INTRODUCCIN

En el laboratorio de Gentica Microbiana de la Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas se realizan actividades de investigacin y docencia para las que se requieren cepas bacterianas y de bacterifagos que deben mantener sus caractersticas fenotpicas y genotpicas, con objeto de asegurar resultados confiables y repetibles en los proyectos de investigacin as como en el desarrollo de trabajo experimental docente que se haya diseado. Como en cualquier laboratorio de Microbiologa, tanto en el trabajo de investigacin como en el de docencia se requiere. a) Material de vidrio y de plstico que debe mantenerse limpio (libre de cualquier contaminante qumico) y estril. La esterilizacin del material puede llevarse a cabo mediante: 1) Calor hmedo (Autoclave): El calor excesivo mata a los microorganismos al coagular al protoplasma y desnaturalizar las enzimas esenciales, este proceso se acelera en presencia de agua puesto que las protenas se coagulan a temperaturas ms bajas cuando estn bien hidratadas. En autoclave el material se somete entonces a temperaturas y presiones altas durante un determinado tiempo para eliminar la posibilidad de que un microorganismo se reproduzca. 2) Calor seco: El horno de calor seco es una cmara de doble pared, construida para resistir altas temperaturas y equipada con ventiladores para asegurar la circulacin constante de aire dentro de la cmara. Para la realizacin de experimentos con los microorganismos a veces son necesarias soluciones amortiguadoras las cuales deben de igual manera esterilizarse antes de ser utilizadas. En este caso los mtodos de esterilizacin pueden ser: Filtracin: Consiste en dejar pasar dichas soluciones a travs del material adecuado. Los soportes comunes de filtracin son: Tierra de diatomeas Porcelana no vitrificada Discos de asbesto Polvo de vidrio Membranas de nitrocelulosa con poro de 0.45 o 0.22m que deben esterilizarse antes de su uso.

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b) Medios de cultivo. Todos los medios contienen elementos esenciales para la sobrevivencia de los microorganismos; se han clasificado de diferente manera acuerdo a su uso. -Medio selectivo: Son medios de cultivo que tienen inhibidores de crecimiento para algunos microorganismos, por ejemplo pueden tener antibiticos especficos para cierta (s) bacteria (s). Es decir en un medio inoculado con una variedad de microorganismos solo algunos pueden crecer y reproducirse y todos los dems son suprimidos. - Medio enriquecido: Se usa para incrementar el crecimiento de ciertas especies bacterianas e inhibir el desarrollo de microorganismos no deseados para recuperar microorganismos patgenos de muestras en las cuales hay una fuerte concentracin de comensales. -Medio mnimo: En este tipo de medio solo se agregan las sustancias estrictamente necesarias para que los microorganismos puedan sobrevivir. Es claro que los medios de cultivo tambin deben esterilizarse y en este caso siempre se usa la esterilizacin por calor hmedo. A pesar de que los aspectos anteriores se controlen en la forma adecuada cabe la posibilidad de que tanto el material como los reactivos y medios de cultivo puedan contaminarse y den falsos resultados. Por lo que se requiere de un control estricto de las cepas bacterianas y las condiciones en las que se trabaja. En el caso del material biolgico se deben conservar los cultivos en condiciones que permitan la conservacin de sus caractersticas tanto fenotpicas como genotpicas. Existen varias formas de conservar las cepas por ejemplo: La congelacin; en este caso las cepas se mantienen a -70 grados centgrados en presencia de un crioprotector, la liofilizacin es otra forma de conservacin de cepas, sta consiste en un congelamiento y desecacin de las cepas al vaci, la siembra por picadura en medios ricos con altas concentraciones de agar y en el caso de los hongos la conservacin en esferas de arena estril.

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Justificacin del trabajo:

Todos los laboratorios dedicados a hacer investigacin en el campo de la Microbiologa, estn obligados a contar con un cepario con objeto de almacenar y preservar material biolgico, indispensable para los trabajos de investigacin que se llevan a cabo en los mismos. Por lo tanto es muy importante dar mantenimiento al cepario, sto se cumple a travs de actividades como, conservacin, evaluacin peridica y caracterizacin de las cepas existentes con el fin de garantizar el estado idneo de stas; al tiempo que se asegura que los experimentos realizados con ellas sean confiables y repetibles.

