Departament de Gentica

TCNICAS DE ANLISIS GENTICO

PROBLEMAS Y PRCTICAS
CURSO 2006-2007

ndice
pgina Programa de la asignatura................................................................. Problemas................................................................................................
3

5 Localizacin en grupos de ligamiento............................................ 6 Mapas por recombinacin.............................................................. 10 Mapeo por deleciones y complementacin.................................... 13 Ligamiento con marcadores moleculares...................................... 22 Mapas de restriccin........................................................................ 28 Identidad gentica, anlisis forense................................................ 34

Problemas resueltos.............................................................................. 37
Localizacin en grupos de ligamiento............................................ Mapas por recombinacin.............................................................. Mapeo por deleciones y complementacin.................................... Ligamiento con marcadores moleculares...................................... Mapas de restriccin........................................................................ Identidad gentica, anlisis forense................................................ 37 41 43 49 54 60

Prcticas de laboratorio....................................................................... 63
1) Localizacin de mutaciones en los grupos de ligamiento de D. melanogaster........................................................................ 2) Elaboracin de mapas cromosmicos mediante recombinacin en D. melanogaster................................................................... 3) Localizacin cromosmica precisa de genes mediante el uso de deficiencias en D. melanogaster............................................. 4) Extraccin de DNA plasmdico y elaboracin de un mapa de restriccin................................................................................. 5) Ligamiento de un fenotipo mutante a un marcador molecular... 65 69 72 75 80

PROGRAMA DE LA ASIGNATURA
TCNICAS DE ANLISIS GENTICO (4.5 CRDITOS)
CURSO 2006-2007 PRIMERA PARTE: Introduccin. qu es y para que sirve el anlisis gentico?. Definicin de anlisis gentico y sus tipos. Importancia de los mutantes en el anlisis gentico. Naturaleza de los datos genticos. Elaboracin de mapas genticos: marcadores genticos clsicos. Localizacin de genes en grupos de ligamiento. Problemas. Practica de laboratorio. Prueba de alelismo. Elaboracin de mapas de ligamiento clsicos. Funcin de mapa. Problemas. Prctica de laboratorio. Mapas fsicos: mapas por delecin y complementacin. Problemas. Prctica de laboratorio. SEGUNDA PARTE: Elaboracin de mapas genticos: marcadores genticos moleculares. Polimorfismos en el DNA. Tipos de marcadores moleculares. Mapas fsicos: mapas de restriccin. Problemas. Prctica de laboratorio. Ligamiento de un fenotipo mutante a un marcador molecular. Problemas. Prctica de laboratorio. Otras aplicaciones de los marcadores genticos moleculares. Asignacin de probabilidades en la determinacin de paternidades y en identificaciones forenses. Problemas.

PROGRAMA DE PRCTICAS
1. Localizacin cromosmica de genes: Localizacin de mutaciones en los grupos de ligamiento de Drosophila melanogaster. 2. Mapa por recombinacin: Elaboracin de mapas cromosmicos mediante recombinacin en Drosophila melanogaster. 3. Localizacin de genes en mapas de deleciones: Localizacin cromosmica precisa de genes mediante el uso de deficiencias en D. melanogaster 4. Mapas de restriccin: Extraccin de DNA plasmdico a pequea escala y elaboracin de un mapa de restriccin. 5. Uso de marcadores moleculares: Ligamiento de un fenotipo mutante a un marcador molecular utilizando la tcnica de RAPD.

OBJETIVOS Conseguir los conocimientos bsicos relativos al anlisis de resultados experimentales y problemas de elaboracin de mapas genticos y localizacin de mutaciones utilizando tanto marcadores genticos clsicos como moleculares.

BIBLIOGRAFIA
Dieffenbach, C. L. and Dveksler, G. S. (1995) PCR primer. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Fincham, J. R. S. (1994) Genetic Analysis. Principles, scope and objectives. Blackwells Science Greenspan R. J. (1997) Fly pushing, The theory and practice of Drosophila genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Griffiths, A.J.F.; Miller J.H.; Suzuki, D.T.; Lewontin, R.C. and Gelbart, W.M. (1993). An introduction to genetic analysis. 5 ed.. W.H. Freeman and Co. (Existe traduccin al castellano. Gentica, ed. Interamericana-McGraw-Hill). Griffiths, A.J.F; Miller J.H.; Suzuki, D.T.; Lewontin, R.C. and Gelbart, W.M. (2002). An introduction to genetic analysis. 7 ed.. W.H. Freeman and Co. (Existe traduccin al castellano. Gentica, ed. McGraw-HillInteramericana). Hawley, R.S. (2003). Advanced genetic analysis: finding meaning in a genome. Klug, W. and Cummings, M.R. (1994). Concepts of Genetics. Macmillan P.C., 4ed. Klug, W. and Cummings, M.R. (1999) Conceptos de Gentica. Prentice Hall, 5ed. Lewin, B. Genes VII. (1999). Oxford and Cell Press. (Existe traduccin al castellano de la edicin anterior Genes IV. Ed.Revert). Nuez, F. Y J.M. Carrillo (eds.).(2000) Los marcadores genticos en la mejora vegetal. Ed. Universidad Politcnica de Valencia. Old, R. W. and Primrose, S. B. (1994) Principles of gene manipulation. 5ed. Blackwell. Pascual, L. i Molt, M.D. (1999) Per, qu s aix de la Gentica? Universitat de Valencia. Watson, J. D., Gilman, M., Witkowski, J. and Zoller, M. (1992) Recombinant DNA. 2 de. W. H. Freeman and Co. Weir, B. S. (1996) Genetic Data Analysis II. Sinauer Assoc.

SISTEMA DE EVALUACIN La asistencia a prcticas es obligatoria e imprescindible para aprobar la asignatura. La nota final constar de dos apartados: (A) La evaluacin del grado de adquisicin de conocimientos de la asignatura se har mediante una prueba nica al final del cuatrimestre. Esta prueba consistir en el planteamiento de problemas y/o cuestiones sobre cualquiera de los aspectos tratados tanto en las clases de problemas como en las de laboratorio. (B) Adems, se valorar el aprovechamiento de las sesiones de laboratorio mediante la calificacin de las memorias presentadas sobre los resultados de cada prctica. El primer apartado valdr el 70% de la nota y el segundo el 30%. Se podr compensar la nota obtenida en cada uno de los apartados anteriores siempre que sea igual o superior a 4 sobre 10 (2,8 sobre 7 en el apartado A y 1,2 sobre 3 en el apartado B). Se guarda, nicamente para la segunda convocatoria del curso, la nota obtenida en cada apartado siempre que este aprobado.

TCNICAS DE ANLISIS GENTICO

PROBLEMAS

LOCALIZACIN EN GRUPOS DE LIGAMIENTO

Localizacin 1.

Se cruzan hembras vrgenes de Drosophila melanogaster, homocigticas para una mutacin recesiva a, con machos nubbin-scarlet (nub-st). La mutacin nub est situada en el cromosoma 2 y la mutacin st en el 3. En la F1 resultante todos los individuos presentaban fenotipo normal y en la F2, se obtuvieron los siguientes resultados:
Fenotipo normal st nub a st-nub st-a nub-a st-nub-a Individuos 61 30 26 22 14 0 27 0

A) Indica en qu grupo de ligamiento se encuentra la mutacin problema a comprobndolo estadsticamente. B) Qu habra ocurrido si el mutante a localizar fuera alelo de uno de los mutantes utilizados como marcador? Localizacin 2. Una forma de definir e identificar un nuevo gen consiste no slo en determinar la funcin en la que interviene, sino tambin localizarlo en una posicin exacta de un cromosoma. As, cuando un investigador se encuentra frente a un fenotipo mutante que desea caracterizar, en primer lugar, debe asignar dicho gen a un grupo de ligamiento concreto. Para ello, en el genoma de D. melanogaster, se deben cruzar hembras homocigticas para la mutacin problema con machos marcadores portadores de dos mutaciones conocidas, una localizada en el cromosoma 2 y otra en el cromosoma 3, siendo ambas mutaciones recesivas. 1. Por qu se realiza este cruce y no el contrario en la generacin parental? 2. Qu ocurrira si el mutante a localizar fuera alelo de uno de los mutantes utilizado como marcador? 3. Si el fenotipo mutante problema fuera alas curvadas podras utilizar una cepa marcadora que tuviera las siguiente mutaciones? ri, radio incompleto, localizada en el cromosoma 3 vg, alas vestigiales, localizada en el cromosoma 2. Localizacin 3. Supongamos una experiencia de localizacin de una mutacin "a" en Drosophila melanogaster. Para la misma utilizamos una cepa marcadora que presenta las mutaciones vestigial (vg, cromosoma II) y scarlet (st, cromosoma III). Al no observar machos mutantes en la F1 se descart la posibilidad de que la mutacin problema se encontrase en el cromosoma X. Se continu la experiencia permitiendo que los individuos de la F1 se cruzasen entre s, obtenindose los resultados de la F2 que se presentan a continuacin:

FENOTIPO Normal scarlet vestigial mutacin a scarlet y vestigial scarlet y mutacin a vestigial y mutacin a scarlet, vestigial, mutacin a

INDIVIDUOS 34 16 10 15 2 0 3 0

Contesta a las siguientes preguntas: a) Indica razonadamente en qu cromosoma se encuentra la mutacin a, y comprubalo estadsticamente. b) Plantea un experimento (haz un esquema razonado de los cruces) para calcular la distancia gentica existente entre la mutacin a y el marcador correspondiente. De ser necesario, indica esquemticamente como se pueden obtener las cepas que utilizas en el mismo. Localizacin 4.- El verano pasado, un estudiante de Gentica encontr un macho de D. melanogaster que presentaba las alas muy cortas. Tras varios cruces obtuvo una cepa pura para esta mutacin, que result ser recesiva, y que denomin short (sh). A continuacin, para asignarla a un grupo de ligamiento (determinar en que cromosoma se encuentra localizada) NO sigui el diseo experimental que le haba recomendado su profesor de T.A.G. y quiso probar otros posibles cruces que te mostramos a continuacin. En primer lugar incorpor esta mutacin a una cepa que ya presentaba las mutaciones recesivas black (b, color oscuro del cuerpo, localizada en el cromosoma II) y pink (p, ojos de color rosado, localizada en el cromosoma III). Seguidamente cruz una hembra homocigtica de la cepa short, black, pink con un macho de tipo salvaje. Todos los machos de la F1 de este cruce presentaron un fenotipo normal, y se retrocruzaron con hembras homocigticas short, black, pink. La F2 result como se muestra en la siguiente tabla, no observndose ningn otro fenotipo: normales hembras machos 63 59 ojos rosados 58 65 cuerpo oscuro alas cortas 55 51 cuerpo oscuro alas cortas ojos rosados 69 60

a) Crees que con este experimento se puede llegar a conocer la localizacin cromosmica del mutante short? Razona la respuesta y en caso de ser afirmativa indica en que grupo de ligamiento se localiza. b) Entusiasmado, el estudiante continu con su experimento haciendo los cruces recprocos, es decir hembras de la F1 con machos homocigticos black, pink, short. Perplejo, observ que el 85% de los descendientes pertenecian a las clases fenotpicas anteriores, pero el 15% se dividian, por igual, en cuatro fenotipos nuevos: individuos de cuerpo oscuro, individuos de alas cortas, individuos de cuerpo oscuro y ojos rosados y, por ltimo, individuos de alas cortas y ojos rosados. Cmo se pueden explicar estos resultados y qu informacin se puede derivar de los mismos?

Localizacin 5. Un alumno aisl dos mutantes de Drosophila que llam red1 y red2 obtenidos de forma independiente mediante el agente mutgeno MSE. Ambas mutaciones producen en homocigosis moscas con ojos de color rojo brillante. El alumno en cuestin estaba decidido a localizar las 2 mutaciones siguiendo con cada una de ellas un protocolo de cruces similar al desarrollado en las prcticas de T.A.G. Para ello dispone de una cepa marcadora que presenta las mutaciones vestigial (vg, localizada en el cromosoma 2 y que produce alas pequeas), y la mutacin ebony (eb, localizada en el cromosoma 3 y que produce cuerpo oscuro). Un compaero le insisti en que era innecesario realizar la experiencia de localizacin para cada una de las dos mutaciones ya que, dado que red1 y red2 producen un fenotipo idntico seguro que se trata de alelos del mismo gen y que por tanto era suficiente con localizar una de ellas. El alumno le hizo caso y decidi localizar slo la mutacin red1. Para ello cruz hembras de ojos rojos brillante (red1) con machos de la cepa marcadora. Todos los indivduos de la F1 tenan fenotipo normal. Decidi obtener la F2, y este fue el resultado: Fenotipos normal vestigial ebony red1 vestigial, ebony vestigial, red1 ebony, red1 vestigial, ebony, red1 N 68 32 20 30 4 0 6 0

a) En qu cromosoma se localiza la mutacin red1? Tienes que razonar dicha asignacin y comprobarla estadsticamente. b) Si queremos estar seguros de la localizacin de las dos mutaciones, habras hecho caso al compaero o habras hecho alguna experiencia adicional para comprobar su afirmacin? En este ltimo caso se pide el mximo detalle, tanto al describir la experiencia como en sus posibles resultados, y qu haras segn fuesen estos. Localizacin 6. Con el fin de determinar el grupo de ligamiento de una mutacin autosmica recesiva de Drosophila melanogaster que produce color de ojos naranja, se selecciona una cepa marcadora portadora de dos mutaciones conocidas, una localizada en el cromosoma II (venas incompletas, ve) y otra localizada en el cromosoma III ( quetas afeitadas,sv) siendo ambas mutaciones recesivas. Slo disponemos de un macho mutante para el fenotipo ojos de color naranja y lo cruzamos con hembras doble mutantes ve y sv, obtenindose en la F1 individuos de fenotipo normal. Se continua la experiencia cruzando los individuos de la F1 entre s, obtenindose una F2 con los siguientes resultados fenotpicos:

Fenotipo
Normal Quetas afeitadas Venas incompletas Ojos naranjas Venas incompletas y quetas afeitadas Ojos naranjas y venas incompletas

n de individuos 139 50 35 71 17 16

1. Crees que la cepa marcadora seleccionada y el cruce parental realizado son vlidos para determinar la localizacin de esta mutacin en Drosophila? Razona la respuesta. 2. En caso afirmativo, determina en qu cromosoma se localiza la mutacin ojos naranja comprobndolo estadsticamente. 3. Qu experimentos disearas para determinar si la mutacin ojos naranja es allica de otras mutaciones que afectan al color de ojos ya caracterizadas en Drosophila? Valores de 2 4 g.l. 9.49 1 g.l. 3.84 2 g.l. 5.99 3 g.l. 7.82 5 g.l. 11.07 6 g.l. 12.59 7 g.l. 14.07

Localizacin 7. Supongamos una experiencia de localizacin de una mutacin a en un dptero que presenta cinco pares de autosomas y un par de cromosomas sexuales XY. En esta especie tiene lugar el fenmeno de recombinacin en los dos sexos. En consecuencia, y aunque podemos desarrollar un esquema de cruzamientos similar al utilizado en Drosophila, tendremos que considerar esta caracterstica a la hora de analizar los resultados. As pues, escogemos cinco cepas que presentan, cada una, una mutacin marcadora de un cromosoma determinado: m1, m2, m3, m4 y m5. Estas mutaciones marcadoras son fenotpicamente recesivas y no epistticas respecto a nuestra mutacin problema a. Seguidamente cruzamos hembras de la cepa a con machos de las cepas m1, m2, m3, m4 y m5 (cinco cruces independientes). Obtenemos una F1 fenotpicamente normal para ambos sexos en todos los casos y dejamos que estos individuos se crucen entre ellos para obtener las cinco F2 correspondientes. Los resultados son los siguientes: Numero de individuos de la F2 obtenidos al cruzar las cepas: fenotipos

a x m1
181 58 62 19

a x m2
102 50 46 2

a x m3
89 30 33 8

a x m4
136 43 47 14

a x m5
223 76 72 29

a+ mx+ a+ mx a mx + a mx

a) Indica RAZONADAMENTE en que cromosoma puede localizarse la mutacin a. Comprueba mediante una Ji-cuadrado la validez estadstica de tu hiptesis. b) A partir del nmero de dobles mutantes obtenidos, podras calcular la distancia entre la mutacin a y la marcadora? Razona la respuesta. c) Supn que dispones de un segundo marcador del cromosoma donde has localizado la mutacin a y que ste se encuentra situado a 10 cM del marcador utilizado en la localizacin. Puedes indicar con exactitud la distancia que habr entre este segundo marcador y la mutacin a? Razona la respuesta.
Valores de 2 4 g.l. 9.49 1 g.l. 3.84 2 g.l. 5.99 3 g.l. 7.82

5 g.l. 11.07 6 g.l. 12.59 7 g.l. 14.07

MAPA POR RECOMBINACIN

Mapa Rec.1. Una hembra virgen salvaje de D. melanogaster se cruz con un macho homozigoto recesivo (a m1 m2). Las hembras vrgenes de la F1, se cruzaron con machos triple homozigotos recesivos obtenindose las siguientes proporciones en su descendencia: Fenotipo normal m1 m2 a m1 a m2 a m1 m2 m1 m2 a Total n Individuos 100 28 5 21 4 27 20 95 300

a) Indicar las posiciones relativas de estos tres loci, as como las distancias entre ellos.

b) Si la posicin del locus a en el cromosoma es 30, indica la posicin de los otros dos loci utilizando la funcin de mapa. Mapa Rec. 2. A partir de los siguientes resultados de un cruzamiento prueba para tres genes ligados, determina el orden de los genes sin calcular distancias. FENOTIPO +++ ++c +b+ +bc a++ a+c ab+ abc 1 317 58 10 2 0 21 72 203 2 1 4 31 77 77 31 4 1 3 30 6 339 137 142 291 3 34 4 40 232 84 201 194 77 235 46 5 305 0 28 107 124 30 1 265

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Mapa Rec. 3. Se dispone de una coleccin de mutantes recesivos de D. melanogaster no necesariamente localizados en un mismo cromosoma. Con el fin de mapearlos se sintetizan varias cepas triples mutantes y se procede de la forma habitual: se cruzan hembras triples mutantes con machos normales y las hembras de la F1 se cruzan con machos mutantes. Los resultados de los distintos cruces prueba fueron los siguientes: A. fenotipos ABC abc Abc aBC ABc abC AbC aBc Total n de individuos 280 270 92 88 130 120 10 10 1000 B. fenotipos n de individuos CDE 173 cde 181 Cde 65 cDE 70 CDe 68 cdE 67 CdE 194 cDe 182 Total 1000

a) Determina qu genes estn ligados, estima sus distancias genticas y ordena las distintas mutaciones en el cromosoma. b) Al intentar situar las mutaciones presentes en el mismo grupo de ligamiento aparecieron dos posibilidades. Cules son esas dos posibilidades?. c) Al comparar los mutantes b y e, se observa que ambos presentan una coloracin de ojos oscuros. Cuando se cruz una hembra mutante b con un macho mutante e toda la descendencia present color de ojos oscuros. qu podras concluir a partir de este resultado? d) Representa el mapa con las 4 mutaciones tras aplicar la funcin de mapa a las distancias calculadas. Mapa. Rec. 4. La forma tradicional de detectar un gen ha sido por la aparicin de un fenotipo mutante diferente del normal o tipo salvaje. Basndonos en la diferencia fenotpica entre las dos cepas se puede conseguir determinar la localizacin cromosmica del gen y, si existe un mapa preexistente, se puede incorporar a ste el nuevo gen. El problema se plantea en Drosophila con la aparicin de un nuevo mutante:
1. Se ha aislado una mutacin que afecta a las quetas y produce ausencia de macroquetas. Se

le asigna el nombre de abs. 2. El gen es recesivo. er 3. Se localiza en el 3 cromosoma. er 4. Se dispone de dos cepas dobles mutantes con genes del 3 cromosoma de localizacin conocida

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Las cepas son se ri/se ri (26.0 y 47.0) y ry e/ry e (52.0 y 70.7) ojos negros venacin L2 del ala incompleta ojos granate cuerpo negro ry 52.0 e 70.7

se ri ry e se

sepia radius incompletus rosy ebony ri 47

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datos de los cruces: abs se ri abs + + + se ri abs se ri + + + abs + ri + se + abs se + + + ri TOTAL 76 75 8 7 15 16 2 1 200 abs ry e abs + + + ry e abs ry e + + + abs + e + ry + abs ry + + + e TOTAL 63 63 22 21 11 12 4 4 200

a) Incluye el gen abs en el mapa. Hazlo de dos formas: por el mtodo de 3 puntos y considerando slo parejas de genes. Aplica la funcin de mapa a la determinacin de la posicin del locus abs, b) Haz un esquema de cmo se obtendra la cepa necesaria para realizar el cruce prueba.

