Está en la página 1de 21

GUIAS DE PRÁCTICA CIENCIAS DE LA SALUD QUIMICA

Código de registro: RE-10-LAB-303 Versión 1.0

UNIVERSIDAD PRIVADA DEL VALLE


SERVICIOS DE LABORATORIO
MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS
PRACTICA 1

PREPARACION DE DILUCIONES DE MUESTRAS DE ALIMENTOS PARA ANALISIS


MICROBIOLOGICOS

1. CONOCIMIENTO TEORICO REQUERIDO

De acuerdo a sus características intrínsecas, los diferentes alimentos necesitarán


tratamientos previos al análisis para dejarlos en condiciones para poder ser analizados.

La operación de preparación de muestras para el análisis microbiológico exige unas


reglas de manipulación aséptica muy estrictas, así como la utilización de material y
diluyentes estériles, para evitar la contaminación exterior del alimento.

En el caso de alimentos sólidos, el procedimiento más frecuentemente empleado es el


uso de homogeneizadores, para lo cual es necesario tener presente que:
 La excesiva velocidad de las cuchillas o la homogeneización demasiado prolongada
puede lesionar las células microbianas, tanto por el efecto mecánico como por el calor
producido, lo que daría lugar a recuentos inferiores al real.
 Una trituración y mezcla insuficiente puede no liberar todos los microorganismos o no
conseguir una distribución uniforme de éstos a la suspensión.
 Todos los homogeneizadores mecánicos generan aerosoles, por lo tanto se debe
trabajar en forma cuidadosa sobre todo si se tiene microorganismos patógenos, Se
recomienda esperar por lo menos un minuto antes de abrir el recipiente con el
homogeneizado.
 En caso de alimentos líquidos, éstos pueden ser directamente pipeteados

Por otro lado, los alimentos con pH menor a 4,5 deben previamente ser tamponados.
Alimentos tales como leche en polvo, gelatina, sopas, caldos, flanes, budines, huevo en
polveo, etc., requieren diluyentes los cuales deben estar atemperados a 45 ºC para
facilitar su disolución o dispersión de los microorganismos.

2. COMPETENCIA (S)

 Adquiere destrezas en la preparación de soluciones de dilución y tratamiento de los


diferentes alimentos para poder realizar los análisis posteriores.
 Prepara adecuadamente y de manera estéril el alimento a ser analizado, que se
presenta en el campo de trabajo del profesional.

3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS

Balanzas con una capacidad 400 g (2)


pH metro(1)
Baño de agua termorregulador a 48 ± 1 º C.(1)
Refrigerador(1)
Agitador de tubos (1)
Cajas Petri (15 unidades)
Papel sabana (2 pliegos)
Pipetas graduadas 10/2 y 5/ 10 mL
Frascos de vidrio de 500 mL de capacidad (3)
Probeta de 250 ml (2)
Piceta de agua (2)
GUIAS DE PRÁCTICA CIENCIAS DE LA SALUD QUIMICA
Código de registro: RE-10-LAB-303 Versión 1.0

Pro pipetas(2)
Cucharas (2), cuchillos (2), pinzas anatómicas (2), tijeras(2)
Espátulas.(4)
Peptona(5 g)
Autoclave
Tubos con tapa de rosca 15ml de capacidad (10)

4. TECNICA O PROCEDIMIENTO

Una vez recibida la muestra, el análisis debe realizarse lo más pronto posible.
Si se debe postergar el procedimiento,

 Mantener a -18ºC las muestras de productos congelados.


 Entre 0 a 4 º C los alimentos perecibles no congelados, por un periodo no superior a
36 horas.
 A temperatura ambiente las muestras no perecibles como conservas o alimentos de
baja humedad.
 Si la muestra congelada, descongelada en su envase original (o bien en el recipiente
en el que llegó al laboratorio) durante un periodo máximo de 18 horas en refrigerador
( a 5ªC).
 Si la muestra congelada puede ser fácilmente triturada, como sucede con los helados,
no es necesario descongelarla.