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MATERIALES
Para la realizacin de los experimentos que se describirn posteriormente se utilizaron medios y soluciones, los cuales se sealan a continuacin: Medios ricos: Caldo Luria (L o LB) Triptona (o Peptona de casena) NaCl Extracto de levadura Agua 10g 10g 5g 1L

Se mezclan todos los componentes hasta disolverlos completamente, despus se ajusta el pH a 7.0 con una solucin de NaOH 1N, se completa el volumen y se esteriliza en autoclave a 121oC durante 15 minutos, se deja en prueba de esterilidad en una incubadora a 37oC durante 24 horas y se guarda a 4oC hasta su utilizacin. Agar Luria (L o LB) La composicin y las proporciones son las mismas que para el caldo Luria, pero adems de lo anteriormente descrito se adicionan, una vez que se ajust el pH, 15g de agar bacteriolgico por litro de solucin, se esteriliza en autoclave a 121oC durante 15 minutos, se deja enfriar a 50oC, se vaca en cajas de Petri estriles, se deja gelificar, se comprueba su esterilidad incubando a 37oC durante 24 horas, y se guarda a 4oC hasta su utilizacin. Medio 2YT Triptona (o Peptona de casena) Extracto de levadura NaCl Agua 16.0g 10.0g 10.0g 1.0L

Mezclar todos los componentes hasta su completa disolucin, esterilizar en autoclave a 121oC durante 15 minutos. Se deja en prueba de esterilidad en una incubadora a 37oC durante 24 horas y se guarda a 4oC hasta su utilizacin.

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Medio 2YT slido Se mezclan los mismos componentes y en la misma proporcin que en el medio lquido, pero adems se agregan 15g de agar bacteriolgico por litro de medio, despus, se esteriliza en autoclave a 121oC durante 15 minutos, se deja enfriar a 50oC, se vaca en cajas de Petri estriles, se deja gelificar y se somete a prueba de esterilidad en una incubadora a 37oC durante 24 horas y se guarda a 4oC hasta su utilizacin Medio BHI Este medio ya viene formulado por lo que slo se pesan 52g de la frmula en polvo, se disuelven en 1 litro de agua, para disolver la frmula completamente se calienta con el mechero. Se esteriliza en autoclave, a 121oC durante 15 minutos, se deja enfriar a 50oC, se vaca en cajas de Petri estriles; se somete a prueba de esterilidad en una incubadora a 37oC durante 24 horas y se guarda a 4oC hasta su utilizacin. Infusin BHI Este medio ya viene formulado por lo que slo se pesan 44g de la frmula en polvo y se disuelven en 1 litro de agua, para disolver la frmula completamente se calienta con el mechero. Se esteriliza en autoclave a 121oC durante 15 minutos, se deja en prueba de esterilidad en una incubadora a 37oC durante 24 horas y se guarda a 4oC hasta su utilizacin. Medios selectivos: Agar Mac Conkey Este medio al igual que los anteriores se adquiri ya formulado por lo que slo se pesan 38g del polvo, se mezclan con 1 litro de agua de garrafn y se disuelve calentando a mechero. Se esteriliza en autoclave a 121oC durante 15 minutos, se deja enfriar a 50oC, se vaca en cajas de Petri estriles, se deja gelificar, se somete a prueba de esterilidad en una incubadora a 37oC durante 24 horas y se guarda a 4oC hasta su uso. Nota: Este medio nos permite reconocer y diferenciar clulas lac+ de las cepas lacmediante una coloracin rosa y blanquecina de las colonias bacterianas respectivamente.

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Medios mnimos. Como base para todos los medios mnimos a continuacin descritos se utiliz el medio M9 el cual tiene la siguiente composicin: NaCl Na2HPO4 KH2PO4 NH4Cl 0.5g 6.0g 3.0g 1.0g

Disolver uno a uno de los componentes en 1 Litro de agua desionizada. Se esteriliza en autoclave a 121oC durante 15 minutos, una vez esterilizado y fri a este medio se deben adicionar 0.1ml de una solucin de cloruro de calcio CaCl2 1M estril. Para la preparacin de los medios mnimos al medio M9, se deben adicionar soluciones de aminocidos, vitaminas y en ocasiones de bases nitrogenadas y antibiticos que se requieran para las cepas, las cuales deben prepararse y esterilizarse por separado y adicionarse en las concentraciones indicadas en la tabla 1.