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MAPEO POR DELECIN Y COMPLEMENTACION

Del. y Comp. 1. En el nemtodo C. elegans se usaron rayos X para generar una serie de mutantes, todos ellos recesivos. Cinco de ellos presentaron un fenotipo caracterizado por tener el cuerpo corto. Se los llam mutantes corto1 a corto5 Al cruzar individuos con estas distintas mutaciones contra cepas que presentaban deficiencias, se encontr que, para todas estas mutaciones, los individuos corto/Df(8-15) presentaban tambin fenotipo corto. Df(8-15) es una deficiencia que cubre una amplia zona que incluye desde la regin 8 hasta la regin 15 del cromosoma 2 de C. elegans. Para profundizar en el estudio de estos mutantes, se llevaron a cabo cruzamientos de todos ellos entre s y con una serie de deficiencias de la misma regin con los siguientes resultados de complementacin:
corto1 corto2 corto3 corto4 corto5 corto1 corto2 corto3 corto4 0 + + 0 + 0 + + + + 0 + 0 + + 0 + + + + corto5 + + + + 0 Df(9-12) + 0 + + + Df(11-13) Df(14-15) + 0 0 + 0 + + 0 + 0 Df(8-10) + + + + +

Donde + indica que hay complementacin y 0 que no complementan. Como antes, Df(x-y) indica que las deficiencias van desde la regin x a la regin y, ambas inclusive. Responde a las siguientes preguntas: a) Cuntos grupos de complementacin se deducen de estos datos? b) Localiza con la mayor precisin posible cada uno de los mutantes c) Indica los fenotipos que esperas en individuos como stos: corto1/Df(11-15) corto2/Df(10-12) corto2/Df(9-11) Df(8-15)/Df(8-10) Df(8-10)/Df(11-13)

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Del y Comp. 2. Se obtuvieron cinco mutantes (llamados a-e de la regin 24 del cromosoma 2 de D. melanogaster, que pueden o no afectar al mismo gen. A partir de la informacin de los cruzamientos siguientes: a) Esquematiza en una tabla la complementacin o no de los distintos mutantes y/o deficiencias. b) Indica cuntos grupos de complementacin existen y porqu. c) Determina la localizacin cromosmica de cada uno de estos mutantes. d) Propn una explicacin para los resultados obtenidos para la cepa que contiene el mutante D. CRUCE a/CyO x a/CyO a/CyO x b/CyO a/CyO x c/CyO a/CyO x d/CyO a/CyO x e/CyO b/CyO x b/CyO b/CyO x c/CyO b/CyO x d/CyO b/CyO x e/CyO c/CyO x c/CyO c/CyO x d/CyO c/CyO x e/CyO d/CyO x d/CyO d/CyO x e/CyO e/CyO x e/CyO FENOTIPOS F1 100% alas curvadas 35% salvaje: 65% alas curvadas 100% alas curvadas 17% patas malformadas : 83% alas curvadas 34% salvaje: 66% alas curvadas 100% alas curvadas 33% salvaje : 67% alas curvadas 35% salvaje: 65% alas curvadas 34% salvaje: 66% alas curvadas 100% alas curvadas 20% patas malformadas: 80% alas curvadas 36% salvaje: 64% alas curvadas 33% patas malformadas: 67% alas curvadas 33% salvaje: 67% alas curvadas 100% alas curvadas CRUCE a/CyO x Df(2)1/CyO a/CyO x Df(2)2/CyO a/CyO x Df(2)3/CyO b/CyO x Df(2)1/CyO b/CyO x Df(2)2/CyO b/CyO x Df(2)3/CyO c/CyO x Df(2)1/CyO c/CyO x Df(2)2/CyO c/CyO x Df(2)3/CyO d/CyO x Df(2)1/CyO d/CyO x Df(2)2/CyO d/CyO x Df(2)3/CyO e/CyO x Df(2)1/CyO e/CyO x Df(2)2/CyO e/CyO x Df(2)3/CyO FENOTIPOS F1 100% alas curvadas 100% alas curvadas 32% salvaje: 68% alas curvadas 100% alas curvadas 100% alas curvadas 34% salvaje: 66% alas curvadas 100% alas curvadas 100% alas curvadas 35% salvaje: 65% alas curvadas 15% patas malformadas: 85% alas curvadas 17% patas malformadas: 83% alas curvadas 34% salvaje: 66% alas curvadas 36% salvaje: 64% alas curvadas 32% salvaje: 68% alas curvadas 100% alas curvadas

Las regiones que abarcan las deficiencias son las siguientes: Df(2)1: 24A-24C Df(2)2: 24A-24D Df(2)3: 24B-24E Recordad que CyO es un cromosoma equilibrador que presenta la mutacin Curly (Cy) que causa un fenotipo dominante de alas curvadas.

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Del. y Comp. 3. Se realiz un anlisis citogentico de la regin 37 del 2 cromosoma de D. melanogaster. Se dispona de 10 mutaciones letales distintas y de 5 cepas portadoras de las siguientes deficiencias cromosmicas: Deficiencia Rotura izquierda Rotura derecha A 37C1-C3 37C7-C8 B 37D1-D3 37E2-E3 C 37C1-C3 37D1-D8 D 37D7-E3 37E9 E 37C1-C3 37D1-D8 Las regiones 37C,D y E contienen 9 divisiones cada una. Se cruzaron las 10 cepas portadoras de la mutacin letal recesiva (equilibrada con su correspondiente cromosoma equilibrador) por cada una de las cinco deleciones con los siguientes resultados: Deficiencias Mutaciones letales recesivas 1 2 3 4 5 6 7 8 A 0 + + + + + + 0 B + + 0 + 0 0 0 + C 0 0 0 + + + + + D + + + 0 0 + + + E 0 0 0 + + + 0 + Donde + significa complementacin y 0 significa no complementacin. 9 0 + 0 + + 10 + + 0 + 0

Haz un mapa citogentico que incluya la localizacin de todas las mutaciones letales y las deficiencias o deleciones cromosmicas. Del. y Comp. 4. Una serie de 5 mutantes recesivos autosmicos han sido encontrados en una poblacin de la cucaracha comn. En lugar del cuerpo normal (negro), cuatro de los mutantes presentan en homocigosis color de cuerpo blanco y se los llam "blanco 1" a "blanco4". El ltimo, que en homocigosis presenta color de cuerpo amarillo, recibi el nombre de "limn". Al cruzar individuos con estas mutaciones con cepas que presentaban deficiencias, se encontr que los individuos blanco/Df(8-15), para cualesquiera de las mutaciones "blanco", presentaba tambin color de cuerpo blanco. Los individuos limn/Df(8-15) tenan color de cuerpo amarillo. Df(8-15) es una deficiencia que cubre una pequea zona que incluye desde la regin 8 hasta la regin 15 del cromosoma 7 de la cucaracha. Para profundizar en el estudio de estos mutantes, se llevaron a cabo cruzamientos de todas las cepas mutantes entre s y con una serie de cepas homozigotas par deficiencias del mismo cromosoma 7, con los siguientes resultados para el color del cuerpo: blanco1 blanco2 blanco3 blanco4 limn blanco1 blanco normal normal normal amarillo blanco2 normal blanco normal blanco normal blanco3 normal normal blanco normal normal blanco4 normal blanco normal blanco normal limn amarillo normal normal normal amarillo Df(7-12) blanco normal blanco normal amarillo Df(9-14) blanco normal normal normal amarillo Df(10-13) blanco normal normal normal amarillo Df(14-16) normal blanco normal blanco normal

Como antes Df(x-y) indica que las deficiencias van desde la regin x a la regin y, ambas inclusive.

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Responde a las siguientes preguntas: a) Un investigador asegura que estos resultados demuestran que hay tres grupos de complementacin, mientras que otro opina que hay cuatro y un tercero que hay cinco. Quin tiene razn y porqu? b) Localiza con la mayor precisin posible cada uno de los mutantes morfolgicos obtenidos. c) Hemos encontrado otro mutante que en homocigosis produce cuerpo blanco ("blanco5"). Al obtener individuos blanco5/Df(7-16), vemos que son todos de cuerpo normal. Indica con qu cepas de las presentes en la tabla realizaras cruzamientos con el fin de caracterizar mejor este nuevo mutante. d) Acaba de aparecer publicado un trabajo en donde se describe el mutante "white" de la cucaracha. Los autores han demostrado que esa mutacin produce en homocigosis insectos de cuerpo blanco, y la han localizado en la regin 15 del cromosoma 7. Indica qu experimentos haras para saber si la mutacin "white" y alguna (o algunas) de las mutaciones anteriores afectan al mismo gen.

Del. y comp. 5. Se han caracterizado, en un arcnido, mutantes autosmicos recesivos que producen individuos con ojos de coloracin amarilla en homozigosis que se han llamado a1a5. Se realizan cruzamientos entre cepas que contienen estos mutantes y de dichas cepas con otras cepas que contienen deficiencias para el cromosoma en donde se hallan las mutaciones y se obtienen los resultados de complementacin presentados en la tabla siguiente: a1 amarillo amarillo salvaje salvaje amarillo a2 amarillo amarillo salvaje salvaje amarillo a3 salvaje salvaje amarillo salvaje amarillo a4 salvaje salvaje salvaje amarillo salvaje a5 amarillo amarillo amarillo salvaje letal
Df(1-11) Df(9-11) Df(1-6) Df(1-4)

a1 a2 a3 a4 a5

amarillo amarillo amarillo amarillo letal

salvaje salvaje salvaje amarillo salvaje

amarillo amarillo salvaje salvaje letal

salvaje salvaje salvaje salvaje salvaje

Se indica el fenotipo de los individuos que combinan ambas mutaciones o bien una mutacin y una deficiencia. Amarillo significa ojos amarillos. Df(x-y) significa que la deficiencia incluye las regiones desde x hasta y. Estas regiones son muy grandes y cada una contiene centenares de genes. Con estos datos, debes contestar a las preguntas siguientes: a) b) c) d) Cuntos grupos de complementacin existen y porqu? Cmo explicas los resultados para el mutante a5? Dnde se localizan los mutantes? Explica el resultado que esperas si cruzas el mutante a5 con una cepa Df(5-7).

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Del y Comp. 6. En una poblacin de laboratorio de D. melanogaster ha aparecido un mutante fenotpicamente de ojos oscuros al que denominaremos obs. En primer lugar deseamos conocer su grupo de ligamiento y para ello lo cruzamos con una cepa doble mutante nub2 (alas cortas, cr. II) ss (quetas cortas, cr. III). El fenotipo de la F1 es completamente normal mientras que el anlisis fenotpico de la F2 da la siguiente segregacin: nub2 + + + + ss + + + + individuos obs + 126 18 + 58 0 61 + 37 + 20 0 TOTAL 320

a) En que cromosoma se encuentra localizado el gen responsable del fenotipo ojos oscuros? Justifica estadsticament la respuesta. Una vez asignado este gen al cromosoma correspondiente, se procedi a realizar una prueba de alelismo con cuatro mutantes ya conocidos y de fenotipo parecido (mutante 1, 2, 3 y 4), evidentemente localizados en ese cromosoma. El resultado de la prueba fue el siguiente: cruce hembras obs x machos mutacin 1 hembras obs x machos mutacin 2 hembras obs x machos mutacin 3 hembras obs x machos mutacin 4 progenie toda normal toda normal toda ojos oscuros toda ojos marrones

b.1.) De qu mutaciones crees que es alelo el mutante obs? Razona la respuesta. b.2.) Completa la siguiente tabla y razona la respuesta (+ complementa, 0 no complementa) mutante 1 mutante 1 mutante 2 mutante 3 mutante 4 xxxxxxx xxxxxxx xxxxxxx mutante 2 mutante 3 mutante 4

xxxxxxx xxxxxxxx

xxxxxxxx

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Del. y Comp. 7. La irradiacin con rayos X produce diferentes tipos de mutaciones: mutaciones puntuales, inserciones, prdidas de fragmentos cromosmicos, etc...Utilizando rayos X se obtuvieron una serie de mutantes de una especie de mosquito. Cuatro de estos mutantes producan un fenotipo de color de ojos anaranjado. Las otras dos mutaciones en homocigosis eran letales. En la siguiente tabla se muestra el resultado de varias pruebas de complementacin entre los mutantes y entre estos y diferentes cepas portadoras de deficiencias en el cromosoma que contiene las mutaciones. Notas: (-): no complementan; (+): s complementan. Df (x-y) indica que la deficiencia va desde la regin x a la y, ambas inclusive. m1 m1 m2 m3 m4 m5 m6 m2 m3 m4 m5 m6 Df (1-3) Df (2-5) Df (4-7) Def (6-9) Def (1-10)

+ + + -

+ + + + -

+ + + + -

+ + + -

+ + + +
letal

+
letal

+ + -

+ + + + -

+ + + + -

+ + + + + +

a) Cuantos grupos de complementacin existen y qu mutantes pertenecen a cada uno de ellos? b) Donde se localizan los mutantes? c) Cmo explicas los resultados para el mutante m6? d) Plantea cmo sera un cruce y el resultado entre el mutante m6 y la deficiencia Df (13);y entre el mutante m6 y la deficiencia Df (6-9)? (has de representar los dos cromosomas, y el fenotipo de todos los indivduos. Puedes utilizar si lo necesitas un cromosoma equilibrador con la mutacin dominante C que produce alas curvadas) Del. y Comp. 8. Se dispone de ocho mutaciones autosmicas, letales en homozigosis, (m1 a m8), obtenidas experimentalmente y que previamente han sido situadas en una regin restringida del segundo cromosoma del alacrn cebollero. Para elaborar un mapa ms preciso de la mismas se recurre al cruzamiento, independiente, de cada cepa mutante con siete cepas portadoras, cada una, de una delecin equilibrada que abarca la parte de la regin cromosmica que se indica a continuacin: delecin A delecin B delecin C delecin D subregiones 7 a 12 subregiones 2 y 3 subregiones 11 y 12 subregiones 1 a 7 delecin E delecin F delecin G subregiones 9 a 11 subregiones 3 a 5 subregiones 6 a 9

El resultado de los citados cruzamientos aparece en la tabla 1, donde el signo + indica fenotipo normal en el heterozigoto correspondiente y el 0 la no aparicin del individuo correspondiente debido al efecto letal de las mutaciones analizadas.

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del. A + m1 0 m2 + m3 + m4 + m5 0 m6 + m7 + m8

del. B + + 0 + + + + +

TABLA 1 del. C del. D + 0 + + + 0 + 0 + 0 0 + + 0 + 0

del. E del. F del. G + 0 + 0 + 0 + + + + 0 0 + + 0 0 + + + 0 + + + 0

Paralelamente se llevaron a cabo pruebas de complementacin entre las ocho cepas mutantes siendo el resultado de las mismas el que se indica en la tabla 2 (+: complementan, -: no complementan). m1 m1 m2 m3 m4 m5 m6 m7 m8 m2 m3 m4 m5 m6 m7 m8

+ -

+ + -

+ + -

+ + + -

+ + + + + -

+ + + + -

+ + + + + -

En funcin de los datos obtenidos: a) Dibuja el mapa de deleciones correspondiente b) Sita en el mismo las mutaciones problema (m1 a m8) c) Cuantos grupos de complementacin hay? Razona la respuesta e indica los alelos que componen cada grupo. Cmo explicas los resultados obtenidos con la cepa mutante m4? d) Supn que un compaero te informa que ha localizado otras dos nuevas mutaciones en esta regin situadas en concreto: la mutacin mx en la subregin 1 y la mutacin my en la subregin 10. Qu resultado obtendras si cruzases estos mutantes con las cepas portadoras de las 7 deleciones equilibradas? Razona la respuesta.

