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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA


QUIMICA FARMACÉUTICA BIOLÓGICA
MICROBIOLOGÍA GENERAL II

Mora Velázquez Gabriela Maryel


Rojo García Ana Laura
Salazar Domínguez Dalia Noemí

Asesora responsable: QFB Martha Patricia Orozco Gómez


OBJETIVOS

Ser capaz de realizar


la técnica de
microcultivo a) Preparaciones permanentes para
observaciones posteriores

b) Se consiguen preparaciones de
Entender la eficacia alta calidad en las que se pueden
de un microcultivo observar perfectamente las
estructuras de diferenciación
para identificar y
clasificar un hongo c) Identificación por caracteres
filamentoso morfológicos mediante la
observación de las estructuras de los
hongos (hifas y esporas o conidios)
Identificación de hongos
Morfología colonial
Morfología microscópica
Microcultivo
Pruebas metabólicas (levaduras)
Composición de la pared celular
Nutrición
Reproducción
Morfología microscópica

Hifas

Esporas
asexuadas/
sexuadas

Organización
celular
HONGOS FILAMENTOSOS

• Presentan una estructura vegetativa


“micelio”, formado por una serie de tubos
rígidos ramificados llamados “hifas”.

• Las hifas pueden ser de dos tipos:

a) Vegetativas: que penetran el substrato con


el fin de absorber nutrientes

b) Aéreas o de reproducción: que son las


portadoras de las estructuras reproductoras.

• La clasificación de los hongos se hace


según las características de las hifas, la
formación de esporas asexuales, las
estructuras que contienen éstas y la
capacidad de producir esporas sexuales
Técnicas para la observación
microscópica de hongos

Gota
Disgregación pendiente

Lamina
Microcultivo Cultivo desecada
Montaje

Cinta Emparedado
adhesiva
Montaje en fresco
(disgregación)

Tomar la muestra con una


Transferir la muestra con la
aguja o asa micológica
Gota de lactofenol en dos lanceta al segundo
desde la base y colocando Presionar y observar con
portaobjetos (uno de portaobjetos, distribuir la
con cuidado sobre la gota objetivos 10x y 40x
lavado y muestra). muestra en el mismo y
del portaobjetos de lavado
colocar cubreobjetos.
(elimina conidios).
FUNDAMENTO
El método más rápido para la detección de estructuras fúngicas.
Puede aportar, en ocasiones, un diagnóstico definitivo y en otras, un
diagnóstico de sospecha previo a la confirmación definitiva por cultivo.

Ventajas Desventajas

• Fácil de realizar • Debido a la forma tan


• Rápida directa de tomar la
• Económica muestra, esta sufre algún
traumatismo, en las
estructuras microscópicas
 dificulta el hecho de
identificarlo correctamente
Preparación en cinta adhesiva

Con un pedazo de Pegar la cinta


cinta adhesiva sobre la gota del
Gota de lactofenol Observar a 10x y 40
transparente tomar portaobjetos,
en un portaobjetos x.
una muestra de la eliminar el exceso
colonia de hongos de colorante
FUNDAMENTO
Es útil ya que se conserva las características de agrupamiento de
las esporas de algunos hongos más delicados

Ventajas Desventajas

• Económica • Si la toma de la muestra


• Rápida no se hace
• Fácil de realizar correctamente la
observación no será
• Mantiene la estructura
adecuada.
del hongo
• Permite una
identificación precisa
Técnica de gota pendiente

Limpiar. Círculo
de vaselina en el
cubre

Se inocula una
asada del hongo
en una gota de
azul de lactofenol

Colocar porta
encima del cubre

Invertir la
preparación y
observarla en el
microscopio.
FUNDAMENTO
La gota permite multitud de planos de enfoque lo que facilita la
observación de estructuras y movilidad de microorganismos.
Exenta de las fluctuaciones provocadas por las corrientes líquidas
que se generan entre porta y cubre

Ventajas Desventajas

• Evita que la • No es rápido


preparación se seque. • Limitación del
• Protege a la muestra material a utilizar.
del aire. • Condiciones y
• Visualización de la cuidados de
formación de esporas. preparación.
Microcultivo
Permite la observación de las
estructuras microscópicas de
hongos filamentosos en
particular las esporas asexuales,
que se distinguen con facilidad
sin distorsión, alteración o
rompimiento de las mismas, esto
pasa cuando el hongo se
desarrolla directamente debajo
del cubreobjetos.
Se emplea para:
Identificación taxonómica.