Tabla 1: Concentraciones de aminocidos, glucosa y bases nitrogenadas para la

preparacin de medios mnimos

Componente Glucosa L-Arginina L-Histidina L-Isoluecina L-Leucina L-Prolina L-Treonina L-Triptofano L-Metionina L-Serina Vitamina B1 Timina Estreptomicina

Concentracin % 20 2 1 1 0.5 2 0.5 0.5 1 1 0.2 0.1 10

Volumen por litro de medio 10 10 5 5 10 10 10 10 10 10 0.2 15 1

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Medios para el almacenamiento de las cepas. A- Siembra por picadura (Stabs) Caldo nutritivo NaCl Agar bacteriolgico Agua 10 g 5g 6g 1 L.

Se esteriliza el medio en autoclave a 121oC por 15 minutos, despus de lo cual, se vaca en viales, previamente esterilizados, hasta llenar las dos terceras partes del tubo; que debe mantenerse totalmente vertical. Se deja solidificar y se guarda en refrigeracin hasta su utilizacin. B-Medios para el almacenamiento por congelacin. (Glicerol). Glicerol Agua 80 g 100 ml

Se mezclan los componentes y se esteriliza en autoclave a 121oC por 15 minutos, despus se guarda en refrigeracin hasta su utilizacin. Agar blando Agar bacteriolgico Agua 0.7 g. 100 ml.

Se mezclan los componentes se calienta a fuego lento con mechero hasta disolver completamente, se distribuye en volmenes de 3 ml en tubos de hemlisis, se esteriliza en autoclave a 121oC durante 15 minutos, se deja gelificar el medio y los tubos se someten a prueba de esterilidad en una incubadora a 37oC durante 24 horas, posteriormente se guarda a 4oC hasta su utilizacin Solucin salina al 0.85% NaCl Agua 0.85 g 100mL.

Se mezclan los componentes, despus de lo cual se esterilizan en autoclave a 121oC por 15 minutos, despus se guarda en refrigeracin hasta su utilizacin.

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METODOLOGA
Determinacin de la viabilidad de los cultivos del cepario del Laboratorio de Gentica Microbiana. Los cultivos bacterianos fueron recuperados de los stabs que se mantenan en refrigeracin. Para lo cual en varios tubos estriles de 13x 100, se agregaron 3ml de caldo nutritivo o infusin BHI o Caldo de Soya-Tripticaseina, para posteriormente sembrar en cada tubo una asada de cada una de las cepas a recuperar y se incub a 37oC con agitacin suave de 24 a 48 horas. Adems se sembraron las mismas cepas en los mismos medios pero slidos y se incubaron a 37oC por un periodo de 24 a 48 horas.

DETERMINACIN DE LAS CARACTERSTICAS GENOTPICAS DE LAS CEPAS Para cada cepa se disearon los medios mnimos lquidos que se requeran para probar sus auxotrofias y sus resistencias o sensibilidades a antibiticos, tomando en cuenta la tabla 1 y las caractersticas reportadas para cada cepa. Las cepas se sembraron en cada uno de los medios y se incubaron a 37oC durante 48 horas, para determinar auxotrofas y durante 24 horas para establecer resistencia o sensibilidad a antibiticos. DETERMINACIN DEL TIPO SEXUAL DE LAS CEPAS Todas las cepas que resultaron viables se sembraron por estra cruzada en cajas conteniendo agar L, se incubaron de 18 a 24 horas. Posteriormente una asada de los cultivos crecidos fue resuspendida en 3ml de solucin salina estril, se adicionaron 0.1 ml de esta suspensin a un tubo de agar blando estril previamente fundido, se vaci en cajas de agar L, se permiti que gelificara el agar y posteriormente se colocaron de manera equidistante tres gotas (0.015ml) del bacterifago M13 el cual reconoce pilis sexuales. Una vez absorbido el fago, las cajas se incubaron a 37oC y se hicieron observaciones a las 12, 18 y 24 horas para determinar si haba o no efecto del bacterifago.