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Del. y Comp. 9. Anlisis citogentico de la regin cromosmica 25E-26A del segundo cromosoma de D. melanogaster Nota: Este problema fue realizado en el ao 1983 por Michael A. Kotarski, Sally Pickert y Ross MacIntyre (A cytogenetic analysis of the chromosomal region surrounding the -glycerolphosphate dehydrogenase locus of Drosophila melanogaster. Genetics 105, 371386). El problema se har ms simplificado del que aparece en el artculo y se han corregido algunos pequeos errores que aparecan en el trabajo. El anlisis citogentico se realizar nicamente con las deleciones cromosmicas: Elaborar un mapa citogentico que incluya las 7 deleciones cromosmicas y los 19 genes que se detallan a continuacin: DELECIONES CROMOSMICAS Se dispone de cepas que llevan en un cromosoma una delecin cromosmica y en el otro un cromosoma equilibrador (Balancer en ingls). Cada cromosoma mutante ha sido analizado al microscopio determinndose la longitud y situacin del fragmento de cromosoma que le falta. Esto se ha hecho sobre los cromosomas politnicos de las glndulas salivales y por tanto, se utiliza la numeracin habitual de stos Punto de rotura Punto de rotura izquierdo derecho Df(2L) clot-1 25D7-E1 25E6-F3 Df(2L) clot-2 25D7-E1 25E2-3 Df(2L) clot-7 25D7-E1 26A7-8 Df(2L) GdhA 25D7-E1 26A8-9 Df(2L) 50075A 25F2-3 25F4-26A1 Df(2L) 50078A 25F2-3 25F4-26A1 Df(2L) 2802 25F2-3 25F4-26A1 Las deficiencias estaban equilibradas con algn cromosoma equilibrador del segundo cromosoma. Por ejemplo: CyO In(2LR)O Cy dplvI pr cn2 SM1 In(2LR) SM1, al2 Cy dplvI pr Bl cn 2 L4 SM5 In(2LR)SM5, al2 Cy ltv cn 2sp2 LOCI GNICOS Mutaciones morfolgicas o visibles: 2 tkv: thick vein cl: clot mutacin recesiva que produce un ojo de color mucho ms oscuro del normal con un bloqueo parcial en la sntesis de pigmentos rojos. Mutaciones letales: 16 Utilizando el mutgeno qumico etilmetanosulfonato se indujeron un gran nmero de mutaciones letales en la regin analizada, tras realizar las pruebas de complementacin pertinentes se identificaron 17 grupos de complementacin. El nmero 13 no ser utilizado en este estudio ya que queda fuera de la zona analizada. Los genes identificados se han denominado: l(2)gdh-1, l(2)gdh-2, l(2)gdh-3, l(2)gdh-4, l(2)gdh-5, l(2)gdh-6, l(2)gdh-7, l(2)gdh8, l(2)gdh-9, l(2)gdh-10, l(2)gdh-11, l(2)gdh-12, , l(2)gdh-14, l(2)gdh-15, l(2)gdh16, l(2)gdh-17 Deficiencia

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Dado que todas las mutaciones son letales en homocigosis se mantienen utilizando un cromosoma equilibrador similar al descrito anteriormente para las deficiencias. Variantes electroforticas: 1 -Gpdh: El locus -Gpdh codifica la enzima alfa-glicerofosfato deshidrogenasa, la cual es un enzima muy abundante en el insecto en algunos momentos del desarrollo. Por ejemplo en adultos recin nacidos aproximadamente constituye el 2% del total de protenas. Todas las cepas que contenan el gen codificaban para el alelo -GpdhA que codifica para un alozima de movilidad electrofortica rpida. Se dispone de una cepa homocigota para el alelo -GpdhB que codifica para un alozima de movilidad lenta. Esta cepa fue cruzada por todas las cepas portadoras de deficiencias. Mapa de la regin 25E-26A de D. melanogaster Elabora un mapa citogentico con la siguiente tabla de resultados y la informacin sobre la localizacin de las deleciones suministrada en la memoria de la prctica:
cl l(2)gdh-1 l(2)gdh-7 l(2)gdh-8 l(2)gdh-9 tkv l(2)gdh-10 l(2)gdh-11 l(2)gdh-12 Df(2L) clot-1 Df(2L) clot-2 Df(2L) clot-7 Df(2L) GdhA Df(2L) 50075A Df(2L) 50078A Df(2L) 2802 0 +

l(2)gdh-14 l(2)gdh- 2 l(2)gdh-17 l(2)gdh- 4 l(2)gdh- 5 l(2)gdh- 6

l(2)gdh-15

l(2)gdh-16 l(2)gdh- 3

-Gpdh

0 0 0 0 + + +

0 0 + + + + +

+ + 0 0 + + 0

+ + + 0 + + +

+ + 0 0 0 + 0

+ + 0 0 0 0 0

+ + 0 0 0 0 +

+ + 0 0 + + +

Indica no complementacin (El defecto del mutante no es cubierto o remediado por la eficiencia) Indica complementacin (El defecto del mutante es cubierto o remediado por la deficiencia)

Con objeto de determinar completamente la posicin relativa de las diferentes deleciones, se llevaron a cabo los siguientes cruces: Df (2L)cl1 / CyO x Df (2L) 50075A / CyO 30 alas normales y 60 alas curvadas Df (2L)cl1 / CyO x Df (2L) 50078A / CyO 30 alas normales y 60 alas curvadas Df (2L)cl1 / CyO x Df (2L) 2802 / CyO 60 alas curvadas

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LIGAMIENTO DE UN FENOTIPO A UN MARCADOR MOLECULAR

Lig. M. Mol.1. Se encontr un mutante de Drosophila virilis, aba, que produca un fenotipo anormal caracterizado por una malformacin en la parte proximal del abdomen. Para mapear la localizacin cromosmica de esta mutacin se emplearon como marcadores dos bandas de 2.0 Kb y 0.6 Kb que se producan en la reaccin de PCR tras amplificar con un determinado cebador. Se cruzaron individuos que eran homocigotos para aba y para los dos marcadores moleculares con individuos OrR que no presentaban ninguno de stos. En la F1 todos los individuos tenan abdomen normal y presentaban ambos marcadores. Se realiz un cruzamiento prueba entre hembras de la F1 y machos triple homocigoto recesivos y se obtuvo la siguiente segregacin: Fenotipo Abdomen anormal y bandas de 2.0 y 0.6 Kb: Normales sin bandas: Normales con la banda de 2.0 Kb: Abdomen anormal y banda de 0.6 Kb: Normales con bandas de 2.0 y 0.6 Kb: Abdomen anormal y sin bandas: Abdomen anormal y con la banda de 2.0 Kb: Normales y con la banda de 0.6 Kb: N individuos 235 241 243 233 12 14 14 16

Determina si los marcadores estn ligados al locus aba y en su caso calcula la frecuencia de recombinacin Lig. M. Mol. 2. Se encontr un mutante de Musca domestica, ndt, que produca un fenotipo anormal caracterizado por una malformacin en la genitalia. Para mapear la localizacin cromosmica de esta mutacin se emplearon como marcadores dos bandas de 3.1 Kb y 1.0 kb que se producan en la reaccin de PCR tras amplificar con un determinado cebador. Se cruzaron individuos que eran homocigotos para ndt y para uno de los dos marcadores (3.1 kb) con individuos de genitalia normal que presentaban el otro marcador (1.0 kb). En la F1 todos los individuos tenan genitalia normal y presentaban ambos marcadores. Se realiz un cruzamiento prueba entre hembras de la F1 y machos triple homocigotos recesivos y se obtuvo la siguiente segregacin: Fenotipo genitalia anormal anormal anormal anormal normal normal normal normal Fenotipo bandas 3.1 kb y 1.0 kb 3.1 1.0 sin bandas 3.1 kb y 1.0 kb 3.1 1.0 sin bandas N Individuos 130 408 141 411 399 125 403 133

A partir de estos datos, determina si los marcadores estn ligados al locus ndt y, en su caso calcula la frecuencia de recombinacin. Aplica la funcin de mapa.

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Lig. M. Mol. 3. Durante el pasado curso acadmico, los estudiantes de TAG de la Universidad de Hollywood han llevado a cabo una serie de prcticas cuyos resultados hemos de interpretar. En primer lugar se cruzaron hembras mutantes de D. melanogaster caracterizadas por tener los ojos de color verde esmeralda (fenotipo Taylor) con machos de fenotipo normal. Todos los individuos de la F1 tenan los ojos de color normal. Se aislaron varias hembras vrgenes de esta F1 y se realiz con ellas un cruce prueba obtenindose como resultado aproximadamente la mitad de los individuos con cada fenotipo (Taylor y normal). Se llevaron a cabo experimentos de RAPD y con el cebador O-27 se observ la presencia de una banda de 1.0 kb en los progenitores normales y que estaba ausente en todas las hembras de fenotipo Taylor de la generacin parental. Los individuos de la F1 presentaban la citada banda y el resultado del cruce prueba entere hembras de esta F1 y machos de fenotipo Taylor carentes de la banda dio como resultado la siguiente segregacin:

FENOTIPOS ojo normal y presencia de banda ojo normal y ausencia de banda Taylor y presencia de banda Taylor y ausencia de banda

INDIVIDUOS 762 228 246 764

a) Plantea un esquema sencillo de este problema en el que indiques los fenotipos y genotipos de los individuos estudiados. b) Qu puedes concluir acerca de la localizacin cromosmica de la mutacin Taylor? c) Es dominante o recesiva la mutacin Taylor? Y el marcador molecular?, por qu? d) Existe ligamiento entre el marcador clsico y el marcador molecular? De ser as calcula la distancia gentica. En un segundo experimento cruzaron cuatro hembras vrgenes de D. melanogaster portadoras de una mutacin responsable del color azul de sus ojos, (fenotipo Newman), con machos de fenotipo normal. En la descendencia de uno de esos cruces se contabilizaron 52 hembras de ojos rojos y 48 machos de ojos azules. En un intento de localizar marcadores moleculares ligados al gen responsable de los fenotipos anteriores llevaron a cabo experimentos de RAPDs con varios cebadores. Con el cebador O-37 se obtena una banda de 1500 pares de bases presente tanto en los machos de la generacin parental como filial y ausente en las hembras de esas generaciones. e) Qu puedes concluir acerca de la localizacin de la mutacin Newman? f) Qu puedes concluir acerca de la localizacin del marcador molecular? g) Es posible la clonacin del gen responsable del color de ojos utilizando el marcador molecular de 1500 pb? Si tu respuesta es "SI", contesta brevemente cmo lo haras. Si tu respuesta es "NO", explica por qu.

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Lig. M. Mol. 4. Se descubre en Drosophila una nueva mutacin recesiva humpback (hb) que produce una protuberancia en el trax en forma de joroba. Se desea localizar un marcador tipo RAPD ligado al gen hb. Se extrae el DNA de una cepa homocigota normal para el trax, y de una cepa mutante. Tras probar distintos cebadores se encuentra uno que presenta el perfil de banda que se muestra en la figura adjunta. El anlisis del perfil de bandas en los individuos de la F1 producto del cruce entre individuos de la cepa normal e individuos de la cepa mutante hb tambin se muestra en la misma figura. Observa que aparecen dos posibles marcadores RAPD que podran estar ligados al gen hb: uno corresponde al fragmento RAPD de 800 pb y el otro al fragmento de 600 pb. Supn que los dos marcadores RAPD corresponden a dos regiones independientes del genoma de Drosophila. a) Cul de los dos marcadores RAPD elegiras y qu cruzamientos haras para averiguar si se encuentra ligado al gen hb? b) Imagina que escoges una banda como marcador para realizar un cruzamiento prueba con la F1 y obtienes 524 individuos. Qu genotipos, fenotipos y nmero de individuos esperaras de cada clase si hubiera un ligamiento del 25% con el marcador escogido? c) Qu genotipos, fenotipos y nmero de individuos esperaras de cada clase, si en la experiencia anterior los dos loci no estuvieran ligados? d) Por qu no has elegido el otro marcador?, Cmo podras comprobar si el otro marcador est ligado o no al gen hb? e) Cmo afectara al resultado del apartado a) el que los 2 marcadores RAPD fueran alelos del mismo locus?

800 pb 600 pb

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Lig. M. Mol. 5. El micelio de un determinado hongo diploide es amarillo por acumular caroteno. Uno de los mutantes de la sntesis de carotenos es el mutante carR5, que produce micelio rojo. En un estudio de RAPDs utilizando varios cebadores se consiguieron detectar varios marcadores moleculares que diferenciaban las dos cepas. En la figura inferior se muestran los resultados de uno de estos experimentos. Se cruz una estirpe homocigtica amarilla (PA) con otra homocigtica roja (PR), los 100 descendientes de la F1 estudiados fueron amarillos y mostraron el mismo patrn que aparece en la fotografa inferior (F1). Se cruz uno de estos descendientes con el parental rojo, una muestra de los individuos resultantes aparece en la fotografa inferior (F2). Los nmeros 1 a 6 corresponden a individuos de fenotipo rojo, mientras que los individuos del 7 al 12 presentaban fenotipo amarillo. Las columnas rotuladas con una M corresponden a diferentes marcadores de peso molecular. Los tamaos de las bandas de uno de ellos se muestra al margen. Contesta razonadamente a las siguientes preguntas: a) Encuentras algn marcador molecular asociado a esto fenotipos? Qu tamao tiene? Es dominante o recesivo? b) Es dominante la mutacin carR5? c) Suponiendo que hubieras analizado 36 individuos de la F2 en 3 geles, y que el resultado obtenido en cada uno fuera el mismo que el que se observa en la fotografa inferior derecha, di si est ligado el marcador molecular y el gen carR. En caso de que as fuere, calcula la frecuencia de recombinacin. d) La banda de aproximadamente 500 pb que se obtiene, se puede considerar un marcador molecular? e) Escribe los genotipos de los individuos PA, PR, F1, F23, F24, F27 y F212.

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Lig. M. Mol. 6. Drosophila subobscura presenta una mutacin recesiva autosmica lime (li) que produce cuerpo de color amarillo verdoso. Se desea localizar un marcador tipo RAPD ligado al gen li. Slo uno de los muchos cebadores probados dio perfiles de bandas diferentes en la cepa silvestre y la mutante. Sin embargo, los individuos de la cepa silvestre mostraron con ese cebador 3 tipos de patrones (incluidos en la figura adjunta), que presentaban diferencias en la presencia de fragmentos de 500 y 700 pb. Ninguno de estos fragmentos aparece en los individuos analizados de la cepa mutante ya que todos ellos presentaban el patrn mostrado en la figura adjunta. Dado que no se dispona de ningn otro marcador alternativo, se analiz la segregacin de estos marcadores RAPD en la progenie F1, producto de mltiples cruces al azar entre individuos de la cepa silvestre y de la cepa mutante. Los miles de individuos de la F1 analizados presentaban siempre uno de los 2 perfiles mostrados en la figura adjunta, bien el de la banda de 700 pb, bien el de la banda de 500 pb. a) Por qu no aparece en la F1 ningn individuo con un perfil sin la banda de 500 pb ni la de 700 pb? b) Qu posibles genotipos presentan los individuos de las dos clases parentales para el gen li y los marcadores de RAPD? Y los individuos de la F1? c) Podras utilizar alguno de estos marcadores de RAPD para determinar su posible ligamiento con el gen li? Por qu? d) Qu cruzamientos haras para averiguar si se encuentra alguno de estos marcadores de RAPD ligado al gen li? e) Imagina que llevas a cabo la experiencia y obtienes 924 individuos. Qu genotipos, fenotipos y nmero de individuos esperaras de cada clase fenotpica si hay un ligamiento del 15%?.

+/+

li/li

F1

700 pb 500 pb

700 p b 500 p b

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Lig. M. Mol. 7.- En Musca domestica existe una mutacin recesiva r que confiere resistencia a cierto tipo de insecticidas. Con el fin de encontrar un marcador molecular ligado a este gen se llev a cabo un estudio mediante la tcnica de RAPDs: se prob una batera de 20 cebadores diferentes sobre 100 individuos de una cepa resistente y sobre 100 individuos de una cepa susceptible. De estos 20 cebadores se seleccion uno que produca un mismo patrn de bandas en todos los individuos resistentes y otro patrn distinto en los individuos susceptibles. Todos los individuos de la F1 de un cruce entre individuos resistentes y susceptibles produjeron el mismo patrn de bandas (idntico al de los individuos susceptibles). En la figura 1 se muestran los patrones de bandas observados.
Figura 1 + F1 Figura 2 susceptibles (+)

tamao
950 900 700 650 500 350 300

resistentes (r)

Total

F2 (n de individuos)

3951

299

695

54

3954

296

700

51

10.000

Los individuos de la F1 se cruzaron con individuos resistentes de la cepa parental y su descendencia se clasific en susceptible o resistente segn su respuesta a cierta dosis de insecticida. Posteriormente se extrajo DNA de cada uno de estos individuos y se hizo una PCR usando el primer previamente seleccionado. En la figura 2 se presentan los diferentes patrones de bandas observados as como el nmero de individuos con cada uno de los patrones. a) A partir de estos resultados, podras elegir algn marcador ligado al gen cuya mutacin confiere resistencia? b) Podras determinar la distancia gentica entre dicho gen y los marcadores que muestran polimorfismo? c) Podras determinar la distancia gentica entre los dos marcadores moleculares polimrficos? d) Si te diesen a elegir, cual de los fragmentos polimrficos usaras como sonda para iniciar un paseo cromosmico para aislar el gen responsable de la resistencia? Por qu?

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MAPAS DE RESTRICCIN
Restriccin 1. Mapa de restriccin del gen de la -globina de conejo utilizando la tcnica de hibridacin tipo Southern (Jeffreys i Flavell, 1977). El DNA total de conejo se someti a sucesivas digestiones sencillas y dobles con diferentes endonuclessas de restriccin (Eco RI, PstI, KpnI i BglII). Los productos resultantes de las digestiones se corrieron en geles de agarosa para separar los fragmentos obtenidos en funcin de su tamao. Tras una transferencia tipo "Southern a un filtro, donde se fij y se hibrid con una sonda radiactiva (un fragmento BglII - BglII de 1,6 Kb que contiene el gen de la -globina de conejo). Los tamaos de los fragmentos reconocidos por la sonda se calcularon por comparacin con una digestin control que genera fragmentos de tamao conocido y los resultados que se obtuvieron fueron los siguientes:

Digestiones sencillas Eco RI PstI KpnI BglII

Tamao de los fragmentos (Kb) 2,6 y 0,8 6,3 5,1 1,6

Digestiones dobles Eco RI + PstI PstI + KpnI Eco RI + BglII KpnI + Eco RI

Tamao de los fragmentos (Kb) 1,3 y 0,8 3,9 y 1,2 1,5 2,5 y 0,8

Los fragmentos menores de 150pb no fue posible detectarlos. A partir de estos datos elaborar el mapa de los sitios de restriccin indicados de la regin del gen de la -globina de conejo.

Restriccin 2. El cromosoma lineal de un fago de 22.5 Kb se someti a digestiones sencillas y dobles con las siguientes enzimas de restriccin: EcoRI (E), BamHI (B), HindIII (H) y PstI (P). El mapa de los sitios de restriccin se presenta en la siguiente figura:
sonda

E 1.0 5.0

P 2.0

B 2.0

H 3.0

E HEBP 1.2 0.8 * * 0.5 0.5 3.0

E B 2.0 1.0 0.5 (kb)

Indicar tras las digestiones sencillas y dobles con las enzimas de restriccin indicadas las bandas en el gel que seran visibles al realizar un Southern utilizando como sonda un fragmento que cubre la regin EcoRI-PstI de 3 Kb.