Pesar, asépticamente, una porción representativa de la muestra a analizar. La cifra de


pesada obtenida se multiplica por 9 y el resultado dará el volumen en mililitros del
diluyente, en este caso agua peptonada, que es necesario para obtener la dilución 1:10,
para el análisis microbiológico se requiere pesar 10g, 25 o 60 g ± 0,1 g de la muestra la
cual será homogeneizada y/o triturada en un vaso de licuadora o triturador de paletas
(Stomacher) a la cual se le añadirá la solución diluyente (agua peptonada), constituyendo
de esta manera la suspensión madre y primera dilución de la serie (1:10). Si la muestra
no es homogénea, deben tomarse 50 g de una mezcla de todos los componentes y
mezclarlos en la cantidad adecuada de la solución diluyente. A un tubo que contenga 9
mL de agua peptonada se transfiere 1 mL de la suspensión madre. Mezclar 30 segundos
en agitador de tubos. Así se obtiene la dilución 1:100. Desechar la pipeta usada. De la
mezcla anterior, y con nueva pipeta estéril, se incorpora 1 mL a otro tubo que contenga 9
mL de agua peptonada estéril. Mezclar 30 segundos en agitador de tubos. Así se obtiene
la dilución 1:1000. Desechar la pipeta usada y repetir la operación en varios tubos, hasta
lograr las diluciones deseadas.

De esta forma se obtiene la “serie de diluciones decimales “ (10 -1, 10-2, 10-3, 10-4, etc.),
que servirá para iniciar las determinaciones en las que sea necesario obtener recuentos.

Los tubos de la serie se mantendrán en frigorífico hasta el comienzo del análisis, el cual,
aun en condiciones de refrigeración, deberá demorarse más de dos horas para partir del
momento en que se haya preparado la “serie de diluciones decimales”.

Para alimentos líquidos que pueden ser pipeteados, se agitará manual o mecánicamente
la muestra para asegurar la distribución uniforme de los microorganismos, y se procederá
de acuerdo a la técnica descrita para los alimentos no líquidos. Para los alimentos líquidos
viscosos que no pueden ser pipeteados se procederá de acuerdo a la técnica descrita.

Para los alimentos los alimentos ácidos (jugos, néctares, yogurt, etc.) se colora la muestra
en agua peptonada con un pH de 7.0.

2
GUIAS DE PRÁCTICA CIENCIAS DE LA SALUD QUIMICA
Código de registro: RE-10-LAB-303 Versión 1.0

Para homogenizar alimentos cuyo contenido en grasa sea superior al 20 %, se


recomienda agregar al diluyente 1 % de Tween80 u otro tensoactivo no tóxico, con el fin
de aumentar la dispersión de loso glóbulos de grasa. En el caso de la mantequilla o
margarina, fundir la muestra bajo agitación en baño termorregulador a 40 º C por no más
de 15 minutos. En quesos, preparar la dilución 10 -1 utilizando como diluyentes una
solución de citrato de sodio al 2 %. Para las siguientes diluciones se seguirá el
procedimiento descrito

5. DURACION DE LA PRÁCTICA
100 minutos

6. MEDICION, CÁLCULO Y GRAFICAS


No se aplica

7. CUESTIONARIO

1. ¿Porque la preparación de las muestras exige una serie de reglas de manipulación?


2. Cuál cree que es el tiempo máximo que puede demorarse el investigador para realizar el
análisis microbiológico de los alimentos.
3. Cuál cree que es la función del Stomacher.

3
GUIAS DE PRÁCTICA CIENCIAS DE LA SALUD QUIMICA
Código de registro: RE-10-LAB-303 Versión 1.0

UNIVERSIDAD PRIVADA DEL VALLE


SERVICIOS DE LABORATORIO
MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS
PRACTICA 2

RECUENTO DE MICROORGANISMOS:
AEROBIOS MESOFILOS, COLIFORMES TOTALES Y MOHOS Y LEVADURAS

1. CONOCIMIENTO TEORICO REQUERIDO.

Frecuentemente las muestras que hay que estudiar tienen un número muy elevado de
microorganismos, por lo que se requiere diluirlas para poder contarlos. Para ello se
realizan diluciones seriadas, que posteriormente se siembran en placas con medio de
cultivo.