Estudios de ontogenia de los conidios.

Preparaciones permanentes útiles en la


enseñanza.

Como apoyo para identificaciones


diferenciales.

Obtención de material para


microfotografía y micrografía electrónica.
Medios de cultivo
empleados
PDA

Extracto de malta

Agar borelli

Agar Saboraud

Agar Czapek
Desarrollo de la
técnica
1

Colocar un trozo
circular de papel filtro
sobre el fondo de una
caja de Petri estéril.
Colocar un par de
varillas (o triángulo)
de vidrio dentro de la
caja y encima de este
dispositivo colocar un
portaobjetos.
2

En condiciones
estériles, cortar un
cubo (o cilíndro) de
agar PDA o Saboraud
(apróx. 1.5 cm
diámetro) y colocarlo
sobre la superficie del
portaobjetos.
3

Inocular (a partir de
los hongos aislados)
en 4 ejes del borde
del medio de cultivo.
Calentar un cubreobjetos
con suavidad pasándolo
rápidamente por una
flama y colocarlo de
inmediato sobre la
superficie del agar (con
el fin de fundir
parcialmente la
superficie del agar y
obtener un sello
hermético.
Agregar a la caja
Petri suficiente
agua glicerinada
estéril 5% para
saturar el papel
filtro.(con el fin de
humectar la
preparación y
evitar desecación).

Cerrar la caja
Petri e incubar
a temperatura
ambiente (o a
30°C) de 3 a 7
días.
Revisar diariamente el
crecimiento del
hongo. Si se decide
que esta completa la
maduración del
cultivo, agregar de 1 a
3 mL de formaldehído
al 10% o fenol, 30 min.
antes de la
manipulación del
microcultivo.
8

Una vez inactivadas


las esporas, retirar con
cuidado el
cubreobjetos y
colocarlo en un
portaobjetos que tiene
una o dos gotas de
azul de algodón de
lactofenol y observar
en microscopio con
objetivo 10x y 40x
9

Aplicar una o dos


Al portaobjetos se le gotas de azul de
quita el agar y se algodón de
deposita en un vaso lactofenol al
con fenol al 10% portaobjetos y
colocar encima un
cubreobjetos. Se
observa al
microscopio.
• Humectar la
preparación y así
Agua-glicerina evitar la desecación.
• Se usa para la tinción
directa de micelio
Azul de algodón micólico, el cual toma
de lactofenol un delicado color azul
claro
• Inactivación de las
Formaldehído esporas
o fenol al 10%
NOTA
Para Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis y
Sporothrix schenkii no se realiza el microcultivo.
Por el alto riesgo de contaminación por la inhalación o
contacto de las esporas al destapar la caja Petri.
FUNDAMENTO
El hongo se desarrolla directamente debajo del cubreobjetos, lo
que permite observar su estructura intacta, así como su desarrollo ;
esto permite determinar con exactitud género y especie.

Ventajas Desventajas

•Los hongos se observan •No es idónea para un


intactos. diagnostico rápido.
•La mejor técnica para •Más difícil de realizar
observar estructuras de •Más cara
hongos filamentosos.
•Es idónea para identificar
y clasificar un hongo
filamentoso
Técnica del emparedado

Introducir de 4 Retirar un Colocar una gota de


Colocar de 3 cubreobjetos y azul de algodón
a6 Incubar de 7 colocarlo sobre un lactofenol sobre el
a8
cubreobjetos a 15 días a 25 portaobjetos que cubreobjetos ya
fragmentos contiene montado y colocar
en un ángulo °C
de hongos. previamente azul de un cubreobjetos.
de 45° algodón lactofenol Observar a 40x
FUNDAMENTO
Después del crecimiento del hongo se retira el cubre y la gelosa.
De esta manera, los filamentos y órganos de reproducción
quedan unidos al cubre y al porta.

Ventajas Desventajas

• Permite una buena • Es un proceso lento


observación de las
estructuras.
• Económico
• Se puede incubar más de
una muestra.
• Se obtienen dos planos de
enfoque.
Lámina de secada

Fijar con alcohol,


Sobre un Retirar el exceso colorear con
Depositar 5 lactofenol,
portaobjetos Sembrar en el de gelosa
mL de agua deshidratar con
colocar centro e Saboraud y
en una caja secar a 37°C.
alcohol, enjuagar
gelosa incubar con tolueno y
Petri estéril
Saboraud montar con
resina.
FUNDAMENTO
Después del crecimiento del hongo se retira el cubre y la gelosa.
De esta manera, los filamentos y órganos de reproducción
quedan unidos al cubre y al porta.