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Restriccin 3. Se conoce un polimorfismo ligado al locus responsable de la enfermedad de Huntington en el cromosoma 4 humano. Tal polimorfismo se caracteriza por la susceptibilidad a la digestin con el enzima HindIII, de manera que se han descrito cuatro alelos diferentes, siendo uno de ellos el ms frecuente (alelo 1). A partir de los datos de los fragmentos obtenidos de las digestiones de DNA genmico humano con los enzimas HindIII, EcoRI y PstI, transferidos por la tcnica de Southern e hibridados independientemente con dos sondas (sonda A y sonda B), se pueden obtener los mapas de restriccin correspondientes a cada uno de dichos alelos. a) Construir el mapa de restriccin del alelo 1 considerando los resultados obtenidos con cada una de las sondas por separado. Ten en cuenta que ambas sondas podrn hbridar con cierto nmero de fragmentos comunes, los cuales te ayudaran a ordenar los diferentes fragmentos en un nico mapa.
SONDA A (fragmento PstI de 2.6 kb) digestiones sencillas EcoRI: 9.3 kb HindIII: 3.7 kb; 1.2 kb PstI: 2.6 kb digestiones dobles EcoRI/HindIII: 2.7 kb; 1.2 kb EcoRI/PstI: 2.6 kb HindIII/PstI: 2.1 kb; 0.5 kb

SONDA B (fragmento EcoRI de 3 kb) EcoRI: 3.0 kb HindIII: 17.5 kb; 3.7 kb PstI: 8.6 kb EcoRI/HindII: 2.0 kb; 1.0 kb EcoRI/PstI: 3.0 kb HindIII/PstI: 7.0 kb; 1.6 kb

b) Los otros alelos (alelos 2 a 4) muestran diferentes patrones de restriccin nicamente para el enzima HindIII. Indica los mapas respectivos, slo para este enzima, sabiendo que al hbridar con la sonda B hemos obtenido los siguientes resultados: alelo 2: 17.5 kb; 4.9 kb alelo 3: 15.0 kb; 3.7 kb alelo 4: 15.0 kb; 4.9 kb
c) Al digerir el DNA genmico de 6 individuos diferentes con el enzima HindIII, e hibridarlo simultneamente con las sondas A y B obtenemos los siguientes resultados:

1 1

2 2

3 3

4 4

5 5

6 6

M M
17.5 15.0

4.9 3.7 1.2

Indica el genotipo de cada uno de ellos.

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Restriccin 4. Queremos obtener el mapa de restriccin de un plsmido de 2.7 kb que lleva insertado un fragmento de 8.3kb. Realizamos digestiones simples y dobles con tres enzimas de restriccin (A, B y C) obtenindose los siguientes fragmentos (en kb): Enzimas A 6.8* 4.2 B 5.3 5.2* 0.5 C 8.2* 2.8 A+B 4.1 2.7* 2.5 1.2 0.5 A+C 4.2 2.8 2.7* 1.3 B+C 5.2* 2.8 2.5 0.5

NOTA: Para facilitar la elaboracin del mapa se han indicado con un * el fragmento, que en cada digestin contiene el vector de 2.7 kb.

Restriccin 5. Un fragmento de 2.5 kb, producto de la digestin con el enzima A, se utiliza como sonda para caracterizar una regin genmica determinada, en concreto para elaborar un mapa de restriccin de la misma. Para ello se efectuaron una serie de digestiones enzimticas sencillas y dobles, se separaron los fragmentos obtenidos mediante electroforesis y, posteriormente, se transfiri el DNA a un filtro de nylon y se hbrido con el fragmento de 2.5 kb. El resultado se presenta se la siguiente tabla: DIGESTIN PRODUCTOS DETECTADOS (enzimas utilizados) (en kilobases) A 2.5 B 1.8, 2.2 C 4.0 A+B 1.0, 1.5 A+C 2.5 B+C 1.5, 2.2 Construye el mapa resultante. Si se utiliza un cuarto enzima, D, se obtienen los siguientes resultados: DIGESTIN (enzimas utilizados) D A+D B+D C+D PRODUCTOS DETECTADOS (en kilobases) 0.4, 2.0, 3.6 0.4, 0.5, 1.6 0.4, 0.6, 1.2, 1.8 0.4, 1.5, 2.1

Sita en el mapa anterior los puntos de corte producidos por el enzima D.

30

Restriccin 6. Un fragmento de DNA de ratn tiene extremos cohesivos EcoRI y contiene el gen M. Este fragmento de 8 kb, se inserta en el plsmido bacteriano pBR322, en el sitio EcoRI. El plsmido recombinante se somete a restriccin con lo s enzimas EcoRI, BamHI y la doble digestin EcoRI + BamHI. El anlisis de los fragmentos de restriccin mediante electroforesis en gel de agarosa dan el siguiente resultado: EcoRI 8 kb 6 kb BamHI 5.5 kb 4.5 kb 4.0 kb EcoRI + BamHI 4.0 kb 3.5 kb 3.0 kb 2.5 kb 1.0 kb

a) Construye el mapa de restriccin del plsmido y el inserto que contiene el gen M de ratn. b) Se transfiere el DNA sometido a restriccin mediante la tcnica de Southern y se hibrida con el plsmido pBR322. Qu fragmentos procedentes de la doble digestin EcoRI + BamHI, hibridarn? Restriccin 7. En la flor de Don Diego se ha caracterizado, mediante RFLPs, uno de los genes implicados en la ruta de biosntesis del pigmento de la corola, el locus red (R). En esta planta, el color de la flor presenta una herencia intermedia. El mapa de restriccin del alelo R es el siguiente:

Para caracterizar el alelo recesivo, r, se extrajo DNA genmico de plantas de Don Diego de flor roja, rosa y blanca. Tras digestin con los enzimas de restriccin EcoRI, HindIII y la doble digestin EcoRI + HindIII, se realiz una electroforesis en gel de agarosa de alta resolucin, transferencia a membrana de nylon e hibridacin mediante la tcnica de Southern. Para detectar los fragmentos se utilizaron conjuntamente dos sondas: i) sonda A, fragmento H-E de 1.0 kb; ii) sonda B, fragmento E-E de 1.5 kb. Los resultados obtenidos tras la deteccin fueron: EcoRI HindIII EcoRI + HindIII RR 1.5, 1.2 1.75, 0.95, 0.3 1.0, 0.65, 0.55, 0.3 Rr 1.5, 1.25, 1.2 1.75, 0.95, 0.3, 0.05 1.0, 0.65, 0.55, 0.3, 0.05 rr 1.25, 1.2 1.75, 0.95, 0.05 1.0, 0.65, 0.55, 0.05

NOTA: El tamao de los fragmentos se muestra en kilobases.

Cuestiones: a) Dibuja el mapa para el alelo recesivo r. b) Qu resultados obtendras si solo utilizases la sonda A con las tres plantas? Qu podras concluir?

31

Restriccin 8. - a) Elabora el mapa de restriccin del DNA mitocondrial de Drosophila melanogaster a partir de los datos que se presentan en el siguiente gel de agarosa.
H
13 13

H/E
16

P/H

P/E

H = HindIII E = EcoRI

8 6.8 6.2

8 7.8

P = PstI H/E = doble digestin P/E = doble digestin P/H = doble digestin

3 2 1

1.8 1.2 0.2

Ten en cuenta que el mtodo de extraccin utilizado permite la deteccin de todas las bandas de la molcula de DNA mitocondrial y recuerda que el DNA mitocondrial es circular. b) Dibuja un gel con las bandas que se veran si tras transferir el gel anterior a un filtro mediante la tcnica de Southern hibridsemos ese filtro con una sonda correspondiente al fragmento E/H de 1 kb. c) y si la sonda utilizada fuese el fragmento H de 3 kb? Restriccin 9.- A) Elabora el mapa de restriccin del DNA mitocondrial de Apis melifera a partir de los resultados de las digestiones simples y dobles que se indican a continuacin: DIGESTION EcoRI HindIII PstI HindIII + EcoRI HindIII + PstI EcoRI + PstI FRAGMENTOS (en Kb) 8,5 14,0 + 3,0 14,5 + 2,5 7,5 + 6,5 + 2,0 + 1,0 7,0 + 4,5 + 3,0 + 2,5 8,5 + 5,5 + 2,5 +0,5

Ten en cuenta que el mtodo de extraccin utilizado permite la deteccin de todas las bandas de la molcula de DNA mitocondrial y recuerda que el DNA mitocondrial es circular. B) Dibuja un gel con las bandas que se veran producto de las digestiones anteriores (indicando su tamao) y las que se observaran si tras transferir el gel anterior a un filtro mediante la tcnica de Southern, hibridsemos ese filtro con una sonda correspondiente al fragmento PstI de 2,5 kb. C) Y si la sonda utilizada fuese el fragmento HindIII de 3,0 kilobases?

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Restriccin 10.- Tenemos un fragmento de DNA de Drosophila de 8.7 kb clonado en el sitio XbaI del plsmido pUC18 (2.7 kb), y queremos saber su mapa de restriccin. Para ello utilizamos las digestiones simples y dobles con otros dos enzimas, EcoRI y HindIII que tambin cortan en el sitio de clonacin mltiple de pUC18. Los tamaos en kilobases de los fragmentos obtenidos en estas digestiones son los siguientes: EcoRI 8.5 2.9 HindIII 4.7 4.4 2.3 EcoRI+HindIII 4.5 2.7 2.3 1.7 0.2

a) Construye el mapa de restriccin del DNA plasmdico recombinante b) Calcula el tamao de los fragmentos de restriccin obtenidos en las digestiones dobles EcoRI/XbaI y HindIII/XbaI c) Se transfiere el DNA sometido a restriccin a un filtro mediante la tcnica de Southern blot, y se utiliza como sonda el fragmento EcoRI de 2.9 kb. Qu fragmentos hibridarn en las siguientes digestiones: EcoRI, HindIII, EcoRI/HindIII, EcoRI/XbaI y HindIII/XbaI?

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IDENTIDAD GENTICA. ANLISIS FORENSE

Forense 1. Tras el robo en una joyera, la polica encontr un resto de sangre, debido probablemente a que el ladrn se cort al romper un cristal. Las investigaciones de la polica condujeron a una persona con antecedentes penales por robo. Esta persona presentaba un profundo corte en la mano hecho recientemente, motivo por el cual fue catalogado como sospechoso y detenido. Un primer anlisis de la sangre del sospechoso y de la muestra encontrada en la escena del robo mostr que ambas correspondan a individuos de grupo sanguneo B. (a) si las frecuencias allicas en la poblacin para el locus ABO son las siguientes, Cul sera la probabilidad de encontrar por azar un individuo de estas caractersticas en la poblacin? Locus ABO: alelo IA (0.35), alelo IB (0.10) y alelo I0 (0.55)
(b) Para poder obtener una mayor seguridad sobre su culpabilidad o inocencia, se recurri al

anlisis de otros tres loci de transmisin independiente. En este caso eran marcadores minisatlites codominantes. El anlisis del genotipo de la dos muestras de sangre volvi a mostrar una igualdad en el genotipo (A1A1 B1B3 C1C2)
B

A partir de las frecuencia allicas para los tres loci determina la probabilidad de encontrar por azar un individuo de estas caractersticas en la poblacin.
LOCUS A ALELO A1 A2 A3 FREC. 0.1 0.3 0.6 LOCUS B ALELO B1 B2 B3
B B B

FREC. 0.2 0.7 0.1

LOCUS C

ALELO C1 C2 C3

FREC. 0.2 0.2 0.6

c) Con los resultados gel grupo AB0 y de los tres loci minisatlite y suponiendo transmisin

independiente, determina la razn bayesiana de la probabilidad de que el sospechoso sea el culpable del robo.

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Forense 2. En un caso de divorcio el marido reclama la custodia de los dos primeros hijos y rechaza al tercero aduciendo que no es hijo suyo. El grupo sanguneo del marido es el O y el de su mujer el B. Los dos primeros hijos son de los grupos O y AB respectivamente, mientras que el tercero es del grupo B. Adems se decide llevar a cabo un estudio de minisatlites (VNTRs) empleando cebadores especficos de un locus muy polimrfico (D1S82) situado en el cromosoma 1. Los resultados se observan en la siguiente figura.
Marido 550 500 450 400 350 Mujer 1 2 3

(a) Es cierta la suposicin del marido?. Razona la respuesta. (b) Conociendo las frecuencias en la poblacin de los diferentes alelos para el sistema ABO y el locus D1S82, qu opinas sobre la certeza de la paternidad en cada uno de los tres casos?. -------------------------------------------------------------ABO D1S82 -------------------------------------------------------------alelo frecuencia alelo tamao frecuencia A I 0.42 N1 560 0.10 IB 0.15 N2 450 0.15 0 3 I 0.43 N 500 0.32 N4 360 0.05 N5 420 0.38 -------------------------------------------------------------El tamao de los fragmentos amplificados se da en pares de bases.

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Forense 3. El entrenador de un equipo de ftbol ha sido asesinado y todo apunta a que el culpable ha sido uno de los jugadores del equipo. Quince de los veinte jugadores del equipo aceptan que se compare una muestra de su sangre con cierta sangre encontrada en la escena del crimen, que debe ser del culpable, dado que no coincide en tipo sanguneo con la del entrenador. Para establecer una primera comparacin se usa una PCR con un par de cebadores capaces de amplificar dos zonas independientes del genoma que son altamente variables. Los resultados son los siguientes:

A1 B3 A3
A4 B5

B1 A5 B6
A2 B2

A6 B4

C es la amplificacin obtenida de la sangre del presunto culpable y los nmeros se refieren a los distintos jugadores. La ventaja de usar estos cebadores es que se conocen las frecuencias en la poblacin de nuestro pas de cada uno de los productos producidos, que corresponden a alelos de cada una de las dos zonas amplificadas. Las frecuencias son las siguientes: REGION A ALELO A1 (800 pb) ALELO A2 (460 pb) ALELO A3 (710 pb) ALELO A4 (670 pb) ALELO A5 (600 pb) ALELO A6 (400 pb) Frecuencia 0.30 0.25 0.03 0.02 0.30 0.10 REGION B ALELO B1 (640 pb) ALELO B2 (450 pb) ALELO B3 (750 pb) ALELO B4 (360 pb) ALELO B5 (660 pb) ALELO B6 (500 pb) Frecuencia 0.02 0.10 0.60 0.20 0.05 0.03

Lgicamente, dichos resultados no aplican ni al nigeriano ni al ucraniano del equipo, que corresponden a dos de las muestras obtenidas. Propn una hiptesis acerca de cules seran dichas muestras.

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SOLUCIONES DE LOS PROBLEMAS

Localizacin 1. A) la mutacin a se encuentra en el cromosoma III al no aparecer junto al marcador scarlet. Segregacin 1:2:1 entre a y scarlet Segregacin 9:3:3:1 entre a y scarlet Segregacin 9:3:3:1 entre a y nubbin

2 : 0.478 No se rechaza 2 : 23.25 Se rechaza 2 : 28.336 Se rechaza

Vista la segunda segregacin no parece que a y nubbin segreguen independientemente. Ello puede ser debido a que, aunque se encuentren en grupos de ligamiento distintos, una de las dos mutaciones no se comporte como esperamos (3:1). Si analizamos la segregacin de cada una de ellas observamos Segregacin 3:1 para a

Segregacin 3:1 para nubbin La mutacin nubbin no se comporta como es de esperar para un monohibridismo con relacin de dominancia. Si probamos la relacin 2:1 obtenemos una 2 : 1.23 (< 3.84) B) Lo ms probable seria que a fuese alelo de scarlet, ya que se encuentran en el mismo cromosoma. En todo caso, lo primero que habramos observado es que en la F1 el fenotipo seria no normal y dependiente de la relacin allica entre a y scarlet. Localizacin 2. 1) En el cruce propuesto si la mutacin est en el cromosoma X en la F1 se obtienen machos mutantes. Si el cruce es el contrario (hembras normales para la mutacin problema y machos mutantes) toda la F1 es normal, aunque la mutacin est en el cromosoma X. 2) Toda la F1 sera mutante. 3) El cruce sera: hembras a/a vg+/vg+ ri+/ri+ X machos a+/a+ vg/vg ri/ri (alas curvadas) (alas normales, pero vestigiales) La F1 sera de genotipo a/a+vg+/vg ri+/ri (alas normales) La respuesta es que no sirve ese marcador. El fenotipo de alas vestigiales enmascara la posible presencia de los fenotipos radio incompleto y alas curvadas.

2 : 0.48 No se rechaza 2 : 14.35 Se rechaza.

37

Localizacin 3. a) La mutacin puede estar en el cromosoma 3, al no aparecer juntos mutantes y scarlet Segregacin 1:2:1 entre a y scarlet Segregacin 9:3:3:1 entre a y vestigial

2 : 0.8 No se rechaza 2 : 6.22 No se rechaza

Habra que repetir el experimento contando ms individuos. Un ligero cambio en los datos ya posibilita rechazar que la mutacin segrega independientemente del marcador del cromosoma 3. Puedes probar con este ejemplo: FENOTIPO Normal scarlet vestigial mutacin a scarlet y vestigial scarlet y mutacin a vestigial y mutacin a scarlet, vestigial, mutacin a INDIVIDUOS 44 11 10 10 2 0 3 0

b) Experimento para calcular la distancia gentica entre a y el marcador. Hay que hacer un cruce prueba. Dispongo de hembras a st+/a st+ y machos a+st/a+st. Necesito machos a st/a st. Para obtener una cepa doble mutante hay varias posibilidades, todas ellas implican obtener una F3. Una vez obtenida la cepa cruzamos la F1 por el macho doble mutante a st+/a+ st x a st/a st a st [a +] [+ st] [a st] [+ +] Frecuencia n1 n2 n3 n4 Total =N

a + (parental) + st (parental a st (recombinante) + + (recombinante)

Distancia entre a-st = Frecuencia de gametos recombinantes entre a-st r = (n3 +n4)/N

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Localizacin 4. sh sh b b p p x sh+ sh+ b+ b+ p+ p+ + sh sh b+ b p+ p x sh sh b b p p F2 con hembras y machos en igual proporcin normales ojos rosados cuerpo oscuro y alas cortas ojos rosados, cuerpo oscuro y alas cortas 122 123 106 129

a) Si es posible. Si la mutacin problema (sh) estuviera en el cromosoma IV debera presentarse una segregacin independiente con lo que las clases fenotpicas observadas serian ocho normal, las tres simples mutantes, las tres dobles mutantes y la triple mutante- y se presentaran con la misma proporcin, cosa que no ocurre. Si sh se encontrara ligada a uno de los dos marcadores se presentara asociada con este en una clase fenotpica doble mutante, el otro marcador aparecera como simple mutante y tambin se encontraran individuos triple mutantes. Por ejemplo si sh estuviese ligado a un marcador a pero no a otro b resultara:

sh a sh + a +

b b+

sh a sh a

b b+

fenotipos de la F2 sh a b triple mutante sh a b+ doble mutante sh y marcador ligado sh+ a+ b mutante no ligado sh+ a+ b+ normales En nuestro caso la mutacin alas cortas se encuentra ligada al marcador black, cuerpo oscuro, puesto que en nuestro caso aparecen juntos en el doble mutante. Short se encuentra en el cromosoma II. b)

sh b sh + b +

p p+

sh b sh b

p p+

al producirse entrecruzamientos en las meiosis de las hembras triple heterocigotas aparecen cuatro nuevas clases fenotpicas entre la descendencia y que en conjunto corresponden al total de individuos recombinantes por lo que puede deducirse que la distancia entre las mutaciones de alas cortas y cuerpo oscuro es de 15 um.

