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UNIVERSIDAD NACIONAL AUNTONOMA DE MEXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS ZARAGOZA


MICROBIOLOGÍA GENERAL II

Práctica 4
MICROCULTIVO

Equipo 9
Morales Cedillo Italia
Escobar Blanco Luis
Torres Cabrera Blanca Estela
1. El alumno entenderá que el
microcultivo es una técnica eficaz
para identificar y clasificar un hongo
filamentoso.
2. El alumno al término de la práctica
será capaz de realizar la técnica de
microcultivo.
MICROCULTIVO.
• Permite la observación de las estructuras
microscópicas de hongos filamentosos que se
distinguen con facilidad sin distorsión,
alteración o rompimiento de las mismas, esto
pasa cuando el hongo se desarrolla
directamente debajo del cubreobjetos.
• Forma parte de las pruebas para identificar
género y especie.
•Técnica de emparedado

•Técnica de gota pendiente

•Técnica de montaje húmedo

•Técnica de cinta adhesiva

•Técnica de Rivalier
Técnica de emparedado
• Con esta técnica se tienen dos
planos de enfoque.
Método
• a) Sobre una caja de Petri con medio de
cultivo, se deposita de 5 a 8 fragmentos del
hongo por estudiar
• B) Se introducen en el agar de 4 a 6
cubreobjetos estériles de 22 * 22 mm en un
ángulo aproximado de 45 °.
• c) Se cierra la caja y se incuba durante 7 a 15
días a 25°C
• d) Cuando el cultivo ha alcanzado su madurez
se retira un cubreobjetos de la caja y se coloca
sobre un portaobjetos, sobre el cual
previamente se ha depositado una gota de
azul de algodón.
• e) Se deposita una gota de azul de algodón
sobre el cubreobjetos y se cubre con otro
cubreobjetos de 24 * 40 mm.
• f) Se repite el procedimiento con los demás
cubreobjetos contenidos en la caja de cultivo.
Técnica de gota pendiente

Es útil para seguir la evolución


completa de un hongo.

Se emplea para observar la


germinación de las esporas
Método
• 1) Se toma un anillo de vidrio de unos dos centímetros
de diámetro, con bordes bien pulidos, altura de 1 cm
aproximadamente.
• 2) Se flamea el anillo y se toca uno de sus bordes con
luten de R.de Noyer o parafina, haciéndole adherir a un
portaobjeto esterilizado
• 3) Luego se introduce una gota de agua esterilizada en
la cámara así formada. Con fin de conservar la
humedad del cultivo.
• 4) Acto seguido se junta su otro borde con vaselina y se
le pone encima el cubreobjeto, que lleva en su centro
el medio de cultivo con el hongo en suspensión, Se
puede usar en vez de este dispositivo un portaobjeto
excavado.
Técnica de montaje húmedo
• Es un viejo método
rápido para preparar
colonias de hongos para
examen microscópico.
Método
1.- Con un aguja doblada se toma una pequeña
proporción de la colonia a estudiar incluyendo una
pequeña proporción del agar subyacente.
2.- La muestra debe tomarse de un sitio intermedio
entre el centro y la periferia de la colonia.
3.- Este pequeño fragmento de colonia y el agar de
sostén se transfieren a un portaobjetos el cual contiene
una gota de lactofenol azul de anilina y se cubre con un
cubreobjetos.
4.- Se presiona la preparación con la goma de borrar de
un lápiz
La solución de lactofenol azul sirve como tinción y además el
fenol mata la porción de cultivo que se examina. Disminuyendo
las posibilidades de infección en el laboratorio.

METODO VENTAJAS DESVENTAJAS


Montaje Húmedo •Preparación rápida •Dificultad para
y fácil conservar la
•Es suficiente para continuidad entre las
la identificación de esporas, estructuras
muchos hongos. con frutos e hifas
debido al riguroso
tratamiento.
Técnica de cinta adhesiva o Scotch
Método que puede
considerarse como el más
simple, económico y
adecuado para la
identificación de hongos
VENTAJAS DESVENTAJAS