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DETERMINACIN DE LA CAPACIDAD DE FERMENTAR LACTOSA DE LAS CEPAS VIABLES Para la determinacin de la capacidad de fermentar lactosa, a todas las cepas se les sembr en cajas de Petri conteniendo agar Mac Conkey, el cual es un medio que permite por una reaccin colorida determinar si una cepa esta degradando lactosa pues, si lo hace se observa un color rosado en las colonias bacterianas si no, las colonias se aprecian totalmente blancas. (Ver figura 1 y 2). SIEMBRA POR PICADURA Las cepas se sembraron por estra cruzada en cajas conteniendo agar L se dejaron incubar de 18 a 24 horas a 37oC para obtener un cultivo fresco. Una vez crecidas las cepas se tom una muestra con el asa recta y se sembr por picadura en los viales conteniendo los medios de conservacin (stabs), cabe destacar que de cada cepa se sembraron dos viales.

CONGELADO DE LAS CEPAS

Cada una de las cepas fue inoculada en 1.4ml de medio L, e incubada a 37oC durante 18 a 24 horas, una vez crecido, al cultivo fresco de toda la noche se le adicionaron 0.57ml de glicerol al 80% estril, se congel y los viales se mantuvieron a -15oC.

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Figura 1: Se muestra un cultivo bacteriano con la capacidad de fermentar lactosa, sembrado por estra cruzada en medio Mac Conkey.

Figura 2: Se muestra un cultivo bacteriano que no puede fermentar lactosa, sembrado en Agar Mac Conkey. Observe como las colonias se ven completamente blancas comparadas con las de la figura anterior que son mas bien rosadas.

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RESULTADOS Tabla No. 2 VIABILIDAD DE LAS CEPAS CONSERVADAS EN EL LABORATORIO DE GENTICA MICROBIANA Cepa
AB2463 JM103 W3350 CSH23(a) CSH23 (b) CSH141 E3(a) E3(b) E3(c) E3(d) E3(e) JC4046 JC4087 SB392(a) SB392(b) SB392(c) SB393 (a) SB393 (d) XLBLUE TA216(a) TA216(b) C600(a) C600(b) C600(c) CSH62(a) CSH62(b) CSH62(c) CSH70(a) CSH70(b) JC158(a) JC158(b) JC158(c) JC158(d)

Viabilidad
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -

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Tabla No. 2-. CONTINUACIN Cepa

JC4079 (a) JC4079 (b) JC4079 (c) JC4079 (d) KL16(a) KL16(b) KL16(c) P10(a) P10(b) P10 (c) 3000(a) 3000(b) 3000(c) 5051 B188 (a) B188 (b) BL16W

Viabilidad
+ + + + + + + + + + + + + +

Las cepas que a su lado derecho tienen una letra entre parntesis, son cepas de las que se encontr mas de un stab, y se probaron todos, el smbolo (-) indica que el cultivo no creci ni aun despus de 48 horas de incubacin y el signo (+), indica que el cultivo celular en cuestin, creci antes de hasta 48 horas de incubacin en agitacin a 37C. Como se observa en la tabla no todos los cultivos resultaron viables.

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Tabla No. 3 CARACTERSTICAS GENOTPICAS DE LAS CEPAS VIABLES ANALIZADAS

CEPA TIPO SEXUAL MARCADORES DE AUXOTROFIA Thr-,Leu-,Pro-,His-,Thi-,Gal,Lac-,Mtol-,Rec-,UVs Met-,Timina-,LacGalPro-,Lac-,B1-/F lac+,Pro+ lac Pro- /F Lac+,Pro+ Lac-/F lac+ His+ /F HisMet-,His-Arg-Leu-/ F His+ His-/ F lac- ambar His-,Arg-,Ile-,Lac+/ F Lac- ocre ? His-/ F lac - opalo Prottrofa B1Met-,Arg-,B1Lys-, Ser-, Lac-, Trp-,LacB1Thr-, Leu-, lac-, B1- , Mal-. B1B1? ? MARCADORES PARA ANTIBITICOS SmR Sms Sms Sm? SpcR Sms Sms Sms Sms ? Sms ? ? Sms Sms Sms Sms Sms Sms Sms Sms Sms ? ?

AB2463 FJM103 W3350 CSH23 CSH141 E3 JC4046 JC4087 SB392 SB393 XLBLUE TA216 C600 CSH62 CSH70 JC158 JC4079 Kl16 P10 3000 5051 B188 BL6W FFF F F F F F F F F Hfr Hfr Hfr Hfr Hfr Hfr Hfr Hfr Hfr ? ?