39

Localizacin 5. a) Vista la segregacin fenotpica de la F2 puede suponerse que red esta en el cromosoma II junto con vestigial. Segregacin 1:2:1 entre red1 y vg Segregacin 9:3:3:1 entre red1 y e

2 : 1.6 No se recaza 2 : 3.91 No se rechaza

b) Debera llevarse a cabo una prueba de alelismo entre los dos mutantes red, cruzndolos entre si. Si el fenotipo de la descendencia fuese normal nos estara indicando que se trata de genes distintos, pero si el fenotipo fuese mutante (no normal) la lectura que deberamos hacer es de que se trata de alelos del mismo gen.

Localizacin 6. 1. No es el mejor cruzamiento posible puesto que el fenotipo de la F1 no nos indica si la mutacin se encuentra localizada en el cromosoma X pero es vlido para nuestro propsito. 2. Puesto que el fenotipo de ojos de color naranja no aparece asociado con las quetas afeitadas podemos suponer que la mutacin se encuentra localizada en el cromosoma III. Segregacin 1:2:1 entre ojos naranja y quetas afeitadas Segregacin 9:3:3:1 entre ojos naranja y venacin incompleta 3. Llevara a cabo las pruebas de alelismo correspondientes.

2 : 3.65 Se acepta 2 : 4.04 Se acepta

Localizacin 7. a) a mx+ x a+ mx F1 normal a+ a mx+ mx F2 si son independientes 9:3:3:1 De todas las segregaciones parece que la correspondiente a m2 no segrega as. Ho: el marcador m2 no segrega 9:3:3:1

Segregacin 9:3:3:1 entre a y m2

2 : 15.90

Se rechaza

Se puede comprobar, adems, que no se rechaza la segregacin independiente con el resto de marcadores:

40

Segregacin 9:3:3:1 entre a y m1 Segregacin 9:3:3:1 entre a y m3 Segregacin 9:3:3:1 entre a y m4 Segregacin 9:3:3:1 entre a y m5

2 : 0.20 2 : 0.71 2 : 0.26 2 : 0.79

Se puede comprobar que la segregacin obtenida entre a y m2 no se ajusta al esperado 9:3:3:1 a pesar de que cada uno de los pares gnicos si que lo hace. Con ello reforzamos la hiptesis de falta de independencia entre los dos pares gnicos. Segregacin 3:1 para el par gnico a / a+ Segregacin 3:1 para el par gnico m2 / m2
+

2 : 0.11 2 : 0.11

Se acepta Se acepta

b)

r2 2 = ; 4 200

r = 0.2;

distancia 20 cM

c) No podemos saber la orientacin relativa entre m2, m2(nuevo) y a por lo que no podemos indicar la distancia exacta entre m2 y a: m2??
m2

m2??

20 cM
IIIIIIIII Mapa Rec. 1.

a) orden a-m2-m1 distancia a - m2 = 16.7 u.m. distancia m2 m1 = 21.3 u.m. b) distancia a - m2 = 20.3 u.m. distancia m2 m1 = 27.8 u.m.
Mapa Rec. 2.

1) 2) 3) 4) 5)

bac bac bac acb acb

41

Mapa Rec. 3.

a) Vista la segregacin fenotpica de la descendencia referida a los genes A, B y C estos estn ligados. Podemos concretar, orden A B - C distancia (A,B) = 20 cM distancia (B,C) = 27 cM La segregacin fenotpica referida a los genes C, D y E nos indica que no todos estn ligados puesto que los ocho valores fenotpicos aparecen en dos grupos de cuatro valores semejantes. Habr que ver como se comportan estos genes por parejas. Dado el cruzamiento realizado, si segregan 1:1:1:1 indican independencia, no ligamiento. Segregacin entre C y E CE ce Ce cE 367 363 133 137 No segregan 1:1:1:1, Estn ligados. distancia entre C y E = 27 cM.

Segregacin entre C y D CD cd Cd cD 241 248 259 252 Segregan 1:1:1:1. Segregan independientemente.

Segregacin entre D y E DE 243 de 246 De 250 dE 261 Por tanto se encuentran ligados A, B, C y E El gen D segrega independientemente del resto

Segregan 1:1:1:1. Segregan independientemente.

(b/e)
20 cM 27 cM

c
27cM

b) La mutacin e puede situarse a la derecha de c y por tanto muy alejada de b y a o puede situarse a la izquierda de c con lo que coincide en el punto ocupado por la mutacin b.

42

c) El hecho de que la descendencia entre las cepas b y e presente un fenotipo mutante de ojos oscuros -que adems lo presentan las dos cepas en condicin homozigota- nos est indicando que las mutaciones b y e son allicas. d)

(b/e)
25.5 cM 38.8 cM

c
38.8cM

IIIIIIIII Del. y Comp. 1.

8 Df(9-12) Df(11-13) Df(14-15) Df(8-10) corto 1 corto 2 corto 3 corto 4 corto 5 a)

10

11

12

13

14

15

Cuatro grupos de complementacin [1,4] , [2] , [3] y [5] b) La posible localizacin de los distintos mutantes se encuentra indicada en la tabla c) Genotipo corto1 / Df(11-15) corto 2 / Df(10-12) Df(8-15) / Df(8-10) Df(8-10) / Df(11-13) Corto2 / Df(9-11)
Del. y Comp. 2. a) a b c d e Df(2)1 Df(2)2 0 + 0 0 + 0 0 a 0 + + + 0 0 b 0 0 + 0 0 c 0 + 0 0 d 0 + + e 0: NO recupera el fenotipo normal +: recupera el fenotipo normal Df(2)3 + + + + 0

Fenotipo corto corto letal normal Corto si en 11, normal si en 12

43

b) Existen tres grupos de complementacin: [a,c,d] , [b] y [e] c) Df(2)1 Df(2)2 Df(2)3 [a,c,d] [b] d) CRUCE a/CyO x d/CyO b/CyO x d/CyO c/CyO x d/CyO d/CyO x d/CyO d/CyO x e/CyO FENOTIPOS F1 17% patas malformadas : 83% alas curvadas 35% salvaje: 65% alas curvadas 20% patas malformadas: 80% alas curvadas 33% patas malformadas: 67% alas curvadas 33% salvaje: 67% alas curvadas CRUCE d/CyO x Df(2)1/CyO d/CyO x Df(2)2/CyO d/CyO x Df(2)3/CyO FENOTIPOS F1 15% patas malformadas: 85% alas curvadas 17% patas malformadas: 83% alas curvadas 34% salvaje: 66% alas curvadas [e]
|

B | C |

En los cruces a x d y c x d se presenta un fenotipo no normal lo que indica que se trata de alelos del mismo gen (como ya sabamos). No se produce la segregacin esperada 1/3 normal : 2/3 alas curvadas porque el alelo d presenta problemas de viabilidad (provoca cierto grado de letalidad) tanto en las combinaciones d/a y d/c como cuando se presenta en hemicigosis d/Df(2)1 y d/Df(2)2-.

44

Del. y Comp. 3. 37C 37D 37E

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9

def A def B def C def D def E

letal 1 letal 2 letal 3 letal 4 letal 5 letal 6 letal 7 letal 8 letal 9 letal 10

Del. y Comp. 4.

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 def (7-12) def (9-14) def (10-13) def (14-16) def (7-16) blanco 1 blanco 2 blanco 3 blanco 4 amarillo a) b) c) d) hay tres cistrones localizados sobre el esquema anterior blanco 5 esta en una regin no comprendida por ninguna delecin. Podramos comprobar que realmente se encuentra en la regin 15 cruzando el citado mutante con los mutantes portadores de deleciones que sirven para discriminar la regin 15 como pueden ser del (9-14) que dara fenotipo normal- y del(14-16) que dara fenotipo blanco-. As lo localizaramos en las regiones 15 o 16.

Tambin habra que llevar a cabo una prueba de alelismo con las mutaciones blanco que podran estar en la regin 15 como son: blanco 2 y blanco 4 (las dos pertenecen al mismo cistrn).

45

Del. y Comp. 5.

a) Hay tres grupos de complementacin [a1, a2] , [a3] y [a4] y una delecin Df(a5) b) a5 es una delecin que afecta a a1, a2 y a3 por tanto puede que afecte a las regiones7 y 8 c)
1 Df(1-11) Df(9-11) Df(1-6) Df(1-4) a1 a2 a3 a4 a5 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

d) Df(a5)/Df (5-7) ser letal puesto que comparten regiones en comn.

Del. y Comp. 6.

a) Se encuentra en el cromosoma III dada la ausencia de los fenotipos correspondientes al doble mutante ss obs y al triple mutante. Segregacin 2:1:1 entre ss y obs Segregacin 9:3:3:1 entre ss y obs Segregacin 9:3:3:1 entre nub y obs

2 : 0.118 2 : 33.03 2 : 0.456

Se acepta Se rechaza Se acepta

b.1.) Es alelo de las mutaciones 3 y 4 ya que la descendencia hbrida correspondiente presenta un fenotipo no normal lo que indica la ausencia de complementacin (existe relacin allica). b.2.) mutante 1 mutante 2 mutante 3 mutante 4 mutante 1 0 xxxxxxx xxxxxxx xxxxxxx mutante 2 ? 0 xxxxxxx xxxxxxxx mutante 3 + + 0 xxxxxxxx mutante 4 + + 0 0

La relacin entre los mutantes 1 y 2 no tiene porque ser necesariamente conocida (el hecho de que no sean alelos de la mutacin obs no implica que sean alelos entre ellos).

46

Del. y Comp. 7.

a) Hay cuatro grupos de complementacin [m1, m4] [m2] [m3] [m5] y una delecin [m6] que abarca la regin donde se encuentran los tres primeros grupos de complementacin. b) 1 Df(1-3) Df(2-5) Df(4-7) Df(6-9) Df(1-10) m1 y m4 m2 m3 m5 m6 m2 se localiza en la regin gnica situada entre el final de la delecin Df(2-5) y el principio de la delecin Df(6-9). c) m6 es una delecin que va desde algn unto perteneciente a la regin 1 hasta un punto situado prximo al comienzo de la delecin Df(6-9) d) El resultado del cruzamiento entre m6 y Df(1-3) ser un 100% de moscas con las alas curvadas m6 C m6 C X Df (1-3) C + Df (1-3) C El resultado del cruzamiento entre m6 y Df(6-9) ser un 66% de moscas con las alas curvadas y un 33% de moscas con alas normales. m6 C m6 C + X

10

Df (6-9) C m6 Df (6-9)

Df (6-9) + C

47

Del. y Comp. 8.

a y b) 1 del. A del. B del. C del. D del. E del. F del. G 3 1 7 5 4 8 2 6 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

c) Hay cinco grupos de complementacin [m1, m7] [m2] [m3] [m5, m8] [m6] La mutacin m4 es una delecin parcialmente imbricada con las deleciones F y G que abarca a las mutaciones 1, 5, 7 y 8. d) se obtendran los siguientes resultados de complementacin: del. A del. B del. C del. D del. E del. F del. G + + + 0 + + + 0 + + + 0 + +

mx (1) my (10)

IIIIIIIII

48

Lig. M. Mol. 1.

Hay que analizar la segregacin de cada marcador con la mutacin aba por separado. Entre aba y el marcador de 2.0 Kb se observa una segregacin independiente (cada clase fenotpica representa aproximadamente un 25% del total de la descendencia), de manera que la frecuencia de recombinantes es de 0,50. Por tanto no se encuentran ligados y no puede utilizarse como marcador asociado. Entre aba y el marcador de 0.6 Kb se observa que las cuatro clases fenotpicas de la descendencia no son equivalentes, siendo mucho ms abundantes los individuos correspondientes a las clases fenotpicas parentales. Es evidente que hay ligamiento entre los dos pares gnicos y la frecuencia de recombinacin presente es de 0,0556, es decir la distancia entre aba y el marcador de 0.6 Kb es de 5,56 cM.

Lig. M. Mol. 2.

Vistos los resultados fenotpicos de la segregacin parece evidente que hay ligamiento entre algunos de los marcadores (no 1:1:1:1:1:1:1:1) Hay que ver que parejas estn ligadas. Para ello hay que reagrupar los datos por parejas y probar si segregan independientemente (1:1:1:1)
ndt+ versus banda de 3.1 ndt+ versus banda de 1.0 banda de 3.1 versus banda de 1.0

valor : 0.735 valor : 555.06 valor : 0.330

para tres grados de libertad y un nivel de significacin del 0.05 el valor de es 7.82 por tanto ndt y el marcador de 1.0 kb estn ligados y segregan de manera independiente respecto de la banda de 3.1 kb. Visto lo anterior los individuos recombinantes producidos en el cruce prueba sern los que presentan los fenotipos genitalia anormal y banda de 1.0kb  258 genitalia normal y sin banda de 1.0kb  271 la frecuencia de recombinantes ser (529 / 2150): 0.246 Nota: La distancia de Haldane es : 33,86 cM. La distancia de Kosambi es: 21,83 cM.

49

Lig. M. Mol. 3.

a) cruces con la mutacin Taylor (t)

t t

cruce entre Taylor y el marcador

t t

x
t+ t
+

t+ t+ t t

t+ M t+ M t t

F1

t F1 + t M

t t : t t

t+ M t t M t+

762 764 246 228

b) No est ligada al cromosoma sexual y est ligada al marcador. c) La mutacin Taylor es recesiva mientras que el marcador molecular es dominante. d) S , estn ligados; r = 0.237; una distancia de 23,7 cM e) La aparicin de hembras de ojos rojos y machos de ojos azules en la F1 nos indica que la mutacin Newman se encuentra localizada en el cromosoma X. f) La banda de 1.5 Kb se encuentra asociada a la parte diferencial del cromosoma Y por lo que solo amplifica en machos. g) No puede ser utilizada puesto que no existe ligamiento entre la banda y el gen de inters.

Lig. M. Mol. 4.

a) Entre gen humpback y banda de 600pb. El doble heterocigoto presenta el alelo mutante hb y el alelo de ausencia de amplificado en fase de repulsin. No se dispone del doble recesivo para llevar a cabo el cruce prueba que nos pueda detectar fcilmente los recombinantes. El cruce de F1 por F1 no seria discriminante puesto que los machos no recombinan. No se debera utilizar este marcador. Entre el gen humpback y la banda de 800pb.

50

El doble heterocigoto presenta el alelo mutante hb y el alelo de ausencia de amplificado en fase de acoplamiento. El propio individuo hb es tambin homocigoto para ausencia de amplificado por lo que puede llevarse a cabo el cruce prueba para detectar fcilmente los recombinantes. Podremos utilizar este marcador. b)
Fenotipo Genotipo hb + 800 hb N Individuos

normal y banda de 800 humpback y sin banda normal y sin banda humpback y banda de 800 c) El 25% de cada clase

196.5 (37,5%) 196.5 (37,5%) 65.5 (12,5%) 65.5 (12,5%)

hb hb hb + hb hb 800 hb

d) No se eligi porque en la F2 todos tendran banda. e) Obtendra el doble heterocigoto y lo cruzara con el parental hb 600. En la descendencia podra discriminar entre los cuatro fenotipos: hb+ 800+600 no recombinante hb 600 no recombinante recombinante hb+ 600 hb 800+600 recombinante en caso de estar ligados las frecuencias serian diferentes entre recombinantes y no recombinantes y en caso de no presentar ligamiento las cuatro clases se presentaran en proporcin aproximada (25%).

Lig. M. Mol. 5.

a) Posiblemente la banda de 800pb. Es dominante b) carR5 es recesiva

51

c) Fenotipo F2 Amarillo y banda de 800 Rojo y ausencia de banda () Amarillo y ausencia de banda () Rojo y banda de 800) Ind. observados en los tres geles 12 15 6 3

Nota: Rechazamos independencia (2= 11.75) 9 frecuencia de recombinacin: r = = 0.25 36 d) No porque se presenta en todos los individuos analizados. No presenta polimorfismo. e) carR+ : amarillo carR5: rojo PA carR + 800 carR + 800 PR carR5 carR5 F1 carR + 800 carR5 F2-3 carR5 carR5 F2-4 carR5 800 carR5 F2-7 carR + 800 carR5 F2-12 carR + carR5

Lig. M. Mol. 6.

a) Porque los fragmentos de 500 y 700pb son allicos. Por ello los individuos de la cepa +/+ son (i) homocigotos para el fragmento de 700, (ii) homocigotos para el fragmento de 500 o (iii) heterocigotos para los fragmentos de 700 y 500pb. b) +/+ (1) li + 700 li + 700 +/+ (2) li + 500 li + 500 +/+ (3) li + 500 li + 700 li/li li li F1 (1) li + 700 li F1(2) li + 500 li

c) Si porque los individuos F1 son heterocigotos para el gen li y la presencia de fragmento (independientemente de su tamao) por lo que al cruzarlos con individuos de la cepa li/li podremos discriminar la proporcin de recombinantes en la descendencia. d) F1 x li/li li li + 700 / 500 x li li

52

e)
Fenotipo normales con fragmento Genotipo N Individuos + li 700 / 500 392,7 [ (924 x 0.85) / 2] li

amarillo verdoso sin fragmento normales sin fragmento amarillo verdoso con fragmento

li li li + li li 700 / 500 li

392,7 69,3 69,3

Lig. M. Mol. 7.

a) En principio los dos fragmentos amplificados (de 700 y 500pb) parecen ligados al gen que confiere la resistencia, en concreto al alelo (+) que confiere la susceptibilidad ya que la proporcin de individuos de genotipos parentales es muy superior a la de individuos de genotipos no parentales (recombinantes) como puede apreciarse en la agrupacin de datos realizada para calcular las distancias entre los marcadores y el gen (apartado b). b) r NO 700 + 700 r 700 + NO 700 4646 4654 353 347

distancia (r, 700) = 7 u.m. r NO 500 + 500 r 500 + NO 500 4005 4005 994 996

distancia (r, 500) = 19,9 u.m. Nota: Se puede trabajar tambin considerando los 3 genes ligados como en los mapas de tres puntos. c) NO 500 NO 700 4247 500 700 4253 500 NO 700 746 NO 500 700 754

53

distancia (500, 700) = 15 u.m. d) Utilizara el fragmento de 700pb puesto que se encuentra ms prximo al gen de la resistencia.
IIIIIIIII Restriccin-2.

Las bandas que se observaran serian las siguientes: Digestin Bandas observadas Eco RI 6.0 + 2.0 Bam HI 7.5 + 6.5 Hind III 4.8 + 4.2 Pst I 10.0 Eco RI + Bam HI 5.5 + 2.0 + 0.5 Eco RI + Hind III 4.0 + 1.2 + 0.8 Eco RI + Pst I 2.0 + 1.0 Bam HI + Hind III 4.2 + 3.5 +1.3 Bam HI + Pst I 7.5 + 0.5 Hind III + Pst I 4.2 + 1.8
Restriccin-3.