Esta técnica de recuento nos permite conocer el número de microorganismos viables


en Microbiología se define como la capacidad del microorganismo para multiplicarse
en un medio sólido formando una colonia. Debemos tener en cuenta que las
condiciones concretas del ensayo pueden limitar la capacidad de reproducción de algunas
de las células viables de la muestra inicial. Es fundamental procurar que la viabilidad inicial
no se vea afectada por el procedimiento experimental, intentando mantener los
microorganismos en las mismas condiciones ambientales a las que están adaptados. Por
tanto, si trabajamos con una muestra clínica, las diluciones debemos realizarlas en
solución salina, pero, si el recuento se realiza a partir de una muestra de agua corriente,
sería más apropiado diluir los microorganismos en agua con un pH neutro o solución
fosfato salina. También es muy importante no aumentar la carga microbiana inicial, por lo
que todas las manipulaciones se realizarán en condiciones de esterilidad. Aun así, es
fundamental recordar que solo vamos a cuantificar los microorganismos que se
multipliquen en las condiciones concretas del experimento (Temperatura, solvente
de las diluciones, medio de cultivo, atmósfera, etc.).

Aerobios mesófilos
En el recuento de microorganismos aerobios mesófilos se estima la flora total del
alimento, pero sin especificar tipos de gérmenes.

Esta determinación refleja la calidad sanitaria de los productos analizados


indicando, además de las condiciones higiénicas de la materia prima, la forma como
fueron manipulados durante su elaboración.

Tiene un valor limitado como indicador de la presencia de patógenos o sus toxinas.


Un recuento total de bacterias heterotróficas bajo no asegura que un alimento esté exento
de patógenos o sus toxinas; tampoco un recuento total alto significa, inevitablemente,
presencia de flora patógena.
Excepto en productos que se elaboran por fermentación, altos recuentos
microbianos se consideran poco aconsejables para la mayor parte de los alimentos.

La presencia de estos microorganismos tiene un significado diverso:

 Materia prima excesivamente contaminada.


 Deficientes métodos de manipulación durante la elaboración de los productos.
 La posibilidad, por tratarse de microorganismos mésofilos de que entre ellos pueda
haber patógenos, dado que esta flora suele ser mesófila.
 Altos recuentos suelen ser signo de inmediata alteración del producto. Tasas
superiores a 106 -107 gérmenes por gramo suelen ser ya inicio de descomposición

4
GUIAS DE PRÁCTICA CIENCIAS DE LA SALUD QUIMICA
Código de registro: RE-10-LAB-303 Versión 1.0

El método de placa difusa no provoca un shock térmico en las bacterias debido al


estado del medio de cultivo, debido a que todas las colonias están en la superficie del
agar donde pueden ser fácilmente distinguibles de partículas y burbujas. Las colonias
pueden ser fácilmente transferidas a otros medios de cultivo y su morfología de es fácil
de ser discernida y puede compararse a las descripciones publicadas. Sin embargo, este
método está limitado por el volumen pequeño de prueba de muestra o dilución que puede
utilizarse en el agar por el agar: 0,1 para 0,5 ml, según que el grado para el cual los
medios de cultivo estén preparados.

Coliformes totales

El grupo de microorganismo denominados coliformes forma parte de la familia


Enterobacteriaceae. Son bacilos Gram negativos aerobios y anaerobios facultativos,
producen acido a partir de la glucosa y otros carbohidratos, fermentan la lactosa con
producción de ácido y gas a 35ºC en 48 horas. Este grupo incluye Escherichia, Citrobacter,
Klebsiella y Enterobacter.