En esta tabla se muestran las caractersticas genotpicas de las cepas, reportadas en la bibliografa. F-: Clula receptora F y Hfr: Clula donadora

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VERIFICACIN DE LOS MARCADORES DE AUXOTROFIA DE LAS CEPAS VIABLES

CEPA AB2463 INGREDIENTES DEL MEDIO M9+Glc M9+Glc+Leu,Pro,His,Arg,Thi, M9+Glc+Thr+Pro+His+Arg+Thi M9+Glc+Thr+Leu+His+Arg+Thi M9+Glc+Thr+Leu+Pro+Arg+Thi M9+Glc+Thr+Leu+Pro+His+Thi M9+Glc+Thr+Leu+Pro+His+Arg M9+Glc+Thr+Leu+Pro+His+Arg+Thi AUXOTROFIAS A PROBAR Todas Thr Leu Pro His Arg Thi control CRECIMIENTO +++

Tabla No. 4

JM103

M9+Glc M9+Glc+Met M9+Glc+Timina M9+Glc+Met+Timina M9+Glc M9+Glc M9+Glc+B1 M9+Glc M9+Glc+B1 M9+Glc M9+Glc+Pro M9+Glc M9+Glc M9+Glc+His M9+Glc M9+Glc+Met+His+Arg M9+Glc+Met+His+Leu M9+Glc+Met+Arg+Leu M9+Glc+His+Arg+Leu M9+Glc+Met+His+Arg+Leu M9+Glc M9+Glc+His

Met,Timina Timina Met Control Control B1 Control B1 Control Pro Control Control His Control Met,His,Arg,Leu Leu Arg His Met control His Control

+++ +++ +++ +++ + +++ +++ ++ +++ +++ +++

W3350 CSH23 (a) CSH23 (b)

CSH141

E3 (b) JC4046 JC4087

SB392(a)

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Tabla No. 4.- CONTINUACIN

CEPA INGREDIENTES DEL MEDIO M9+Glc M9+Glc+His M9+Glc M9+Ile+Arg M9+Glc+Ile+His M9+Arg+His M9+His+Ile+His M9+Glc M9+Glc M9+Glc+His M9+Glc M9+Glc M9+GLc M9+Glc+B1 M9+Glc M9+Glc+Met+Arg M9+Glc+B1+Met M9+Glc+B1+Arg M9+Glc+B1+Met M9+Glc M9+Glc+Met+Arg M9+Glc+B1+Met M9+Glc+B1+Arg M9+Glc+B1+Met AUXOTROFIAS A PROBAR His Control Ile,Arg,His His Arg Ile Control Control His Control Control Control B1 Control B1,Met,Arg B1 Arg Met Control B1,Met,Arg B1 Arg Met Control CRECIMIENTO

SB392 (b) SB393 (d)

+ +++ + + +++ +++ +++ +++ +++ +++ + +++ + +++

XLBLUE TA216(b) C600 (b) C600(c) CSH62 (b) CSH70 (a)

CSH70 (b)

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Tabla No. 4.- CONTINUACIN

CEPA JC158 (a)

JC158 (b)

JC158 (c)

JC4079(a)

INGREDIENTES DEL MEDIO M9+Glc M9+Glc+Lys M9+Glc+Ser M9+Glc+Ser+Lys M9+Glc M9+Glc+Lys M9+Glc+Ser M9+Glc+Ser+Lys M9+Glc M9+Glc+Lys M9+Glc+Ser M9+Glc+Ser+Lys M9+Glc M9+Glc+Trp M9+Glc+Leu M9+Glc+Trp+Leu M9+Glc M9+Glc+Trp M9+Glc+Leu M9+Glc+Trp+Leu M9+Glc M9+Glc+Trp M9+Glc+Leu M9+Glc+Trp+Leu M9+Glc M9+Glc+B1 M9+Glc M9+Glc+B1 M9+Glc M9+Glc+B1

AUXOTROFIAS A PROBAR Lys, Ser Ser Lys Control Lys, Ser Ser Lys Control Lys, Ser Ser Lys Control Trp, Lys Lys Trp Control Trp, Leu Leu Trp Control Trp, Leu Leu Trp Control B1 Control B1 Control B1 Control

CRECIMIENTO +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

JC4079(b)

JC4079(c)

KL16 (a) KL16 (b) KL16 (c)