A)

El mapa para la sonda A quedara:

E
5.4 9.3

H PH
0.7 0.5 2.1

PE H
0.6 1.0

El mapa para la sonda B quedara:

H
2.1

PE H
0.6 1.0 1.6 2.0

E
5.0 7.0

P
10.5

El mapa conjunto sera el siguiente: sonda A sonda B

E
54
5.4

H PH
0.7 0.5 2.1

PE H
0.6 1.0 2.0

E
5.0

P
10.5

b)

sonda A

sonda B

H1 H2
alelo 1
1.2 3.7

H3
17.5

H4

alelo 2 Desaparece el punto H2 respecto del alelo 1

H1
4.9

H3
17.5

H4

alelo 3 Aparece el punto H5 respecto del alelo 1

H1 H2
1.2 3.7

H3
15.0

H5 H4
2.5

alelo 4 Desaparece el punto H2 respecto del alelo 3 o aparece el punto H5 respecto al alelo 2.

H1
4.9

H3
15.0

H5 H4
2.5

c) Hibridando con las dos sondas (A y B) los diferentes alelos presentan los fragmentos siguientes (mirar en apartado b): alelo 1 alelo 2 alelo 3 alelo 4 1.2, 3.7, 17.5 4.9, 17.5 1.2, 3.7, 15.0 4.9, 15.0

por tanto los genotipos de los individuos mostrados en la electroforesis sern:

55

individuo n 1 individuo n 2 individuo n 3 individuo n 4 individuo n 5 individuo n 6

Restriccin-4.

homocigoto 1,1 [(1.2, 3.7, 17.5)] heterocigoto 1,4 [(1.2, 3.7, 17.5), (4.9, 15.0)] o heterocigoto 2,3 [(4.9, 17.5), (1.2, 3.7, 15.0)] heterocigoto 2,4 [(4.9, 17.5), (4.9, 15.0)] heterocigoto 3,4 [(1.2, 3.7, 15.0), (4.9, 15.0)] heterocigoto 1,2 [(1.2, 3.7, 17.5), (4.9, 17.5)] homocigoto 3,3 [(1.2, 3.7, 15.0)]

A 2.7 B/C 2.5 B 0.5 B 1.2 C 1.3 A

2.8

Restriccin-5.

a) Hay dos posibles soluciones dependiendo de cmo se siten los puntos de restriccin producidos por el enzima B respecto de los producidos por el enzima A si suponemos que el fragmento de 1,8 incluye el fragmento 1.0 producto de la digestin A+B el mapa resultante es: solucin 1:

B C A
0.3 0.5 1.0

B
1.5

B C
0.7 0.3

si suponemos que el fragmento de 1,8 incluye el punto 1.5 producto de la digestin A+B el mapa resultante es: solucin 2: C B A B C/AB

0.3

1.2

1.0

1.5

0.3

56

b) Si situamos los puntos de corte D en el mapa siguiendo la solucin 1 obtendremos un mapa final:

B C A

B D D A

B C D

1.2

0.3 0.5

1.0

0.6

0.4 0.5

0.7 0.3 0.5

Restriccin-6

a) Mapa de restriccin del plsmido 4.0 B

B 1.0

3.0

E E 3.5 B b) Se observaran los fragmentos E-B de 3.5 Kb y B-E de 2.5 Kb

Restriccin-7

2.5

a) mapa de restriccin para el alelo recesivo r E H

0.2 1.0

E E
0.1 0.65

HH
0.05 0.55

E
0.4

SONDA A

SONDA B

b) con la sonda A no hubiera detectado el polimorfismo

57

Restriccin-8

P E H
1.8

a)
0.2 1.0

6.2

6.8

P b) bandas que hibridan con la sonda E-H de 1 Kb

H H/E E P P/H P/E

H = HindIII

16 8 3 1 1.2 7.8

b) bandas que hibridan con la sonda H-H de 3 Kb

16 8 3 2 1 1.8 1.2 0.2 8 7.8

58

Restriccin-9

E H 2.0 1.0 4.5

A)

6.5 0.5 2.5 P EP B) Con la sonda P-P de 2.5Kb se obtendra: E: 8.5 Kb E + H: 7.5 H: 14.0 Kb H + P: 2.5 P: 2.5 E + P: 2.5 C) Con la sonda H-H de 3.0 Kb E: 8.5 Kb E + H: 2.0; 1.0 Kb H: 3.0 Kb H + P: 3.0 Kb P: 14.5 Kb E + P: 8.5; 5.5 Kb
Restriccin-10 a) mapa de restriccin

2.3

1.7 4.5 2.7 0.2 b) mapa de restriccin con XbaI. H 2.3 H E E+X: 8.5; 2.7; 0.2 H+X: 4.7; 2.7; 2.3; 1.7 1.7 4.5 2.7 XbaI 0.2 H E 59

E XbaI

c) sonda: fragmento de 2.9. E: 2.9: H: 4.7; 4.4 E+H: 2.7; 0.2 E+X: 2.7; 0.2 H+X: 2.7; 4.7
Forense 1.

a) IA = p = 0.35 IB = q = 0.10 I0 = r = 0.55

(p + q + r)2 = p2 + q2 + r2 + 2pq + 2pr + 2qr IAIA IBIB I0I0 IAIB IAI0 IBI0

P(grupo B) = P (IBIB) + P (IBI0) = q2 + 2qr = (0.10)2 + 2(0.10 x 0.55) = 0.12 b) P (A1A1) = (0.1)2 = 0.01 P (B1B3) = 2(0.2 x 0.1) = 0.04 P (C1C2) = 2(0.2 x0.2) = 0.08 P (genotipo A1A1B1B3C1C2) = 0.01 x 0.04 x 0.08 = 3.2 x 10-5 c) La probabilidad de que un indivduo del grupo B tenga el genotipo A1A1B1B3C1C2 ser el producto de sus probabilidades: P = 0.12 x 3.2 x 10-5 = 3.84 x 10-6 Luego la razn bayesiana de probabilidad ser: P (E/C) L= P(E/C)
Forense 2.

1 = 3.84 x 10
-6

= 260.416, 67

El marido es I0I0 y su mujer es, a priori, IBIB o IBI0 Dado que uno de los hijos es del grupo O, la madre ha de ser IBI0 Los hijos son: 1) I0I0 2) IAIB 3) IBIB o IBI0 a) El marido est equivocado, ya que el 1 y el 3 s pueden ser sus hijos pero el 2 no puede serlo en ningun caso. b) L= P(E/C) P (E/C)

60

P (E/C), correspondera a la probabilidad de que un hijo del supuesto padre y de la madre tenga el genotipo observado. P (E/C), correspondera a la probabilidad de que la madre y un hombre cualquiera de la poblacin tengan un hijo con el genotipo observado. Obtendremos el valor de L para cada uno de los tres hijos: Genotipo marido: I0I0 N3N4; genotipo mujer: IBI0 N1N3
Hijo 1: Genotipo : I0I0 N1N3

P(E/C) = 1 x x x = 1/8
Alelos I0 N3 Padre I0 N1 madre

P(E/C) = x x 2
Alelos I N ,N Madre
0 1

x I0 x (N1+N3) = x 1 x 0.43 x (0.1 + 0.32) = 0.045

I0 N1, N3 padre

1/8 L= 0.045
Hijo 2: Genotipo: IAIB N3N5

= 2.778

P(E/C) = 0 (es imposible que el supuesto padre y la madre tengan un hijo con este genotipo). Por tanto, L = 0
Hijo 3: Genotipo: IBIB N1N4 I0 IB

P(E/C) = 1 x x x = 1/8
Alelos I0 N4 Padre IB N1 madre

P(E/C) = P(hijo sea B) x P(hijo sea N1N4) (dado que el padre es un hombre de la poblacin). P(hijo sea B)= P(IBIB) + P(IBI0) P(IBIB) = x IB P(IBI0) = ( x I0 ) + ( x IB) P(hijo sea B) = I0 + IB = 0.43/2 + 0.15 = 0.365 P(hijo sea N1N4) = x N4 = x 0.05 = 0.025 P(E/C) = 0.365 x 0.025 = 0.0091 1/8 L= = 13.7363 0.0091

61

Forense 3.

C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Genotipos Probabilidad Genotipos Probabilidad Probabilidad total (A) (B) (genotipo A) (genotipo B) A1A2 2(0.3x0.25)= 0.15 B1B2 2(0.02x0.1)= 0.004 0.15x0.004=0.0006 A1A2 2(0.3x0.25)= 0.15 B3B4 2(0.6x0.2)= 0.24 0.036 A3A4 2(0.03x0.02)= 0.0012 B5B6 2(0.05x0.03)= 0.003 0.0000036 A5A6 2(0.3x0.1)= 0.06 B3B4 2(0.6x0.2)= 0.24 0.0144 A1A2 2(0.3x0.25)= 0.15 B3B3 (0.6)2= 0.36 0.054 A1A4 2(0.3x0.02)= 0.12 B3B2 2(0.6x0.1)= 0.12 0.00144 A4A6 2(0.02x0.1)= 0.004 B1B6 2(0.02x0.03)= 0.0012 0.0000048 A1A6 2(0.3x0.1= 0.06 B3B5 2(0.6x0.05)= 0.06 0.0036 2 A5A5 (0.3) = 0.09 B1B2 2(0.02x0.1)= 0.004 0.00036 A1A2 2(0.3x0.25)=0.15 B1B2 2(0.02x0.1)= 0.004 0.0006 A3A2 2(0.03x0.25)= 0.015 B6B2 2(0.03x0.1)= 0.006 0.00009 A3A2 2(0.03x0.25)= 0.015 B3B4 2(0.6x0.2)= 0.24 0.0036 A1A2 2(0.3x0.25)= 0.15 B3B1 2(0.6x0.02)= 0.024 0.0036 A1A3 2(0.3x0.03)= 0.018 B2B4 2(0.1x0.2)= 0.04 0.00072 A4A5 2(0.02x0.3)=0.012 B3B5 2(0.6x0.05)= 0.06 0.00072 A5A6 2(0.3x0.1)= 0.06 B3B4 2(0.6x0.2)= 0.24 0.0144

a) Los jugadores 2 y 6 podran ser los 2 jugadores extranjeros ya que poseen los genotipos ms raros (de acuerdo con las frecuencias de los alelos en la poblacin espaola). Por ejemplo, la probabilidad de que de los 15 jugadores uno tenga el genotipo A3A4B5B6 sera: P1= 15! / 14!1! (0.0000036)1(1-0.0000036)14= 0.0001 b) Sin tener en cuenta a los 5 jugadores que no se han hecho la prueba: La probabilidad de observar el genotipo A1A2B1B2 en la poblacin es 0.0006, y por tanto, P (E/C) L= P(E/C) = 0.0006 1 = 1666,67

En este caso, es 1666 veces ms probable la evidencia si el sospechoso es culpable que si el culpable no es l sino otra persona.

62

TCNICAS DE ANLISIS GENTICO

PRCTICAS

63

64

PRCTICA N1: LOCALIZACIN DE MUTACIONES EN LOS GRUPOS DE LIGAMIENTO DE Drosophila melanogaster

OBJETIVO

Localizar una mutacin recesiva desconocida de Drosophila melanogaster en uno de los grupos de ligamiento.
INTRODUCCIN

Cuando se detecta una mutacin, para saber si se trata de una mutacin de un gen desconocido o si ha sido descrita anteriormente, el primer paso que se debe realizar es su asignacin a un grupo de ligamiento determinado. Para ello se debe cruzar (en el caso de Drosphila melanogaster) una hembra virgen (pupa) de la cepa con la mutacin problema, a, con un macho de una cepa "marcadora" que presente dos mutaciones localizadas, una en el segundo cromosoma (m2), y la otra en el tercer cromosoma (m3), siendo ambas mutaciones recesivas. Tericamente la mutacin puede estar en el cromosoma X (el cromosoma Y prcticamente no tiene informacin), en el cromosoma 2, en el cromosoma 3 en el cromosoma 4. Analicemos cada caso por separado: A. Supongamos que la mutacin a se encuentra en el cromosoma X. P F1 a m2+ m3+ a m2+ m3+ a m2+ m3+ a+ m2 m3

a+ m2 m3 m2 m3 a m2+ m3+ m2 m3

Todos los machos presentan la mutacin a, y todas las hembras son fenotpicamente normales. B. Supongamos que la mutacin se encuentra en el cromosoma 2. P F1 a m2+ m3+ a m2+ m3+

x
a m2+ m3+ a+ m2 m3

a+ m2 m3 a+ m2 m3

Todos los individuos de F1 son de fenotipo salvaje. Los gametos que pueden formar son los siguientes: Machos a m2+ m3+ a m2+ m3 a+ m2 m3 a+ m2 m3+ Hembras . a m2+ m3+ a m2+ m3 a+ m2 m3 a+ m2 m3+ a m2 m3+ a m2 m3 a+ m2+ m3+ a+ m2+ m3

Las hembras pueden producir cuatro gametos ms que los machos debido al fenmeno de recombinacin, que no se da en los machos de esta especie.

65

La combinacin de estos gametos da lugar en la F2 a los siguientes fenotipos: + a + + + a + + + + m2 + + m3 m2 m3 + m3,

no apareciendo nunca los fenotipos a m2 + ni a m2 m3, es decir, si la mutacin problema se encuentra en el cromosoma 2 nunca aparecer con la mutacin marcadora del mismo cromosoma. C. Supongamos que la mutacin se encuentra en el cromosoma 3. El razonamiento es anlogo al caso anterior, y por lo tanto los fenotipos que aparecern y no aparecern en la F2 son los siguientes: aparecern: + a + + + a + + no aparecern: + + m2 + + m3 m2 m3 m2 + a + m3 a m2 m3

Se observa, como en el caso anterior, que la mutacin problema no aparece junto a la mutacin marcadora de su mismo cromosoma. D. Por ltimo, supongamos que se encuentra en el cromosoma 4. P F1 m2+ m3+ a m2+ m3+ a

x
m2+ m3+ a m2 m3 a+

m2 m3 a+ m2 m3 a+

Los resultados de la F2 sern los tpicos de un trihibridismo: 27/64 9/64 9/64 9/64 3/64 3/64 3/64 1/64 + + + m2 + + + m3 + + + a m2 m3 + m2 + a + m3 a m2 m3 a

En contraste con los dos casos anteriores, la mutacin problema aparecer con cualquiera de las dos mutaciones marcadoras.

MATERIAL
Como cepa marcadora se utiliza la cepa ebony vestigial (e1 vg11). La mutacin ebony da lugar a un fenotipo con cuerpo negro y se encuentra situada en el cromosoma 3. La mutacin vestigial da lugar a alas vestigiales, y se encuentra en el cromosoma 2.

66

Las mutaciones objeto de estudio son: Cepa A B Mutacin a b Fenotipo color de ojos blanco ojos oscuros

DESARROLLO DE LA PRCTICA
1 semana: Situar en una botella cuatro pupas (hembras) de la mutacin problema y cuatro machos de la cepa marcadora (generacin P). 2 semana Retirar los individuos de la generacin P, comprobando que se haba hecho el cruce correcto y que hay larvas en el cultivo. 3 semana: Observar los individuos de la F1. En el caso de que la mutacin no se encuentre en el cromosoma X siembra en una nueva botella de cuatro parejas de la F1. 4 semana: Retirar los individuos de la F1. 5 semana: Observar y contar los individuos de la F2.
ANLISIS DE LOS RESULTADOS

En el caso de que en la F1 comprobemos que la mutacin problema no est en el cromosoma X, teniendo en cuenta el cruce efectuado y puesto que en los machos de Drosophila no se obtienen gametos recombinantes, podremos extraer diferentes conclusiones a partir de los distintos fenotipo observados en la F2: 1.- Si aparecen todos los tipos posibles de dobles mutantes e incluso triples mutantes, podemos concluir que la mutacin problema se encuentra en el cromosoma 4. Lo comprobaremos mediante un test de 2. 2. Cuando aparezca un doble mutante con la mutacin problema y una mutacin marcadora, concluiremos que la mutacin problema no pertenece al mismo grupo de ligamiento que dicha mutacin marcadora. 3. Si la mutacin objeto de estudio aparece en la F2 junto con uno solo de los marcadores, no implica necesariamente que se encuentre en el mismo cromosoma que la mutacin marcadora con la que no aparece, sino que puede encontrarse en el cromosoma 4, y su no-aparicin puede ser debida al azar, por un escaso nmero de individuos en la F2. Para poder determinar cual de las dos hiptesis es cierta recurriremos al uso del test de la ji-cuadrado. 2 para determinar si la mutacin se encuentra en el mismo cromosoma que la mutacin marcadora con la que no aparece en la F2: si esta hiptesis es cierta, los fenotipos posibles, sin tener en cuenta la otra mutacin marcadora, son: a +, + +, y + m, en la proporcin 1:2:1. La hiptesis se contrastar mediante una 2 con 2 grados de libertad. 2 para determinar si la no-aparicin de estas mutaciones es debida al azar (luego se encuentra en el cromosoma 4): los fenotipos posibles son + +, a +, + m, y a m en la proporcin 9:3:3:1. La hiptesis se contrastar mediante una 2 con 3 grados de libertad.

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PROBABILIDAD DE DISTINTOS VALORES DE X 2 . Probabilidad 0.30 0.20 1.07 1.64 2.41 3.22 3.67 4.64 4.88 5.99 6.06 7.29 7.23 8.56 8.38 9.80 9.52 11.03 10.66 12.24 11.78 13.44 12.90 14.63 14.01 15.81 15.12 16.99 16.22 18.15 17.32 19.31 22.78 25.04 28.17 30.68 33.53 36.25 54.72 58.16

df 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 20 25 30 50

0.95 0.004 0.10 0.35 0.71 1.15 1.64 2.17 2.73 3.33 3.94 4.58 5.23 5.89 6.57 7.26 10.85 14.61 18.49 34.76

0.90 0.016 0.21 0.58 1.06 1.61 2.20 2.83 3.49 4.17 4.87 5.58 6.30 7.94 7.79 8.55 12.44 16.47 20.60 37.69

0.70 0.15 0.71 1.42 2.20 3.00 3.83 4.67 5.53 6.39 7.27 8.15 9.03 9.93 10.82 11.72 16.27 20.87 25.51 44.31

0.50 0.46 1.39 2.37 3.36 4.35 5.35 6.35 7.34 8.34 9.34 10.34 11.34 12.34 13.34 14.34 19.34 24.34 29.34 49.34

0.10 2.71 4.61 6.25 7.78 9.24 10.65 12.02 13.36 14.68 15.99 17.28 18.55 19.81 21.06 22.31 28.41 34.38 40.26 63.17

0.05 3.84 5.99 7.82 9.49 11.07 12.59 14.07 15.51 16.92 18.31 19.68 21.03 22.36 23.69 25.00 31.41 37.65 43.77 67.51

0.01 6.64 9.21 11.35 13.28 15.09 16.81 18.48 20.09 21.67 23.21 24.73 26.22 27.69 29.14 30.58 37.57 44.31 50.89 76.15

0.001 10.83 13.82 16.27 18.47 20.52 22.46 24.32 26.13 27.88 29.59 31.26 32.91 34.53 36.12 37.70 45.32 52.62 59.70 86.66

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PRCTICA N 2: ELABORACIN DE MAPAS CROMOSMICOS MEDIANTE RECOMBINACIN EN Drosophila melanogaster.

