UNAM

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA II TÉCNICAS DE COLECTA Y TINCIÓN DE PARÁSITOS

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EQUIPO: 3
Barrientos Hernández Fernando García Flores Eduardo Romero Medina Luz Elena

Que el alumno aprenda a colectar material parasitario de animales de experimentación y domésticos. Que el alumno utilice y practique las diferentes técnicas de tinción, utilizadas en parasitología. Que el alumno aprenda a conocer las preparaciones, de diversos parásitos colectados por él.

MÉTODO
A los animales solicitados se les sacrifica en una forma rápida y los menos dolorosa posible, se les toma sangre y se realiza lo siguiente:

Materia fecal: Frasco limpio de boca ancha lejos del calor y el frío.  Muestra de orina: 1ª parte de la micción de preferencia en tubo de ensayo e hisopo.  Muestra sanguínea: Punción o extracción en tubo.

Los embases deben estar completamente limpios y secos antes de usarse.
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IMPORTANCIA DE LA COLECTA
.

Radicará en el mantenimiento del parásito en condiciones apropiadas, en donde se asegure la integridad de este, para el desarrollo de un diagnóstico apropiado.

Conservación:
Puede ser física: Temperatura
Puede ser químicas química : Soluciones

IMPRONTA
Impregnación que se produce al ejercer presión con un portaobjetos sobre el tejido que va a ser examinado.

Se fijan y se tiñen como un frotis sanguíneo.
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I) SANGRE
a) Técnica de gota gruesa

b) Frotis o extensión fina de sangre:

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Fijación:
Los procedimientos químicos son los más utilizados para matar y fijar parásitos.

El objetivo de la fijación es detener los procesos metabólicos.
Los fijadores conservan indefinidamente la muestra.

Schaudinn
Glicerol gelatina

PVA

FIJADORES
Formalina AFA PAF

MIF

Tinción MIF
 Composición
 Útil

ya

para diferentes formas parasitarias  Estas se colorean en verde-amarillo o marrón

antes mencionada, se toman 2 o 3 gotas de MIF más heces, ya antes tratadas y se pone en un porta objetos limpio.

Formalina

Fijador de quistes, protozoarios,huevos, helmintos. Se recomienda calentar la formalina a 60 grados C al usarse para huevos de helmintos (inhibe su desarrollo infectivo)

Formula  Formaldehído  Soloucion salina 0.85% Proporcion de uso  3 partes de formalina por una parte de materia fecal

PVA (Alcohol polivinilico)

Fijador de trofozoitos y quistes (combinación Shaudinn más resina)


   

PVA Etanol 95% HgCl2 Ácido acetico glacial Glicerina Proporción 1:3 (muestra/fijador)

 Tinción: Las tinciones pueden realizarse en dos formas:

Progresivas: son aquellas en las que el material se coloca en colorante diluido, durante el tiempo necesario para lograr la tinción hasta la intensidad deseada. Regresivas: son las tinciones en las que el material o preparaciones se colocan en colorante concentrado hasta lograr una sobre tinción y posteriormente decolorar hasta lograr la intensidad deseada.

TIPOS DE TINCION  SU FORMA DE ACCION

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Para que los productos tomen el color de un colorante, ya sea uno a uno o mezclados adecuadamente a veces es necesario la acción de un mordente; generalmente se utiliza una sal compuesta de aluminio o hierro o bien un ácido, ya sea antes del colorante, o adicionado a la solución de tinción. Para procesos contrastantes es necesario utilizar más.

Montaje:

Los especimenes ya aclarados , se montan con bálsamo de Canadá o resina sintética. Para piezas grandes como proglótidos de cestodos o trematodos como F. Hepática, se requiere un medio de montaje espeso, mientras que para frotes debe estar diluido para posteriormente hacer una buena observación con objetivos de inmersión.

Identificación de parásitos de carácter uni o pluricelular para la realización de un diagnostico confirmativo.

Ectoparásitos
Parásitos de Importancia Médica Ciclo biológico

Endoparásitos Hemoparásitos

Vectores

Enfermedades

MANIPULACIÓN DEL VECTOR
› Mantener la integridad del capturador. › Mantener vivo e integro al vector hasta la

recolección del parásito. › El parásito debe ser recién extraído. › Debe ser representativo a la enfermedad que produce. › Representa la magnitud de la enfermedad en el paciente y en la población.