Ventajas Desventajas

•Permite una •Es un proceso


buena lento
observación de
las estructuras.
•Económico
EXCLUSIVO
POCO
NO APLICABLE: PARA: Hongos
RECOMENDABLE:
Actinomyces filamentosos y
Levaduras
patógenos
Hongos filamentosos
Penicillium spp
Hongos filamentosos, que se encuentran en suelo, vegetación y en aire

Métula

Conidioforo

Fialide
Descripción
Conidias
Conidióforos rectos, hialinos,
con fialides que nacen sobre
métulas. Conidias en cadena,
esféricas, hialinas.
Hongos filamentosos
Aspergillus sp
Hongo filamentoso cosmopolita aislado de la naturaleza comúnmente aislado del
suelo, restos vegetales y el aire ambiental.

Descripción
Conidióforo
Conidióforos
hialinos.
Conidias
Conidias equinuladas a
esféricas.

Hongos filamentosos
Alternaria sp
Hongo filamentoso dematiáceo, aislado de suelos, plantas, comida y aire.

Conidias
Hifas

Descripción
Hifas septadas dematiáceas.
Conidióforos Conidióforos con una apariencia
en zigzag. Conidias cafés con
septos transversales y
Hongos filamentosos longitudinales.
Fusarium sp
Hongo filamentoso aislado de plantas y suelo

Macroconidias

Hifas

Descripción

Microconidias Hifas hialinas septadas y


delgadas, abundantes
macroconidias fusiformes y
septadas, escasas microconidias

Hongos filamentosos elipsoidales.


Hongos patógenos

Trichosporum Piedraia Candida Hortaea Malassezia


cutaneum hortai albicans werneckii globosa
Farmacia industrial
•Control de calidad. Serie de verificaciones para encontrar fallos tanto en materias
primas como en componentes, contenedores, etiquetado y embalajes.
•Desarrollo de antifúngicos.
•Garantizan el uso seguro de los medicamentos.

Bioquímica Clínica
•Diagnostico de hongos patógenos.
•Permite la identificación del agente etiológico
•Son útiles en la selección y monitoreo de la terapia antifúngica, seguimiento
evolutivo y para confirmar la curación.

Farmacia hospitalaria
•Monitoreo de preparaciones parenterales.
•Debido a que son preparaciones estériles, es necesario monitorear la proliferación
microbiológica que afectaría directamente al producto y la salud del paciente.
•Tratamiento de enfermedades causadas por hongos.
Metodología para realizar Microcultivo
Colocar un Colocar 5 mL de
Trozo circular 1 x 0.3
portaobjetos con las glicerina-agua (sin
cm de agar PDA o
pinzas de disección rebasar el triángulo de
Sabouraud
(estériles) varilla de vidrio)

Colocar un triángulo de
varilla de vidrio y
Inocular los cuatro Incubar a T.
portaobjetos con el trozo
costados del agar con ambiente o a 30°C
de agar en base de caja
el hongo elegido de 3 a 7 días.
Petri
Metodología para realizar Microcultivo (continuación)

Al portaobjetos sin
Observar ambas
agar colocar 1-2 gotas
Al cultivo maduro preparaciones a
de azul de algodón y
agregar 1 mL de 10x y 40x
poner cubreobjetos
formaldehido
(media hora antes)

Retirar el Retirar el trozo de


portaobjetos y agar y colocarlo en
agregar 1-2 gotas de vaso con Fenol al
azul de algodón 10%
Reporte de resultados
 Imágenes obtenida en laboratorio y de literatura
 Origen de la muestra
 Tiempo de incubación.
 Morfología de la colonia
• Color
• Textura
• Aspecto
• Consistencia
 Morfología microscópica
• Tipo de hifa
• Tamaño y forma de esporas o conidios
 Presunto hongo aislado
REFERENCIAS
• Koneman E. Diagnóstico microbiológico. 5° ed. Buenos Aires: Médica
panamericana; 2003.
• Prats G. Microbiología Clínica. 1ª ed. Buenos Aires: Médica panamericana;
2006.
• Bonifaz A. Micología Médica Básica. 4ª ed. México: McGrawHill;2010,
• Arenas, R. Micología Medica. 3ª ed. México: Interamericana McGrawHill;
2008.
• López M.R. Micología Médica (Procedimientos para el Diagnostico de
Laboratorio). 3ª ed. México: Editorial Trillas; 2012

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