mananos(polmeros 1,6, ramificados de manosa) Polmeros de glucosamina Protenas Lpidos (ergosterol) Quitina (polmero -1,4 de N-acetilglucosamina)

Quitina

Ergosterol
H HO H

Tinciones simples

Safranina
til para el estudio de cultivos y productos biolgicos lquidos.
Los elementos fngicos se tien de color rojo intenso, y el resto del campo toma un tono incoloro o rosa plido.

Rhizopuz sp.

Penicillium sp.

Aspergillussp.

Azul de algodn
El azul de lactofenol tiene tres funciones importantes a la hora de observar hongos del tipo mohos obtenidos por aislamiento o de medios inoculados. El fenol destruye la flora acompaante.

El acido lctico conserva las estructuras fungicas al provocar un cambio de gradiente osmtico con relacin al interior del fngico generando una pelcula por as llamarlo protectora,

Es til para realizar el examen directo de cultivos, ya que es una tcnica rpida que permite visualizar perfectamente las estructuras fngicas.
El colorante es fuertemente cido y se usa para la tincin directa de micelio miclico, el cual toma un delicado color azul claro.

Composicin: Alcohol metlico Azul de algodn acetico Agua destilada 250 mL Alcohol al 96% Xilol

Microsporiumcanis

Paracoccidioides brasiliensis Hongo dimrfico; Se visualiza macroconidia en forma de timn de barco

Rhizopus sp

Rhizopusstolonifer

Scedosporiumapiospermum

Anaranjado de Acridina
Se utiliza para la deteccin de bacterias y hongos en muestras clnicas Puede utilizarse un microscopio con accesorios fluorescentes como el de ReichertZetopan. El microscopio ordinario puede equiparse con filtros para filtracin fluorescente (BG12, de 4mm de espesor). Se colocan filtros amarillos de modo de barreras filtrantes.

Fundamento: El pigmento se intercala en el cido nucleico (nativo y desnaturalizado). Con pH neutro, las bacterias, los hongos y el material celular se tien de naranja rojizo. Con pH cido, las bacterias y los hongos se mantienen de color naranja rojizo, pero el material de fondo se tie de amarillo verdoso

Composicin: Alcohol absoluto cido actico Anaranjado de acridina Buffer de fosfatos Cloruro de calcio

Tincin de ascosporas de Sowerbyellarhenana en naranja de acridina

Mucor mucedo.

Candidaalbicans

Tincin con Eritrocina.

til para la observacin de grnulos causados por:

Nocardia Madurella grisea M. mycetomatis

Tincin de Eritrocina en M. mycetomatis

Solucin de eritrocina.
Reactivos utilizados:

Eritrocina de Grbler 0.20g Naranja G 1g Agua destilada 100mL

Granos de micetoma por Nocardiasp. Grano teido con eritocina

Tinciones diferenciales:

Son tcnicas que utilizan dos o ms colorantes y/o principios activos.

Tincin de Gram Tincin diferencial Se emplea para teir: Productos biolgicos lquidos Exudados de lesiones Macerados de biopsias Todos los hongos son positivos a la coloracin de Gram, excepto Cryptococcus neoformans.

El decolorante alcohol acetona disuelve a los lpidos de la pared impidiendo la retencin del cristal violeta en los organismos Gram negativos Se forma un complejo: lugol-cristal-violeta-ribonucleato de magnesio
Esta tcnica se basa en las diferencias en el punto isoelctrico

Blastomycesbraziliensis

Aspergillus fumigatus

Candidaalbicans

Pityrosporum folliculitis

Histoplasmafarciminosum

Tincin Ziehl-Neelsen (cido-Alcohol-Resistentes)

Es el procedimiento utilizado para colorear aquellos organismos que son difciles de colorear con colorantes bsicos, porque se muestran impermeables a la coloracin El contenido lipdico de estos organismos esta compuesto principalmente por ceras y fosfolpidos que alcanzan hasta un 40 % de su peso seco total

La cido-alcohol-resistencia es la capacidad de ciertos materiales biolgicos para formar complejos con algunos colorantes y que luego de la exposicin al alcohol-cido no ocurre decoloracin
Se cree que el cido miclico es responsable de cidoalcohol-resistencia Util en algunos microorganismos cido resistentes como N. Asteroides, N. Brasiliensis y otros actinomicetes.