Escherichia coli es una bacteria cuyo hábitat es el intestino de los hombres y animales de
sangre caliente y debido a esto se ha utilizado como indicador de contaminación fecal
El grupo coliformes fecales se define como bacilos Gram negativos aerobios – anaerobios
facultativos, que fermentan lactosa, formando ácido y gas a 44.5ºC en 24 horas,
presentes en el intestino del hombre y los animales caliente se incluye a dos géneros
Escherichia, Enterobacter, Klebsiella.

Mohos y levaduras
Comúnmente se da el nombre de moho a ciertos hongos multicelulares
filamentosos, dotados de un micelio verdadero, microscópicos, y cuyo crecimiento en los
alimentos se conoce fácilmente por su aspecto aterciopelado o algodonoso. Por esta
concepción, es inseguro establecer el límite entre los mohos y ciertos microorganismos
encuadrados en las especies esporógenas y productoras de micelio de las levaduras.

Las levaduras son hongos que crecen generalmente en forma de agregados sueltos
de células independientes, que pueden ser globosas, ovoides, piriformes, alargadas o
casi cilíndricas. En algunos caos, forman cadenas de células alargadas adheridas de
modo suelto, semejantes a un micelio, por lo que se las denomina pseudomicelio. Algunas
especies forman breves extensiones de verdaderos micelio, con frecuencia ramificado.
De acuerdo con lo expuesto, y según se ha comentado ya, no existe un límite de
separación definida entre levaduras y otros hongos que forman un micelio típico.

El significado de la contaminación fúngica de los alimentos, especialmente por mohos,


viene no sólo del potencial de los hongos para deteriorarlos, sino también del potencial
de muchos de ellos para producir una gran variedad de micotoxinas a las que el hombre
tiene susceptibilidad, así como su capacidad para provocar infecciones, e incluso
reacciones alérgicas en personas hipersensibles a los antígenos fúngicos

2. COMPETENCIA (S):

 Investiga la presencia de bacterias aerobias mesófilas en alimentos, que se presentan


en el campo de trabajo del profesional.
 Determina la presencia de bacterias aerobias mesófilas mediante la técnica de
difusión en placa, para la solución de problemas que se presentan en el campo de
trabajo del profesional.

5
GUIAS DE PRÁCTICA CIENCIAS DE LA SALUD QUIMICA
Código de registro: RE-10-LAB-303 Versión 1.0

 Aplicar la técnica del recuento en placa para la determinación de coliformes


totales en muestras de alimentos.
 identifica la colonia de coliformes totales en una muestra analizada.
 Determina la presencia de mohos y levaduras en diferentes alimentos a través de
células independientes para la solución de problemas que se presentan en el
campo de trabajo del profesional.
 Cuantifica la presencia de mohos y levaduras en la contaminación fungida de los
alimentos y esto permite la solución de problemas que se presentan en el campo de
trabajo.

3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS


Cucharas (2), cuchillos (2), pinzas anatómicas (2), tijeras(2)

Agar estándar para recuento en placa (Plate count agar) 10 g


Agitador de tubos (1)
Alcohol al 96 %(50 ml)
Autoclave (2)
Balanza de 400 g (2)
Baño de agua termorregulador a 50 (1)
Cajas de Petri esteriles preparadas en la práctica anterior (50)
Espátula 5
Estufa de incubación regulada a 35 º C (1)
Frascos Schott 500 ml (7)
Hornilla (1)
Micropipeta automática 100 a 1000ul (4)
Piceta de agua (2)
Pipetas estériles de 10 ml.preparadas en la anterior practica
Pro pipetas(2)
Probeta de 250ml estériles, preparadas en la anterior práctica (4)
14Tubos con 9 ml de agua peptonada preparados en la práctica anterior
Gradilla (7)
Agua destilada 2 L
Frascos Schott 1000 ml (2)
Agar EMB(10g)
Caldo sulfato de lauril triptosa (15g)
Caldo verde brillante bilis al 3% (10 g)
Medio EC (10g)
Papel aluminio(2m)
Peptona(5g)
Acido tartárico (2g)
Agar patata dextrosa (15 g)