OBJETIVO

A partir de las cepas homocigticas suministradas, una triple mutante y otra normal, de Drosophila melanogaster, obtener los datos experimentales que permitan ordenar los genes y estimar sus distancias, comprobando posteriormente la concordancia de nuestros datos experimentales con los reales.
INTRODUCCIN

La adscripcin de un nuevo mutante a un determinado grupo de ligamiento en el genoma de Drosophila (prctica 1), es un paso previo para situar dicho gen en un lugar (locus, pl. loci) concreto entre los dems genes de su mismo grupo de ligamiento, es decir, a la izquierda y derecha de dos genes "marcadores" cuya situacin sea conocida, y a una distancia dada, expresada en frecuencias de recombinacin, respecto de dichos genes. La localizacin de un nuevo mutante en el mapa gentico requiere, normalmente, bastante trabajo, aunque el diseo experimental sea relativamente simple. Una vez conocido el grupo de ligamiento, habr que buscar una cepa marcadora, con al menos dos mutaciones de situacin conocida y que afecten al fenotipo de manera distinta que nuestro mutante problema, para evitar problemas de interaccin o epistasia. Luego, habr que sintetizar una cepa triple mutante, normalmente obteniendo una F2, y seleccionando de entre los individuos de esta F2 aquellos que manifiesten las mutaciones "marcadoras" y la mutacin problema, simplemente con objeto de eliminar los individuos normales que disminuiran la probabilidad de encontrar en la F3 los recombinantes buscados. Una vez obtenido el triple mutante, habr que proceder como se indica en el protocolo experimental de esta prctica (vase el esquema de trabajo): CEPA TRIPLE MUTANTE X CEPA SALVAJE F1 TRIPLE HETEROZIGOTICA HEMBRAS DE LA F1
*

F2: MANIFESTACION FENOTIPICA DE LOS GAMETOS PRODUCIDOS POR LAS HEMBRAS DE LA F1 Si se han elegido los "marcadores" adecuados (por ejemplo, en un cromosoma de 100 centimorgans, un marcador situado en el locus 33 y otro en el 66), y el mutante problema est relativamente prximo a uno de ellos, la localizacin puede terminar en este punto, pero normalmente no ocurre as. Este primer cruce situar a nuestra mutacin de una manera aproximada y habr que buscar nuevos marcadores, esta vez lo ms cercanos posible a nuestra mutacin para, realizando de nuevo el esquema anterior, localizar lo ms precisamente su situacin relativa. * En Drosophila slo recombinan las hembras

MACHOS TRIPLE MUTANTES

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MATERIAL

Cepas utilizadas en la prctica: a) Cepa triple mutante a cv sn. Las tres mutaciones estn situadas en el cromosoma X y son recesivas respecto de su alelo normal. Las mutaciones cv y sn se localizan en el mapa en las posiciones 1-13.7 y 1-21.0 respectivamente. b) Cepa triple mutante ri b ss. Las tres mutaciones estn situadas en el cromosoma 3 y son recesivas respecto de su alelo normal. Las mutaciones ri y ss se localizan en las posiciones 3-46.8 y 3-58.5 respectivamente. c) Cepa "Oregon-R". Tipo salvaje. Descripcin del fenotipo correspondiente a las mutaciones utilizadas: a: ojos blancos. b: ojos de color oscuro. cv (crossveinless): ausencia de la segunda vena transversal (ver figura 1). ri (radius incompletus): 1 vena longitudinal truncada (expresividad variable). sn (singed): quetas cortas y enroscadas (ver figura 1). ss (small spineless): quetas cortas.

Radio incompleto

Figura 1.-Esquema de los fenotipos cv, sn y ri:

DESARROLLO DE LA PRCTICA
1 semana: Reconocimiento de las mutaciones del triple mutante. Cada alumno proceder a efectuar un cruzamiento entre 6 hembras vrgenes triples mutantes y 4 machos de la cepa Oregon-R. (Para obtener las hembras vrgenes se separarn stas en estado de pupa). Los cultivos se mantendrn a 25C. 2 semana: Observar los cruces efectuados la semana anterior, comprobando si hay descendencia (larvas). Eliminacin de los padres de los cultivos que tengan descendencia. 3 semana: Se observar el fenotipo de la F1, es decir, la descendencia adulta del cruce efectuado la 1 semana y se realizaran 2 nuevos cruces. En el caso de los genes ligados al cromosoma X se cruzarn 4 hembras y 4 machos procedentes de la F1 (estos ltimos sern triple mutantes por ser hemicigticos para los genes del X y sirven para el cruce prueba). Para el caso de los genes autosmicos se cruzarn 4-5 hembras vrgenes de la F1 con machos triple mutantes que se suministran. 4 semana: Se observarn los cruzamientos efectuados la tercera semana y se eliminarn los padres de dichos cultivos. 5 semana: Se observarn y contarn las distintas clases fenotpicas de los individuos emergidos en la F2, anotndose los resultados. 70

ESQUEMA DE TRABAJO
P F1 Resultado del cruce prueba a cv sn a cv sn a cv sn + + + HEMBRAS a cv sn/a cv sn a cv +/a cv sn a + sn/a cv sn + cv sn/a cv sn a + +/a cv sn + cv +/a cv sn + + sn/a cv sn + + +/a cv sn

Mapa1 (genes ligados al cromosoma X)

x x

+ + + Y a cv sn Y MACHOS a cv sn/Y a cv +/Y a + sn/Y + cv sn/Y a + +/Y + cv +/Y + + sn/Y + + +/Y (cruce prueba)

Mapa 2 (genes autosmicos)

P F1 Resultado del cruce prueba

ri b ss ri b ss ri b ss + + + HEMBRAS ri b ss/ri b ss ri + ss/ri b ss ri b +/ri b ss + b ss/ri b ss ri b +/ri b ss + + ss/ri b ss + b +/ri b ss + + +/ri b ss

x x

+ + + + + + ri b ss ri b ss MACHOS ri b ss/ri b ss ri b ss/ri b ss ri b +/ri b ss + b ss/ri b ss ri + +/ri b ss + + ss/ri b ss + b +/ri b ss + + +/ri b ss (cruce prueba)

De la descendencia obtenida del cruce prueba se observarn las dos clases que aparezcan en menor proporcin, que deben corresponder a los dobles recombinantes. Con los dobles recombinantes podremos determinar el orden de los tres genes en el cromosoma. Para estimar las distancias entre el gen central y cada uno de los genes extremos calcularemos la frecuencia de recombinacin sumando las frecuencias de cada uno de los recombinantes simples con la frecuencia de dobles recombinantes. A partir de las frecuencias de recombinacin, se calcularn las distancias genticas entre los tres genes problema y se construir el mapa correspondiente. La distancia entre los genes extremos, calculada a partir de la frecuencia de recombinantes entre dichos genes, puede ser menor que la suma de las distancias entre el gen central y cada uno de los genes extremos. Esta discrepancia se debe a la existencia de dobles entrecruzamientos, que puede hacer que genes ampliamente separados aparezcan ms cercanos de lo que lo estn realmente sobre el cromosoma. Esta discrepancia se puede minimizar aplicando la funcin de mapa.

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PRCTICA N3: LOCALIZACIN CROMOSMICA PRECISA DE GENES MEDIANTE EL USO DE DELECIONES EN DROSOPHILA MELANOGASTER
OBJETIVO

Localizar, de la manera ms precisa posible un gen en un cromosoma a partir del resultado de las pruebas de complementacin con diferentes deleciones cromosmicas.

INTRODUCCIN
Una forma clsica de determinar la posicin cromosmica de un gen, es mediante el clculo de las frecuencias de recombinacin frente a genes de localizacin conocida (como se vio en la prctica 2). Mediante este mtodo podemos obtener la distancia gentica entre dos genes y conocer sus posiciones relativas. Sin embargo, la precisin de los mapas genticos puede no ser muy grande y, lo que es ms importante, no se puede trasladar la posicin relativa de un gen en un cromosoma, estimada por recombinacin a una posicin fsica en el patrn de bandas e interbandas del cromosoma en cuestin (ver figura). Un sistema para identificar, de forma mucho ms precisa, la posicin de un gen en un cromosoma, implica la utilizacin de cepas con deleciones cromosmicas de extensin y posicin conocidas. Los resultados de cruces entre la cepa con una mutacin en el gen que se desea localizar, y diferentes cepas con diferentes deleciones cromosmicas, de alguna regin del cromosoma previamente estabecida, pueden ser altamente informativos sobre la posicin del gen en cuestin. La cuestin clave que se trata de resolver con dichos cruces es, si una delecin dada complementa o no con la mutacin problema. Si la mutacin no es complementada por el cromosoma que contiene la delecin, es porque el gen mutado est incluido en la regin delecionada y, por tanto, no existe copia normal del gen. Este resultado fija pues unos lmites a la ubicacin fsica del gen en cuestin (los lmites de la delecin). Si por el contrario, el cromosoma con la delecin s complementa a la mutacin, recuperndose el fenotipo normal, el gen mutado queda claramente fuera de la regin delecionada (existiendo por tanto una copia normal del gen, en el cromosoma portador de la delecin). Esta informacin tambin es muy valiosa por cuanto acota las regiones donde no se encuentra el gen en cuestin. Mediante la correcta interpretacin de la combinacin de resultados positivos y negativos, en las pruebas de complementacin con las diferentes deleciones, se puede llegar a determinar de forma bastante precisa la posicin fsica de un gen. Los cromosomas portadores de deleciones cromosmicas presentan las siguientes caractersticas: 1) Son letales en homocigosis, por lo que se mantienen en heterocigosis con cromosomas equilibradores. 2) Un individuo con un cromosoma con un alelo mutante recesivo de un gen, y en el homlogo, una delecin del segmento que contiene dicho gen, presenta fenotipo mutante (pseudodominancia). 3) Citolgicamente, una delecin cromosmica se puede detectar porque en heterocigosis con un cromosoma normal, se produce un lazo de deficiencia (ver figura). El anlisis detallado de estos lazos en Drosophila melanogaster permite conocer, con relativa precisin, qu bandas estn ausentes en el cromosoma con la delecin, con lo cual se pueden establecer los lmites de la misma. En Drosophila melanogaster, los cromosomas politnicos presentan una estructura microscpica con alternancia de bandas oscuras e interbandas claras, fcilmente observables. En las glndulas salivales, el patrn de bandas de los cromosomas se mantiene prcticamente inalterado en todas las clulas, en el mismo o en distintos individuos. De esta forma se pueden reconocer diferentes regiones en cada cromosoma.

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As, los cromosomas politnicos de D. melanogaster se han dividido en 102 secciones. El cromosoma X contiene las secciones 1 a la 20, el 2 cromosoma de la 21 a la 60, el 3 de la 61 a la 100 y el 4 de la 101 a la 102. Cada una de estas secciones se subdivide en subsecciones designadas por letras (A, B, C, D, E, y F). Cada una de estas subsecciones, a su vez, se subdivide en nmeros que corresponden al nmero de bandas observables al microscopio.
DESARROLLO DE LA PRCTICA Disponemos de una cepa homocigtica para cierta mutacin recesiva que produce ojos oscuros (mutacin b). Previamente hemos determinado que esta mutacin se encuentra en el cromosoma 3 y la hemos cartografiado con respecto a otras mutaciones del mismo cromosoma. Adems, mediante estudios previos de complementacin con deleciones de rango amplio hemos conseguido determinar que dicha mutacin se encuentra entre las secciones 64 a 67 (ambas incluidas) del cromosoma 3. En esta prctica hemos de tratar de precisar al mximo la posicin de la mutacin. Para ello disponemos de un conjunto de cepas portadoras, junto a un cromosoma homlogo equilibrador, de un cromosoma con una delecin cromosmica de un regin concreta del cromosoma 3 comprendida entre las secciones 64 y 67 (ver tabla). Cruzaremos la cepa mutante (cepa B) con cada una de las cepas con deleciones, y en funcin de los resultados de los diferentes cruces (complementacin o no complementacin), estableceremos unos lmites para la localizacin de la mutacin B.

Deficiencia Df(3L)89 Df(3L)90 Df(3L)91 Df(3L)92 Df(3L)94 Df(3L)98

Puntos de rotura inicio fin 64C 65C 65A 65F 65F 66B 66B 66C 66C 66E 66E 67D

Equilibador TM3, Ser TM6B, Tb TM6B, Tb TM3, Sb, Ser TM2, Ubx130 TM3, Sb

Otras mutaciones w, e pbl, w e, p[p] ri, pbl

Fenotipos asociados a las mutaciones dominantes de los equilibradores: Ser (Serrate) = alas con los bordes rotos. Tb: q uetas extra Sb (Stubble) = quetas recortadas, truncadas. Tb (Tubby) = cuerpo rechoncho, quetas extra en el hmero. Ubx130 = balancines ms grandes, con pelitos Fenotipos asociados a las otras mutaciones recesivas w (white) = ojos blancos. e (ebony) = cuerpo oscuro. ri (radio incompleto). pbl (pebble) = ojos marrn rojizo. p[p] (peach) = ojos anaranjados.
Esquema de cruzamiento: P: F1:

Balancn

b b

Df TM3-Ser

b Df

b TM3-Ser

b Df

b TM3-Ser

Normales Alas serrate (complementacin)

Ojos oscuros Alas serrate (no complementacin)

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1 semana: Reconocimiento de las mutaciones de las cepas con deleciones (sobre todo las mutaciones dominantes marcadoras de los cromosomas equilibradores) y de la cepa problema (cepa B). Cada pareja de alumnos realizar tres cruces con hembras vrgenes de la cepa B (ojos oscuros) y machos de tres cepas con deleciones diferentes. 2 semana: Eliminamos los individuos parentales observando su nmero y fenotipo. Comprobamos si hay descendencia. 3 semana: Procedemos al anlisis fenotpico de la F1. Interpretacin de los resultados (complementacin o no de las deleciones) que nos permitir localizar, de forma bastante precisa, la mutacin b en una regin limitada del cromosoma 3.

Lazo de inversin

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PRCTICA N4: EXTRACCIN DE DNA PLASMDICO A PEQUEA ESCALA Y ELABORACIN DE UN MAPA DE RESTRICCIN DE UN PLSMIDO.
OBJETIVO

1.-Extraccin de DNA plasmdico a pequea escala. 2.-Digestin con enzimas de restriccin. 3.-Separacin de los fragmentos en un gel de agarosa. 4.-Construccin del mapa de restriccin. Para el desarrollo de la prctica se utilizara el plsmido pUC18 (figura 1) que contiene un inserto de 6.5 Kb del elemento transponible bilbo de Drosophila subobscura.
PROTOCOLOS 1.- Extraccin de DNA plasmdico a pequea escala

Existen distintos mtodos para obtener DNA plasmdico a partir de cultivos bacterianos. Cualquiera de ellos consta de tres pasos: i) crecimiento del cultivo bacteriano, ii) recogida y lisis bacteriana y iii) aislamiento del DNA plasmdico. El protocolo que vamos a seguir es un procedimiento rpido de extraccin, sobre el cual se puede obtener ms informacin en Sambrook, Fritsch y Maniatis (1989). Molecular cloning. A laboratory manual. 2 edicin. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Pgs.:1.21-1.52. Otras referencias de inters: DAVIS, L.G., DIBNER, M.D., and BATTEY, J.F. (1986). Basic Methods in Molecular Biology. Elsevier HACKETT, P.B., FUCHS, J.A., and MESSING, J.W. (1984). An introduction to recombinant DNA Techniques. Basic experiments in Gene Manipulation. Benjamin Cummings Publ. Comp. HARDY, K.G. (1987). Plasmids. A prctical approach. IRL Press. PRITCHARD, R.H. and HOLLAND, L.B. (1985).Basic Cloning Techniques. A Manual of Experimental Procedures. Blackwell Scientific Publ. RICKWOOD, D., and HAMES, B.D. (1990). Gel Electrophoresis of Nucleic Acids. A prctical Approach. 2nd ed. IRL Press. WATSON, J.D., GILMAN, M.,, WITKOWSKI, J. and ZOLLER, M. (1992). Recombinant DNA. 2nd ed. Freeman and Company.
Crecimiento del cultivo bacteriano

1.-Sembrar colonias aisladas en 4 ml de medio LB (10 gr Bacto-triptona, 5 gr Extracto de levadura, 10 gr NaCl, 950 ml H2O) con ampicilina (4 l de una solucin de ampicilina 50 mgr/ml). 2.- Incubar el cultivo durante toda la noche a 37C, con agitacin. 3.- Centrifugar 1.2 ml del cultivo 30 seg. a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante y en el mismo tubo centrifugar otros 1.2 ml. y eliminar el sobrenadante.

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Recogida, lisis alcalina y aislamiento del DNA plasmdico.

4.-Resuspender el sedimento en 100 l de tampn GET (Glucosa 50mM, Tris-HCl 25mM, EDTA 10mM, pH 8) fro. Es esencial que el pellet bacteriano est bien disperso en la solucin get, para lo cual se puede utilizar el vibrador agitando simultneamente dos tubos que se toquen en sus bases. 5.- Incubar en hielo 5 min. 6.- Aadir 200 l de solucin alcalina (NaOH 0.2M, 1%SDS). Mezclar invirtiendo el tubo rpidamente cinco veces. 7.- Incubar en hielo 5 min. 8.- Aadir 150 l de Solucin III (tampn actico-acetato potsico, pH 4.8, 3M respecto al potasio y 5M respecto al acetato). Mezclar mediante inversiones . 9.- Incubar en hielo 5 min. 10.- Centrifugar a 12.000 rpm durante 5 min. 11.- Transferir el sobrenadante (400 l) a un tubo nuevo. La lisis se consigue por la accin del detergente (SDS). La presencia de NaOH en la solucin alcalina eleva el pH provocando la desnaturalizacin del DNA del cromosoma bacteriano. La adicin de la Solucin III produce una rpida neutralizacin del pH que da lugar a reasociaciones incorrectas del DNA cromosmico generando as una maraa de DNA insoluble que precipita fcilmente. Adems, el potasio de esta solucin forma complejos con el SDS y las proteinas, que tambin precipitan fcilmente. El DNA plasmdico, por su menor tamao y por adoptar un alto grado de superenrollamiento, se desnaturaliza en menor medida y por tanto renaturaliza fcilmente y lo hace correctamente, permaneciendo soluble.
Precipitacin en etanol

12.- Aadir 2 volmenes de etanol absoluto fro. La precipitacin en etanol es el mtodo ms utilizado para concentrar cidos nucleicos, aunque tambin puede utilizarse isopropanol. La precipitacin requiere la presencia de una concentracin moderada de cationes monovalentes. Para ms informacin consultar Sambrook, Frisch y Maniatis (1989) pags: E10-E11. 13.- Mezclar bien invirtiendo el tubo y dejar en hielo al menos 10 min. Clsicamente la precipitacin del DNA se haca a 20C, pero se ha comprobado que la precipitacin en hielo es igualmente efectiva. 14.- Centrifugar 10 min. 15.- Lavar con 500 l de etanol 70%. 16.- Centrifugar 10 min. 17.- Eliminar el sobrenadante y secar el pellet al vaco. 18.- Resuspender en 50 l de LTE (Tris 10 mM, EDTA 0.11 mM)+ RNAsa (50 g/ml). 19.- Comprobar la extraccin mediante una electroforsis en gel de agarosa de 5 l de la solucin de DNA

2.-Digestin con enzimas de restriccin.