Cinta Scotch Es superior a los Si la cinta no se


montajes por presiona bien
disección porque firmemente sobre la
se conserva la superficie de la
yuxtaposición colonia, la muestra
original de puede no ser la
esporas y adecuada.
segmentos de las
hifas.
Técnica de Rivalier
• Es una técnica de microcultivo que permite
evidenciar de forma clara las estructuras
morfológicas en su arreglo y disposición natural.
• Se realiza para la identificación de cultivos o bien,
para preparar material de enseñanza
Método
• a) Sumergir un portaobjetos estéril en medio
de cultivo a 56°C.
• b) Colocar el portaobjetos sobre un caballete
en una caja de petri
• c) Inocular el centro del portaobjeto con el
hongo a estudiar
• d) Depositar en la caja de Petri 10 ml de agua
destilada estéril, sin mojar el cultivo
• e) Incubar a 25°C en la oscuridad
• f) Cuando el cultivo alcance su madurez, desprender
el exceso de agar y secar en la estufa a 37 °C durante
24 horas
• g) Sumergir la preparación en colodión ligero.
• h) Escurrir el exceso de colodión y dejar secar
durante 24 horas en posición horizontal
• Preparación del colodión
-Colodión oficial (sin aceite de ricino) 1ml
-Alcohol absoluto 2ml
-Éter sulfúrico 2ml
METODOLOGIA DEL MICROCULTIVO.
1. Colocar un trozo circular de papel filtro
sobre el fondo de una caja de Petri estéril.
Colocar un par de varillas de vidrio cortadas
apropiadamente para que entren en la caja
encima del papel filtro, para sostener un
portaobjetos.
2. Colocar un cilindro de agar de dextrosa papa
o agar Sabouraud sobre la superficie del
portaobjetos.
3. Inocular los bordes del cilindro de agar
en tres o cuatro lugares con una pequeña
porción de la colonia a estudiar, mediante un
asa recta o la punta de una aguja de
disección.
4. Calentar un cubreobjeto con suavidad,
pasándolo con rapidez por la llama de un
mechero Bunsen y colocarlo de inmediato
directamente sobre la superficie del cilindro
de agar inoculado.
5. Colocar 5 mL dé glicerina-agua en la base de
la caja Petri, suficiente para saturar el papel.
Tapar la placa e incubar el conjunto a
temperatura ambiente o a 30ºC, durante 3 a
7 días.
6. Diariamente se debe revisar el crecimiento
del hongo, para verificar si ya esta madura la
colonia. Si se decide que esta completa la
maduración del cultivo se le agrega de 1 a 3
mL de formaldehído al 10% o fenol, 30 min.
antes de la manipulación del microcultivo.
7. Una vez inactivadas las esporas, se retira con
sumo cuidado el cubreobjetos y se coloca en
un portaobjetos que tiene una o dos gotas
de azul de algodón de lactofenol. Se observa
a seco débil y a seco fuerte.
8. Al portaobjetos se le quita el agar y se
deposita en un vaso con fenol al 10% al
portaobjetos ya sin agar se le aplica una o
dos gotas de azul de algodón de lactofenol y
se le coloca un cubreobjetos y se observa al
microscopio.
UTILIDAD DE LOS REACTIVOS.
Agua-glicerina. Se utiliza para humectar la
preparación y así evitar la desecación.
Formaldehído o fenol al 10%. Son agentes
fungicidas que desnaturalizan sus proteínas,
ocasionando daño a la membrana celular.
Desventajas.
No es idónea para un diagnostico rápido.
Ventajas.
Permite observar las estructuras de los hongos
filamentosos en forma casi intacta.
Macroconidias y microconidias
TALOSPORAS

Artrosporas
Geotricum candidum.
Aleuriosporas

Trichophyton sp
BLASTOSPORAS
Clamidosporas

Aureobasidium sp. Candida albicans


Hifas y clamidiosporas oscuras
(40x)
• DICTIOSPORAS

Alternaria sp. Presencia de


Ulocladium sp. (40x)
poroconidios o porosporas en
cadenas (40x)
Penicillum sp.
Genero Aspergillus

Aspergillus fumigatus
Aspergillus flavus
Aspergillus niger
Alternaria sp
Curvularia sp.

Curvularia lunata
Mucor sp.
Rhizopus sp.
Rhizopus sp.
Absidia sp.
Fusarium sp.
Genero Trichophyton

Trichophyton mentagrophytes
Genero Trichophyton

Trichopyton rubrum
Epidermophyton

Epidermophyton floccosum
BIBLIOGRAFIA.
• Bonifaz Alejandro, Micología Médica Básica,
Méndez Editores, México, D.F., 1994

• Koneman R., Micología Prácticas de


laboratorio, Editorial Panamericana, Argentina,
1993.
• Arenas, Roberto. Micología Medica.
Interamericana McGraw-Hill. México 1993.

• López Martínez Rubén, Micología Médica


(Procedimientos para el Diagnostico de Laboratorio),
Editorial Trillas, México, 2006

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