6
GUIAS DE PRÁCTICA CIENCIAS DE LA SALUD QUIMICA
Código de registro: RE-10-LAB-303 Versión 1.0

Tween (10 g)
Matraz de 250 ml (6)
Guantes para calor (1 par)

4. TECNICA O PROCEDIMIENTO

1. Tomar 1 ml de la muestra de agua problema ( preparar la muestra problema de


acuerdo a las reglas establecidas en la practica 1) con una pipeta estéril y añadirlo a uno
de los tubos con 9 mL de solución salina estéril. Es muy importante que los volúmenes
sean lo más exactos posible.

2. Agitar el tubo para homogenizar totalmente la suspensión. De esta forma, hemos


conseguido diluir la muestra inicial 10 veces (dilución 10-1).

3. Repetir la misma operación a partir de esta primera dilución para conseguir la dilución
10-2, y así sucesivamente. Según la carga microbiana que sospechamos que exista en la
muestra problema debemos hacer distinto número de diluciones.
4. Sembrar 1 ml de cada una de las diluciones realizadas. A este inóculo agregar 15
ml del agar para recuento en placa mantenido a 45ºC y mezclar por rotación en círculo.
5. Incubar las placas a 37 º C durante 24 a 48 horas.
6. Contar las colonias de las placas que presentan un número entre 30 y 300 colonias.
Un número menor de 30 colonias por placa puede suponer la presencia de errores debido
a fluctuaciones estadísticas. Por otro lado, un número mayor de 300 puede ser excesivo
para poder contarlas exactamente.

5. DURACION DE LA PRÁCTICA

200 minutos
6. MEDICION, CÁLCULO Y GRAFICAS

Contar las colonias de aquellas placas que contengan un máximo de 300.


Retener las placas que contengan un máximo de 300 colonias al nivel de dos diluciones
sucesivas. Es necesario que al menos una placa contenga un mínimo de 15 colonias.
Calcular el número N de microorganismos por mililitro o gramo con la expresión

N = ΣC
1,1 * d
Dónde:
N = número estimado de microorganismos por gramo o mL de muestra
C = número de colonias contadas en cada placa
d = nivel de dilución correspondiente a la dilución madre o a la primera dilución sembrada
o retenida (d= 1 cuando la muestra para análisis se ha sembrado directamente)

Si se observa cajas petri donde no crecieron colonias, se reporta como menos de 1


colonia (< 1).

Calcular con estos datos el número de UFC iniciales. Por ejemplo, si en la placa
correspondiente a la dilución 10-3 hemos contado 200 colonias, inicialmente tendríamos
200/10-3 x0,1 volumen de la muestra 0 2 x 106 UFC/ mL

7. CUESTIONARIO

1. En leche pasteurizada, cual es la cantidad de bacterias aerobias mesófilas esperada.


2. Características de Bactérias aeróbias mesófilas.
7
GUIAS DE PRÁCTICA CIENCIAS DE LA SALUD QUIMICA
Código de registro: RE-10-LAB-303 Versión 1.0

3. En qué tipo de alimentos no se recomienda realizar esta prueba


4. Que pruebas se realiza para la confirmación de E. coli
5. Que medios de cultivo se utiliza para la determinación de coliformes en alimentos
6. Que características bioquímicas presenta E. coli
7. Porque es importante determinar la presencia de mohos y levaduras en los alimentos.
8. Cuáles son las toxinas liberadas por los diferentes mohos presentes en los alimentos
9. Cuáles son los pasos para determinar las toxinas producidas por los diferentes mohos en
los alimentos.