La digestin con enzimas de restriccin es uno de los protocolos experimentales ms utilizados en Biologa Molecular. Las endonucleasas de restriccin, o simplemente enzimas de restriccin, reconocen cortas secuencias del DNA (secuencias concretas generalmente de 4-6 pb), denominadas sitios de restriccin. El enzima se une a estas secuencias y produce una rotura en cada una de las dos bandas del DNA, obtenindose

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as lo que se denomina un fragmento de restriccin. Una reaccin estndar para un volumen de 20 l contiene los siguientes elementos: -solucin de DNA en H2O hasta completar un volumen de 18 l. -tampn especfico del enzima (10x) 2 l. -enzima de restriccin (2-5 unidades) 0.5 l. Las proporciones indicadas son las habitualmente utilizadas para digerir 0.2-1 g de DNA. Los tampones para los distintos enzimas de restriccin difieren fundamentalmente en la concentracin de NaCl. Globalmente los enzimas preparados comercialmente pueden adscribirse a tres categoras, dependiendo de que funcionen mejor a baja (L), media (M) o alta (H) concentracin salina. Una unidad de enzima se define como la cantidad de enzima requerido para digerir totalmente 1 g de DNA en 1 h. Sin embargo, se suele trabajar con un exceso de enzima. Para ms informacin Sambrook, Fritsch y Maniatis (1989) pags. 5.1-5.32.
20.- Prepararemos las siguientes digestiones:

DNA+H2O Tampn B Tampn H Enzima

HindIII 18 l 2 l 0.5 l

SalI 18 l 2 l 0.5 l

XbaI 18 l 2 l 0.5 l

Hind+Sal Hind+Xba 18 l 18 l 2 l 2 l 0.5 l 0.5 l

Sal+Xba 18 l 2 l 0.5 l

En el caso de digestiones dobles, pueden hacerse simultneamente si ambos enzimas tienen los mismos requerimientos salinos y temperaturas ptimas. En caso de requerir concentraciones salinas diferentes, debe realizarse una primera digestin con el enzima de menor requerimiento salino, ajustar la concentracin requerida para el segundo enzima y posteriormente efectuar la digestin. 21.- Las digestiones se incubarn a 37C un mnimo de 2 h. La temperatura ptima de cada enzima es un parmetro importante a tener en cuenta, siendo 37C para la mayora de enzimas de restriccin. Un procedimiento habitualmente empleado es efectuar las digestiones enzimticas durante toda la noche, para asegurar la digestin total del DNA. 22.- Detener las reacciones aadiendo 3 l de tampn de carga de electroforesis (EDTA 100 mM, pH 8.0, glicerol 50%, azul de bromofenol 0.5%).
3.- Separacin de los fragmentos en un gel de agarosa.

La agarosa es un polmero lineal de D-galactosa y 3,6-anhidro-L-galactosa. Los geles de agarosa se preparan calentndola en el tampn deseado hasta que se obtiene una solucin completamente clara y transparente. La solucin caliente se vierte en un recipiente en el que polimeriza, formando una matriz cuya densidad viene determinada por la concentracin de agarosa. Cuando a travs del gel se aplica un campo elctrico, el DNA, que a pH neutro est cargado negativamente, migra hacia el nodo. Un fragmento de DNA lineal migrar diferencialmente en el gel dependiendo de su tamao y a una velocidad inversamente proporcional al log10 del nmero de pares de bases que contiene. Es decir, las molculas ms largas migrarn ms lentas que las ms cortas, 77

debido al mayor rozamiento y a la menor eficiencia para atravesar los poros del gel. Por tanto, la electroforesis en gel de agarosa no slo permite separar los fragmentos de DNA sino tambin estimar su tamao. Se ha comprobado que existe una relacin lineal entre el logaritmo de la movilidad electrofortica del DNA y la concentracin de agarosa en el gel, por lo que sta depender del tamao de los fragmentos a separar (fig. 2). Por ejemplo, una concentracin de agarosa del 0.8% resuelve bien fragmentos en un rango de 0.8-10 Kb. Adems de la concentracin de agarosa en el gel, hay un conjunto de parmetros que hay que tener en cuenta al efectuar una separacin electrofortica, tales como el voltaje a aplicar, la direccin del campo elctrico, la temperatura, el tampn de electroforesis, etc. Para ms informacin consultar Sambrook, Fritsch y Maniatis (1989), cap. 6. 23.- Se proceder a la preparacin del gel, a partir de agarosa al 0.8% (p/v) en tampn TBE 1x (0.1 M Tris-borato, 0.002 M EDTA, pH 8.0). 24.- Dejar enfriar la solucin hasta aproximadamente 60C y aadir bromuro de etidio hasta una concentracin final de 0.5 mg/ml. El bromuro de etidio es un agente que se intercala entre las bases de DNA y que es indispensable para poder visualizar los fragmentos de DNA a la luz uv. Este compuesto es un poderoso agente carcingeno que debe utilizarse con extrema precaucin. 25.- Verter la solucin todava caliente en una cubeta de electroforesis debidamente preparada y colocar el formador de pocillos (peine) en la posicin adecuada. 26.- Dejar que la agarosa gelifique (aproximadamente 30 min a temperatura ambiente). 27.- Sumergir el gel en el tanque de electroforesis. Aadir el tampn de electroforesis TBE 1x, de modo que rebase por encima del gel aproximadamente 1 mm. 28.- Tras un pulso en la centrifuga se cargarn las muestras en el gel. Adems de las digestiones se incluir un marcador de pesos moleculares. Las muestras contienen el tampn de cargado que se utiliza para incrementar la densidad de las mismas, darle color y poder seguir visualmente el desarrollo de la electroforesis. 29.- El gel se dejar correr aproximadamente durante 2 h a 100 volt. 30.- Observar el gel a la luz UV y realizar una fotografa del mismo incluyendo una regla que permitir estimar posteriormente el tamao de los fragmentos.

4.- Construccin del mapa de restriccin. Debido a la secuencia especfica del DNA, una enzima de restriccin determinada produce un conjunto de fragmentos de restriccin diferente del que otra enzima de restriccin distinta pueda originar sobre la misma molcula de DNA. El nmero y tamao de los distintos fragmentos puede estimarse mediante la separacin electrofortica de los mismos. Un mapa en el que se representan los sitios de corte del DNA por un particular enzima de restriccin, se denomina mapa de restriccin.

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Para realizar el mapa de restriccin se tendr en cuenta el nmero y el tamao de los fragmentos de restriccin obtenidos en las digestiones simples y dobles con los tres enzimas de restriccin seleccionados.

(2,7 kb)

Figura 1.-Esquema del plsmido pUC18 y sus sitios de restriccin.

Figura 2.-Relacin entre el tamao del DNA y su movilidad electrofortica.

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PRCTICA N 5: LIGAMIENTO DE UN FENOTIPO MUTANTE A UN MARCADOR MOLECULAR

OBJETIVO

Deteccin de ligamiento entre un marcador molecular y un gen responsable de un fenotipo mutante.

INTRODUCCIN

El primer objetivo que se tiene cuando se identifica un nuevo gen en una especie es, frecuentemente, la determinacin de su localizacin cromosmica. La existencia del nuevo gen suele ser conocida por la aparicin de un fenotipo diferente del normal o tipo salvaje. El sistema tradicional de situar un gen dentro de un mapa gentico preexistente es la observacin del ligamiento de dicho fenotipo a otros genes cuya localizacin cromosmica haba sido previamente caracterizada. La introduccin de tcnicas de Gentica Molecular ha permitido aumentar considerablemente el nmero de estos marcadores genticos situados sobre los cromosomas, los cules pueden ser de diferente naturaleza como por ejemplo polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restriccin (RFLPs), fragmentos de DNA obtenidos mediante la tcnica de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), etc. En 1990 (Williams y colaboradores) desarrollaron un nuevo mtodo basado en la tcnica de PCR que tena como caracterstica principal que no se requera, a priori, ninguna informacin sobre secuencias de nucletidos presentes en el genoma, ni se necesitaba disponer de un fragmento de DNA aislado que pudiera posteriormente utilizarse como sonda para la deteccin de polimorfismos moleculares. La tcnica se denomin RAPD-PCR o simplemente RAPD (DNA polimrfico amplificado al azar, random amplified polymorphic DNA, en ingls). El mtodo utiliza un cebador corto de solamente 10 nucletidos el cual puede ser complementario por simple azar a multitud de sitios dentro del genoma. Cuando dos zonas complementarias al cebador se encuentran situadas en la orientacin correcta, en cadenas opuestas y a corta distancia, se puede producir la amplificacin del fragmento de DNA que delimitan. Puesto que esto puede ocurrir en diferentes posiciones del genoma, el resultado de una misma amplificacin suele ser la produccin por trmino medio de 8 9 bandas. El nmero y la intensidad de las bandas producidas depende mucho de las condiciones de amplificacin, incluyendo la cantidad de DNA de partida, la temperatura de hibridacin, etc. Si se consiguen unas condiciones de buena repetibilidad, se puede detectar la presencia de polimorfismos en el DNA, entre cepas o individuos que suelen deberse al cambio de algn nucletido de la secuencia complementaria al cebador o a la presencia de deleciones, inserciones y otras alteraciones de la secuencia de DNA. Desde su desarrollo la tcnica de RAPD se ha utilizado con mltiples propsitos. Por ejemplo, se han construido mapas en muchas especies en las que prcticamente no se dispona de marcadores clsicos, es decir variacin morfolgica asociada a diferencias genticas. Tambin se han utilizado para detectar variacin gentica en las poblaciones. La deteccin de un marcador gentico estrechamente ligado al gen que produce cierto fenotipo mutante, puede permitir llevar a cabo alguna aproximacin para el aislamiento de dicho gen. Uno de estos mtodos por ejemplo es la clonacin posicional, basada en el mapa. Una estrategia que se puede utilizar es la de detectar un marcador molecular que 80

se encuentre a una distancia muy pequea del gen problema. Tan pequea que se podra usar ese marcador como sonda para la bsqueda y aislamiento de un clon (generalmente con un gran inserto) que contuviera, junto al marcador, el gen problema. Este tipo de estrategias requiere el anlisis y deteccin de una gran cantidad de marcadores. Posteriormente se puede elaborar un mapa fino de la regin y detectar el marcador ms prximo al gen problema.
DESARROLLO DE LA PRCTICA

En esta prctica se usar el insecto Drosophila melanogaster, aunque el plan de trabajo podra ser aplicado a un gran nmero de especies, como por ejemplo tomate, maz, ganado vacuno, etc. El gen asociado al fenotipo mutante, para el que queremos determinar su localizacin cromosmica, es el que produce la mutacin Henna recessive-3. Esta mutacin es fcilmente reconocible porque afecta a la pigmentacin ocular entre otras caractersticas. Mientras que los individuos Henna recessive-3 presentan ojos de color rojo oscuro que se vuelven casi negros con la edad, los individuos normales presentan un color rojo pardo, el cul es fcilmente distinguible del fenotipo mutante. Se pretende detectar marcadores de tipo RAPD que difieran entre las dos cepas (normal y mutante), y comprobar posteriormente en la F2 del cruzamiento entre estas dos cepas, si se encuentran ligados o no al locus Henna. En caso de estar ligados se determinar la frecuencia de recombinacin entre el marcador detectado y el locus Henna. El proceso de deteccin de ligamiento entre el marcador molecular y el gen cuya mutacin produce el fenotipo mutante se puede esquematizar del siguiente modo:
Caracteres objeto de estudio:

Color de ojos: alelo dominante (+), ojos rojos. alelo recesivo (h), ojos oscuros (mutacin Henna). Banda RAPD: alelo dominante (B), banda presente. alelo recesivo (b), banda ausente. Cruce Parental: Hnr-3 OrR Fenotipos Ojos oscuros Ojos rojos (normal) Banda

Genotipos F1 Fenotipo

hhbb

++BB

Ojos rojos (normal)

Genotipo

h+Bb

Nota: Los individuos de la F1 son heterocigotos para los dos caracteres:

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Color de ojos: poseen los dos alelos (h y +) pero se manifiesta el dominante (+). Banda RAPD: poseen los dos alelos (presente y ausente) pero se manifiesta el dominante (banda presente)
Cruce prueba

Hembras (h+Bb) x Machos (hhbb)

Dos resultados posibles segn exista o no ligamiento entre el gen Henna y el marcador molecular: Fenotipos (genotipos) No ligamiento Ligamiento Ojos rojos y banda (+h;Bb) >1/4 Ojos oscuros sin banda (hh;bb) >1/4 Ojos rojos sin banda (+h;bb) <1/4 Ojos oscuros y banda (hh;Bb) <1/4 El fenotipo para el color de ojos de los individuos resultantes del cruce prueba se observa directamente. Para determinar el fenotipo del segundo carcter (presenciaausencia de banda) es necesario realizar una PCR con el DNA extraido de cada indivduo. En estas prcticas no se realizarn los cruzamientos correspondientes (vistos ms arriba), tan solo se comentaran a nivel terico. A los alumnos se les proporciona directamente la descendencia del cruzamiento prueba, con indicacin del fenotipo correspondiente al color de los ojos. Los alumnos habrn de determinar el fenotipo de cada indivduo para el carcter Banda RAPD.

SESION 1. EXTRACCIN DEL DNA GENMICO.

Se realizar la extraccin del DNA genmico de cada individuo de forma independiente, a partir de las siguientes clases de individuos: Cada grupo realizar las siguientes extracciones repartidas por alumnos segn el criterio del profesor: Extraccin de DNA: 10 moscas normales (ojos rojos) (progenie F1 x la cepa Hnr3) 10 moscas mutantes (ojos oscuros) (progenie F1 x la cepa Hnr3)
Protocolo de extraccin de DNA total a partir de un individuo

1. Aadir 160 l de disolucin I fra y homogeneizar con una varilla o punta azul. 2. Aadir 200 l de disolucin II y agitar por inversin varias veces 3. Incubar a 65C durante 30 min. 4. Aadir 60l de acetato potsico 3 M (pH= 5.0) fro, agitar por inversin varias veces. 5. Incubar 20 min a - 20C. 6. Centrifugar 10 minutos a mxima velocidad en una microcentrfuga.

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7. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo y aadir el mismo volumen de isopropanol. Agitar por inversin. 8. Incubar 5 min a temperatura ambiente. 9. Centrifugar 10 min y desechar el sobrenadante. 10. Lavar el precipitado con 500l de etanol 70%. 11. Centrifugar 3 minutos, desechar el sobrenadante y secar al vaco. 12. Resuspender en 100 l de TE. Nota: no acortar el tiempo de la incubacin a 65C. El resto de los pasos pueden ser reducidos ligeramente sin grandes prdidas de rendimiento. Disolucin I (Tris 10mM, NaCl 60mM, Sacarosa 5%, EDTA 10mM, pH 7.8) Disolucin II (Tris 300 mM, SDS 1.25%, Sacarosa 5%, EDTA 10 mM, pH=8.0) TE (TrisHCl 10mM, 1mM EDTA; pH=8.0) LTE (TrisHCl 10mM, 0.11mM EDTA; pH=8.0)

SESIN 2. PCR

En primer lugar se discutirn los resultados de PCR obtenidos previamente de muestras de DNA pertenecientes a extracciones individuales a partir de moscas de las cepas OrR, Hnr3 y F1 y sometidas a amplificacin con diferentes cebadores. Se escoger el cebador (o cebadores) que genere bandas diferentes entre las dos cepas (polimorfismo). Se pretende identificar marcadores moleculares presentes en homocigosis en todos los individuos de una cepa y ausentes en la otra cepa. Esto se podr determinar analizando DNA procedente de extracciones individuales tanto de las dos cepas paternas como de la F1. Una vez elegido el cebador, a cada tubo de reaccin de PCR se le aadir una cierta cantidad del DNA de un nico individuo (procedente de la extraccin de la sesin anterior). Se realizar una PCR tipo RAPD de los 20 DNAs diferentes obtenidos de los descendientes del cruce prueba (10 de ojos rojos y 10 de ojos negros):
Amplificacin de DNA por PCR-RAPD

1. Preparacin de la solucin de reaccin Cada tubo de reaccin constar de: Tampn de la Taq polimerasa (50mM Kcl, 1.5mM MgCl2, 10mM Tris ClH pH=9.0),(solucin stock a 10X): 4 l 250 M de los cuatro desoxinucletidos (dNTP), (solucin stock a 5mM): 2 l 2,5 unidades de la Taq polimerasa (stock a 5 U/l): 0,5 l 0.2 M de cebador, (solucin stock a 2M): 4l

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 2 l de la solucin de DNA obtenida a partir de 1 mosca redisuelta en 100l (aproximadamente 0.1 ng de DNA).

El volumen total de la reaccin ser de 40 l El profesor aportar 20 tubos con 38 l de un cctel que contar con todos los componentes necesarios para la amplificacin excepto el DNA. Habr que aadir: 2 l de la solucin de DNA obtenida a partir de una mosca (aproximadamente 0,1 ng de DNA).
2. Condiciones de amplificacin Los tubos con la mezcla de PCR se colocarn en un termociclador y se aplicar el siguiente programa (nombre TAG): Paso Ciclos 1 1 2 Temperatura 94C Tiempos 5 min. Desnaturalizacin inicial

40

94C 38C 72C 72C 4C

60 seg. 60 seg. 70 seg. 4 min.

Desnaturalizacin Hibridacin Elongacin Extensin final

3 4

1 1

SESIN 3. ELECTROFORESIS

Los resultados de la PCR se visualizarn tras la separacin de los fragmentos de DNA amplificados mediante electroforesis en un gel de agarosa. La visualizacin de las bandas de DNA se har mediante irradiacin del gel con luz ultravioleta.
SESIN 4. CLCULO DEL LIGAMIENTO

Con los datos de la clase y los de todos los grupos de la asignatura se determinar el ligamiento entre el marcador molecular y el locus que produce el fenotipo mutante de color de ojos. Se calcular la frecuencia de recombinacin entre los dos loci.

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