Fresco Parásito representati vo Fijación
Aseguramiento de la eliminación de la patogenicidad

Colorante de contras te

Unicelulares. Extremar precaución Aun patógeno

Pluricelulares

Aclaración de tejidos y tinción

Tipos de muestra • •
sangre

Cuidados de la muestra Heparina Azida de sodio Recién extraída vivo •Frasco boca ancha limpio y seco ausencia de orina y rotulado
Cerradas( evitar desecación) y refrigeradas 2grados C

Técnicas

Parásitos •Hemoparásitos intra/extra eritrocitarios

•Gota gruesa •Gota fina

• ectoparásito

•Sacrificado •Fraccionado
Varios procesos

•garrapata Parásitos intestinales

Heces fecales

sólidas

•Cps •Flotación •concentración

Huevos y/o quistes nemátodos

líquidas

37 grados C Observación Trofozoitos y recién en fresco quistes obtenidas frascos con fijador •formalina Varios procesos

tejidos

T. solium

•Orina •exudados

Frascos limpios, Observación secos, boca en fresco y/o Trichomonas ancha. Tubo tinción de vaginalis con sol’n exudado salina isotónica

Obtención  Fijación  Conservador  Tinción  Montaje  Observación  Identificación

TINCIONES

Temporales •Lugol •Giemsa •Eosina 5%

Fijas •Hematoxilina •Azul de cresilo Férrica •75% solución •Tinción indica

Supravitales

SHAUDIN
Fijador de quistes, trofozoitos, huevos, larvas Solución de trabajo más muestra ( no se almacena) Proporción 1:3 (muestra/fijador)

Solución concentrada  HgCl2  Agua destilada  Etanol Solución de trabajo  Solución concentrada  Acido acetico glacial

MIF (Merthiolate-yodoformaldehído)
 1) Agua
 Fijador

y conservador de casi todos los elementos parasitarios

destilada Tintura de merthiolate, formaldehído y glicerol  2) Lugol  Porción 14 mL de 1) más 1mL de 2) más 2g de muestra

PAF (Fenol-alcohol-formaldehído)

Preserva quistes y trofozoitos, además de huevos y larvas de helmintos


   

Fórmula Fenol Solución salina Etanol 95% Formaldehído Proporción 1:5 (muestra /fijador)

AFA (Alcohol-formaldehído-ácido acético)

Preservador de trematodos y cestodos


  

Fórmula Etanol 95% Formaldehído Agua destilada Ácido acético glacial

Glicerina-gelatina
 Formulación  Preparaciones

 Gelatina
 Agua

permanentes de nematodos

destilada  Glicerina  Fenol

TINCIONES PARA PROTOZOARIOS
Tinción de negro E de clorazol. Hematoxilina ferrica Heidenhain Tinción tricomica Hematoxilina tungstica de Dobell Hematoxilina molibdica de Dobell Tinción de Hematoxilina y eosina Tinción de Noble Colorante de Mann Tinción para Cryptosporidium ssp e isospora spp Coloración de Giemsa Técnica de tinción para Trichomonas vaginales Coloración para parásitos sanguíneos Tinción Wright Tinción tricromica (modificada por Cerva), para amibas de vida libre.

Hematoxilina: colorante básico para teñir estructuras (núcleos celulares). Existen distintas lacas alumínicas de hematoxilina: Hematoxilina de Harris: Por su estabilidad (se conserva entre 6-12 meses). Es de fácil manejo. Coloración regresiva, se elimina el exceso de colorante con alcohol.

Como agente oxidante se utiliza el óxido de mercurio. Tiñe los núcleos de color azulado. Hematoxilina de Mayer: Es un tipo de coloración progresiva (no requiere lavado posterior). Se usa el yodato de sodio como agente oxidante. Tiñe los núcleos de azul suave. Hematoxilina ácida de Erlich. Hemalumbre de Delafield: Utilizada en técnicas histoquímicas e inmunológicas.

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Tinciones para helmintos
Coloración para platelmintos.  Tinción con alumbre carmín.  Hematoxilina Dalafield.  Tinción de Reynold.  Tinción de carmín acético de Semichon.  Tinción con hemateína de Roudabush.

2) Busqueda y estudio de ectoparácitos.
a) Localice o obtenga los parásitos que se encuentran sobre los animales asignados. b) Sacrifique los ectoparásitos. c) Haga observaciones de diferentes porciones del artrópodo d) Realice diversas preparaciones, ya sea para sangre en solución salina, se utiliza colorantes de contrastes.

3) Obtención de protozoarios y helmintos.
Los pasos a seguir son:
Obtención fijación  conservación  Tinción  Montaje  Observación  Identificación

TRATAMIENTO PARA ANIMALES Y VÍSCERAS
a)

b)

c)

Al animal que se sacrifico se le hace una incisión a lo largo de toda la línea media ventral Una vez abierto el animal se busca en la superficie de los órganos internos y las membranas serosas la presencia de quistes. A continuación se va extrayendo órgano por órgano, estos se colocan en placas con solución salina.

a)

b) c)

Los órganos huecos se abrirán con tijeras y los esponjosos se desmenuzaran en busca de helmintos, el contenido del intestino se observara al microscopio en busca de protozoarios y helmintos A los helmintos encontrados se les quitara el moco y el resto de tejido A los helmintos limpios se les conservara en AFA y se les fijara posteriormente con alguna de las técnicas que se sugieren en anexo de la practica.

BIBLIOGRAFÍA
Manual de biología medica; Facultad de Estudios Superiores Zaragoza; QFB Manual de técnicas para el diagnostico morfológico de las parasitosis; Paz María Salazar S. Irene de Haro A.; Ed. Francisco Méndez Cervantes.

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