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Tabla No. 4.- CONTINUACIN

CEPA P10 (a) INGREDIENTES DEL MEDIO M9+Glc M9+Glc+B1 M9+Glc+Thr+B1 M9+Glc+Leu+Thr M9+Glc+Leu+Thr+B1 M9+Glc M9+Glc+B1 M9+Glc+Thr+B1 M9+Glc+Leu+Thr M9+Glc+Leu+Thr+B1 M9+Glc M9+Glc+B1 M9+Glc+Thr+B1 M9+Glc+Leu+Thr M9+Glc+Leu+Thr+B1 M9+Glc M9+Glc+B1 M9+Glc M9+Glc+B1 M9+Glc M9+Glc M9+Glc AUXOTROFIAS A PROBAR Thr, Leu, B1 Thr Leu B1 Control Thr, Leu, B1 Thr Leu B1 Control Thr, Leu, B1 Thr Leu B1 Control B1 Control B1 Control Control Control Control CRECIMIENTO +++ + +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

P10 (b)

P10 (c)

3000 (c) 5051

B188(a) B188(b)

BL16W

Se probaron todas las copias viables de cada una de las cepas, se puede observar en la tabla que en la mayora de los casos todas las copias presentaron las mismas caractersticas excepto en el caso de KL16 y SB392.

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Tabla No.5 DETERMINACIN DEL CARCTER DE DONADORA DE LAS CEPAS VIABLES

CEPA AB2463 JM103 W3350 CSH23(a) CSH23(b) CSH141 E3(b) JC4046 JC4087 SB392(a) SB392(b) SB393(d) XLBLUE TA216(b) C600(b) C600(c) CSH62(b) CSH70(a) CSH70(b) JC158(a) JC158(b) JC158(c) JC4079(a) JC4079(b) JC4079(c) KL16(a) KL16(b) KL16(c) P10(a) P10(b) P10(c) 3000 5051 B188(a) B188(b) BL16W SENSIBILIDAD AL BACTERIFAGO M13 Negativa Negativa Negativa Positiva Positiva Negativa Positiva Positiva Positiva Negativa Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Negativa

Se muestran los resultados de la prueba de gota con un bacterifago especfico de clulas donadoras, realizados a todos los cultivos bacterianos viables del Laboratorio de Gentica Microbiana .Como se observa los resultados obtenidos corresponden a lo reportado en la bibliografa excepto en el caso de las cepas CSH141 y SB392(a), que deberan dar positiva la prueba.

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Tabla No. 6 Determinacin de la respuesta a estreptomicina de las cepas viables

CEPA AB2463 JM103 W3350 CSH23(a)* CSH23(b) CSH141 E3(b) JC4046 JC4087 SB392(a)* SB392(b) * SB393(d) XLBLUE* TA216(b)* C600(b) C600(c) CSH62(b) CSH70(a) CSH70(b) JC158(a) JC158(b) JC158(c) JC4079(a) JC4079(b) JC4079(c) KL16(a) KL16(b) KL16(c) P10(a) P10(b) P10(c) 3000(c) 5051 B188(a)* B188(b)* BL16W* MEDIO RICO+SM + MEDIO RICO + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

Se muestra la capacidad que tienen las cepas de crecer o n en presencia de estreptomicina, las cepas que no crecieron en presencia de dicho antibitico pero si en medio rico son estreptomicina sensibles (Sms), y las que lo hacen con o sin la presencia del antibitico son estreptomicina resistentes (SmR). En la mayora de los casos los resultados corresponden a lo reportado en la bibliografa pero en algunos otros (Los cuales estn marcados con un *) se hizo esta prueba por primera vez.

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Tabla 7 DETERMINACIN DE LA FERMENTACIN DE LACTOSA POR LAS CEPAS EN ESTUDIO

CEPA AB2463 JM103 W3350* CSH23(a) CSH23(b) CSH141 E3(b) JC4046* JC4087* SB392(a) SB392(b) SB393(d) XLBLUE* TA216(b) C600(b) C600(c) CSH62(b)* CSH70(a)* CSH70(b)* JC158(a) JC158(b) JC158(c) JC4079(a) JC4079(b) JC4079(c) KL16(a)* KL16(b)* KL16(c)* P10(a) P10(b) P10(c) 3000(c)* 5051* B188(a)* B188(b)* BL16W* CAPACIDAD DE FERMENTAR LACTOSA Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Positiva Negativa Negativa Negativa Negativa

En este experimento se midi la capacidad que tienen las cepas de fermentar o no el azcar lactosa. Como ya se mencion las cepas que pueden hacerlo se observan como en la figura1 y las que n como en la figura 2. De nuevo en la mayora de

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los casos los resultados corresponden a lo reportado en la bibliografa pero en algunos otros (Los cuales estn marcados con un *) se hizo esta prueba por primera vez.