El calentamiento ablanda ceras permitiendo la entrada del colorante

El calentamiento es por emisin de vapores La tcnica de Kinyoun permite la tincin sin la necesidad de calentamiento
Adicin de nigrosina

Rhodococcusequi

Actinomycesisraelii

Tcnica de Schiff
La tincin PAS (periodicacid-Schiff) es uno de los mtodos qumicos ms empleados en histologa.

En la tincin PAS se trata el material con cido perydico, que oxida los 1,2-glicoles formndose grupos aldehdo en los glucanos y mananos de las paredes celulares de los hongos
Con el reactivo de Schiff, los aldehdos reaccionan dando un color rojo luminoso

Los filamentos fngicos, conidias y esporas aparecen rojos o rosas intensos

El cemento de algunos granos en los micetomas adquiere un color amarillo naranja

El citoplasma que es verde en general adquiere un tinte rosa

Permite la deteccin de hongos en muestras de tejido

Mucor sp.

Candidiasis

Aspergillus sp.

Coccidioides immitis

Tincin de Giemsa y Wright

Utilizada para levaduras intracelulares, que generalmente se encuentran dentro de los macrfagos o monocitos Forma un halo alrededor de la pared celular Citoplasma se tie de azul celeste Un polo se tie de azul oscuro (media luna)

Hystoplasmacapsulatum

Pneumocystisjiroveci

Tinciones especiales

Tincin negativa con tinta china

Fundamento: Este mtodo es ideal para observar inclusiones refrctiles que no se tien fcilmente, tales como grnulos de azufre, cido poli-B-hidroxibutirico, esporas o capsulas, debido a que las partculas de carbn empleadas estn cargadas negativamente y son repelidas por la carga negativa de la pared y delimitan una silueta mayor que el tamao real de la bacteria

Esta tincin especial para visualizar a Cryptococcusneoformans La tinta china se emplea en una dilucin de 1:2 con agua destilada (suspensin de coloidal de carbn o nigrosina) La tcnica consiste en colocar una gota del producto biolgico por examinar y una gota de tinta china separados por 3 mm

Tincin con tinta china para observar la cpsula de C. neoformans.

La cpsula aparece como un halo claro y ntido en torno a una levadura redonda, delimitado por las partculas de carbn en suspensin coloidal de la tinta china, exhibiendo un ntido contraste.

Tincin de Esporas
Tincin de ascas y ascoposras de todos los hongos, y especialmente til cuando, se trata de visualizar levaduras en los Hemiascomycetes, ya que con las tinciones habituales es muy difcil distinguir sus formas sexuales. Reactivos Verde de malaquita se tie la espora Safranina se tie la clula vegetativa Las ascas y ascasporas se tien de color verde, en tanto que las levaduras toman coloracin roja

Ascosporas de Daldiniaconcentrica

Tincin de Gomori-Grocott (Metenamina de plata)

Fundamento: Entre las coloraciones especiales para hongos, la plata-metenaminas de Gomori. La reaccin tintorial esta basada en que presencia de acido crmico, los grupos hidroxilo de lo polisacridos de la pared celular de los hongos son oxidados a aldehdos; estos a su vez, reducen el complejo nitrato- plata metenamina produciendo la coloracin caf a negra, debido de la plata reducida en los lugares de localizacin de los aldehdos

Imagen histolgica, tincin con Gomori-Grocott (tincin con plata) mostrando esfrulas en diferentes estados de maduracin.

Tincin de Gomori-Grocott
Con esta tcnica los hongos se tien de color negro al igual que una bacterias; la mucina adquiere un color gris oscuro; las partes internas del micelio, rosa oro; el fondo aparece de color verde claro Reactivos cido crmico.- Oxidacin de grupos hidroxilo de los polisacridos de pared celular Bisulfito de sodio.- Buffer Metamina-nitrato de plata.- Produccin de color caf a negro en la pared Cloruro de oro.- Colorante de contraste en la pared Verde brillante.- Colorante de fondo en la preparacin