DISCUSIN
Para realizar los experimentos fue necesario identificar los cultivos viables de cada una de las cepas, por lo que se crecieron en medios ricos. Una vez hecho esto, se sembr por estra cruzada, cada una de las cepas viables sobre medio rico slido, con objeto de verificar la pureza de las mismas, ya que se tuvieron las cepas puras se cultivaron en los medios mnimos especialmente diseados para identificar cada una de las caractersticas genotpicas reportadas en la bibliografa para cada una de ellas. Cabe destacar que para las caractersticas de sensibilidad a estreptomicina y fermentacin de lactosa no haba reportes en la literatura para algunas de las cepas, las cuales se muestran en las tablas 6 y 7 respectivamente. Como puede observarse en el apartado de resultados la mayora de las cepas analizadas conserva las caractersticas genotpicas reportadas, al menos en uno de los tubos almacenados; por lo que se procedi a realizar la conservacin de las cepas, cuando mas de un cultivo presentaba las caractersticas buscadas se escogi arbitrariamente alguno de ellos para preservarlo. En el caso especfico de la cepa CSH141 los resultados indicaron que est perdi las caractersticas contenidas en el plsmido que porta la bacteria, por lo que puede suponerse que dicha cepa perdi el plsmido. Cabe sealar que los stabs tenan varios aos conservados en refrigeracin y como puede verse en resultados el 70.58% estaban viables y el 80.55 conservaban sus caractersticas genotpicas; esto demuestra que la tcnica de conservacin por picadura en el medio para el almacenamiento de cepas elaborad con caldo nutritivo y cloruro de sodio conservando un volumen pequeo de aire, es un mtodo muy bondadoso para la conservacin del tipo de cepas que se emplean en el Laboratorio de Gentica Microbiana; tendran que hacerse otro tipo de experimentacin para determinar si cepas con mayores requerimientos nutricionales pueden conservarse de esta manera.

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CONCLUSIONES
Se presenta un listado de las cepas que se incorporaron como cultivos frescos al cepario del Laboratorio de Gentica Microbiana de la Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas incluyendo las caractersticas genotpicas de cada una de ellas. CEPA TIPO SEXUAL MARCADORES DE AUXOTROFIA Thr-,Leu-,Pro-,His-,Thi-,Gal,Lac-,Mtol-,Rec-,UVs Met-,Timina-,Lac Gal-,LacPro-,Lac-,B1-/F lac+,Pro+ lac Pro- /F Lac+,Pro+ Lac-/F lac+ Lac-.His+ /F HisLac-.Met-,His-Arg-Leu-/ F His+ His-/ F lac- ambar His-,Arg-,Ile-,Lac+/ F Lac- ocre Prottrofa, Lac-. His-/ F lac - opalo Prottrofa B1-, LacMet-,Arg-,B1-, Lac-, Lys-, Ser-, Lac-, Trp-,LacB1-, Lac-, Thr-, Leu-, lac-, B1- , Mal-. B1-, Lac+ B1-, LacProttrofa, LacProttrofa, LacMARCADORES PARA ANTIBITICOS SmR Sms Sms Sms SpcR Sms Sms Sms Sms Sms Sms Sms Sms Sms Sms Sms Sms Sms Sms Sms Sms Sms Sms Sms

AB2463 FJM103 W3350 CSH23 CSH141 E3 JC4046 JC4087 SB392 SB393 XLBLUE TA216 C600 CSH62 CSH70 JC158 JC4079 Kl16 P10 3000 5051 B188 BL6W FFF F F F F F F F F Hfr Hfr Hfr Hfr Hfr Hfr Hfr Hfr Hfr Donadora Donadora

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INFORME FINAL DE SERVICIO SOCIAL

NALLELYT SEGUNDO ARIZMENDI

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BIBLIOGRAFA

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