Blanco de carcoflour
Fundamento: El calcoflor es un flourocromo que se une a polisacridos con los enlaces beta 1-3 y beta 1-4 presentes en polmeros tales como celulosa y la quitina. El colorante fluorece cuando se expone a una fuente de luz ultravioleta de onda corta o capaz de producir la luz azul (longitud de onda 410-450 nm). Es un mtodo de alta sensibilidad para definir claramente los elementos micoticos con microscopio de fluorescencia Reactivos Calcoflour blanco M2R (polysciences) Azul de Evans

Negro de clorazol E
Fundamento: Es un colorante que permite visualizar rpidamente y ntidamente las estructuras micoticas unindose especialmente a la quitina. Tiene la desventaja de degradarse con la luz, por lo requiere mantenerse en oscuridad. Adems debe prepararse mensualmente. Las preparaciones con la muestra deben leerse al mismo da de la realizacin, ya que el colorante se precipita con el tiempo y al secarse. Clorazol E DMSO KOH al 7%

Helvellalacunosa en L4 C (negro de clorazol)

Procedimientos

Azul algodn-lactofenol (colonias de Hongos)

Poner en un portaobjetos limpio sobre una superficie iluminada y transparente o en su defecto sobre una hoja blanca Poner una gota pequea de azul de algodn lactofenol en el centro del portaobjetos Tomar un fragmento de la colonia mediante una asa Montar la preparacin depositando suavemente un cubreobjetos sobre el portaobjetos Sellar con esmalte incoloro

Tincin con eritrosina

Fijar con alcohol metlico por 10 min Cubrir con eritrosina por 15 min Lavar ligeramente con agua de la llave Hacer pasar rpidamente alcohol al 70 % y se deja secar Pasar por alcohol absoluto durante 5 minutos y dejar secar Poner xilol por 15 min y dejar secar Montar en blsamo de Canad

Tincin con azul algodn actico

Fijar con alcohol metlico, cubriendo el portaobjetos y se deja evaporar Cubrir la preparacin con azul de algodn actico por 20 min, calentando hasta la emisin de vapores Lavar rpidamente con agua Pasar por alcohol al 96 % y secar Pasar por Xilol hasta que transparente la preparacin Montar en blsamo de Canad

Tincin de ZiehlNeelsen para Actinomyces

La preparacin se llena con fucsina fenificada a emisin de vapores por 3 minutos Decolorar con alcohol-cido y se lava con agua Cubrir la preparacin con azul de metileno durante 1 min y se deja escurrir Se deja secar y se observa a 10X y 40X

Tincin ZiehlNeelsen modificada

La preparacin se llena con fucsina fenificada a emisin de vapores por 5 minutos Decolorar con alcohol-cido y se lava con agua Cubrir la preparacin con azul de metileno durante 2 min y se deja escurrir Colocar una gota de nigrosina en el extremo del portaobjetos y se extiende como si fuera un frotis sanguneo en capa fina, se deja secar y se observa a 10X y 40X

Tincin Gram

Tincin de Wright
No es necesario fijar el frotis Coloque el portaobjetos completamente horizontal sobre una superficie adecuada que deje libre la mayora de sus bordes y cbralo con el colorante Despus de 3 min agregue solucin buffer de fosfatos o agua destilada en la misma cantidad que la del colorante, mezcle la solucin, aplique una corriente de aire sobre la mezcla mediante una pipeta Despus de 5 min enjuague con agua de la llave Deje secar y lea al microscopio en seco dbil, seco fuerte y a inmersin

Referencias bibliogrficas.
Guzman Arenas Roberto, Micologa mdica., Editorial McGraw-Hill, 2. Edicin; Mxico, 2004. Capitulo 34 pag 299305 RubenLopezMartinez, Micologa Mdica Procedimiento para el diagnostico de laboratorio, Ed. Trillas, Mxico 2006 Capitulo 10 Pag.149-158 F.J. Baker, Manual de Tcnicas de Micologa Mdica Editorial Acribia, S.A Zaragoza Espaa 1998 pag. 18-20; 4041 Dr. Norman F. Connan; Micologa; Editorial Interamericana S.A de C.V 3ra Edicin Mxico 1972 pag. 557-569 Lynch, M; Raphael, S. Mtodos de Laboratorio. Editorial Interamericana. 2 edicin. Mxico. 1987. Tomo II pag. 523-530 MURRAY, G. Microbiologa Mdica. Edit. El Manual Moderno. 3 edicin Mxico D.F. 1997 pag 175-182