8
GUIAS DE PRÁCTICA CIENCIAS DE LA SALUD QUIMICA
Código de registro: RE-10-LAB-303 Versión 1.0

UNIVERSIDAD PRIVADA DEL VALLE


SERVICIOS DE LABORATORIO
MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS
PRACTICA 3

COLIFORMES TOTALES; FECALES EN AGUA MEDIANTE LA TECNICA DE


TUBOS MULTIPLES (NMP)

1. CONOCIMIENTO TEORICO REQUERIDO

El grupo coliforme incluye todas la bacterias que son bacilos Gram-negativos, no


esporulados, anaerobios facultativos, oxidasa negativa, capaces de crecer en presencia
de sales biliares y otros compuestos activos, fermentan la lactosa a temperatura de 35 ó
37 °C, con producción de ácido, gas y aldehído entre 24 y 48 horas.

El grupo coliforme pertenece a la familia Enterobacteriaceae e incluye varios géneros:


Escherichia, Citrobacter, Enterobacter y Klebsiella. Se encuentran en el intestino del
hombre y los animales, pero también en otros ambientes como plantas y suelo, etc., por
lo que como indicadores de contaminación fecal no presenta buena especificidad. Sin
embargo, su frecuencia en las heces, su fácil detección y la posibilidad de que junto a
ellos existan microorganismos patógenos hacen que se empleen como principales
microorganismos indicadores de contaminación fecal. Se realiza esta determinación por
la técnica del número más probable (NMP).

La determinación del NMP de bacterias Coliformes en una muestra se hace a partir de la


técnica de los tubos múltiples, en la cual volúmenes decrecientes de la muestra
(diluciones decimales consecutivas) son inoculadas en un medio de cultivo adecuado.

La combinación de los resultados positivos y negativos es usada en la determinación del


NMP. Todos los tubos se preparan con 10 ml del medio de la siguiente forma: 3 tubos a
doble concentración del medio base (2X) y 6 tubos a concentración sencilla (1X)

El método consta principalmente de dos etapas: prueba presuntiva y prueba confirmativa.


La prueba presuntiva consiste en colocar volúmenes determinados de muestra en una
serie de tubos conteniendo caldo laurel triptosa y son incubados a 35 ó 37 +/- 0,5 °C
durante 24 – 48 horas. En esta prueba presuntiva la actividad metabólica de las bacterias
es estimulada vigorosamente y ocurre una selección inicial de organismos que fermentan
la lactosa con producción de gas. La formación de gas a 35 ó 37 +/- 0,5 °C dentro de las
24-48 horas, constituye una prueba presuntiva positiva para la presencia de bacterias del
grupo coniforme. La prueba presuntiva de Coliformes totales no debe usarse
rutinariamente sin confirmación par análisis de agua.

La prueba confirmativa consiste en transferir un inóculo de cada tubo positivo de la


prueba presuntiva a tubos conteniendo caldo lactosado verde bilis brillante al 2 % e
incubarlos posteriormente a 35 ó 37 +/- 0,5 °C durante 24- 48 horas. Esta prueba reduce
la positividad de resultados falso gas-positivos que pueden ocurrir por la actividad
metabólica de bacterias formadoras de esporas. El caldo lactosado verde bilis brillante
contiene agentes selectivos e inhibidores que reducen significativamente la obtención de
resultados falso positivos. La producción de gas a 35 °C después de las 24- 48 horas
constituye una prueba confirmativa positiva.

2. COMPETENCIA (S)

9
GUIAS DE PRÁCTICA CIENCIAS DE LA SALUD QUIMICA
Código de registro: RE-10-LAB-303 Versión 1.0

 Determina la potabilidad de una muestra de agua, para la solución de problemas que se


presentan en el campo de trabajo del profesional.
 Determina la presencia del grupo coliforme mediante la técnica de NMP, para el proceso
de interpretación y solución de problemas.
 Investiga la presencia de bacterias lactosa positivas en diversos productos, para la
solución de problemas que se presentan en el campo de trabajo del profesional.
 Investiga la presencia de indicadores de contaminación, que se presentan en el campo
de trabajo del profesional

3. MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPOS

Tubos con Caldo lauril triptosa (CLT) preparados en la practica anterior (105)
Tubos con Caldo verde bilis brillante preparados en la practica anterior (105)
Tubos con Medio EC preparados en la practica anterior (105)
Alcohol al 96 % (50 mL)
Micropipeta automática 100 a 1000 ul (4)
Estufa de incubación regulada a 35 º C (1)
Agitador magnético (1)
Balanza de 400 g(2)
Frascos Schott 500 mL (3)
Hornilla
Gradillas (7)
Autoclave
Marcador (3)
Pro pipetas(4)
Picetas de agua (2)
Tubos durham (315)
Asa microbiológica 7
Pipetas graduadas de 10 ml (7)

4 TECNICA O PROCEDIMIENTO
TUBOS MULTIPLES PRUEBA PRESUNTIVA

PROCEDIMIENTO DE TUBOS MULTIPLES CON SERIES DE 5 TUBOS (10 ml, 1 ML Y


0,1 ML.)
 Preparar una serie de 5 tubos conteniendo 10 ml de CLT de doble concentración.
 Preparar dos series de tubos (en total 10 tubos) conteniendo 10 ml de CLT de
concentración simple.
 Codificar los tubos anotando el número asignado a la muestra, volumen a inocular y
fecha.
 Homogeneizar vigorosamente la muestra unas 25 veces.
 Con una pipeta estéril transferir 10 ml de la muestra de agua a cada uno de los tres
tubos con doble concentración.
 Agitar los tubos e incubar a 35 ± 0,5 ° C por 24 horas.
 Con una pipeta estéril transferir 1 ml de la muestra de agua a cada uno de los tres tubos
de concentración simple.
 Agitar los tubos e incubar a 35 ± 0,5 ° C por 24 horas.
 Con una pipeta estéril transferir 0,1 ml de la muestra de agua a cada uno de los tres
tubos de concentración simple.
10
GUIAS DE PRÁCTICA CIENCIAS DE LA SALUD QUIMICA
Código de registro: RE-10-LAB-303 Versión 1.0

 Agitar los tubos e incubar a 35 ± 0,5 ° C por 24 horas.


 Utilizar para cada transferencia una pipeta estéril nueva.

PRUEBA CONFIRMATIVA PARA COLIFORMES TOTALES

 Utilizar caldo lactosado verde bilis brillante al 2 % (CLVBB).


 Marcar los tubos de CLBB que corresponden a cada tuvo positivo de CLT de la prueba
presuntiva.
 Agitar cada tubo de CLT presuntivo positivo y con un asa de siembra previamente
esterilizada y enfriada, extraer una asada del material e inocular en el tubo de CLVBB
evitando tocar la película superficial que puede formarse en el CLT.
 Incubar todos los tubos de CLVBB inoculados durante 24 horas a 35 +/- 0,5 °C.

PRUEBA CONFIRMATIVA PARA COLIFORMES TERMOTOLERANTES

 Utilizar caldo EC.


 Marcar los tubos de EC que corresponden a cada tuvo positivo de CLT de la prueba
presuntiva.
 Agitar cada tubo de CLT presuntivo positivo y con un asa de siembra previamente
esterilizada y enfriada, extraer una asada del material e inocular en el tubo de EC evitando
tocar la película superficial que puede formarse en el CLT.
 Incubar todos los tubos de CLVBB inoculados durante 24 horas a 44 +/- 0,2 °C en baño
maría.

5. DURACION DE LA PRÁCTICA

200 minutos

6. MEDICION, CÁLCULO Y GRAFICOS

 Anotar los resultados y calcular el NMP de acuerdo a las porciones y combinaciones


empleadas

7. CUESTIONARIO

1 Cuáles son las características de los coliformes termotolerantes


2 Los requisitos microbiológicos para agua potable.

11
GUIAS DE PRÁCTICA CIENCIAS DE LA SALUD QUIMICA
Código de registro: RE-10-LAB-303 Versión 1.0

UNIVERSIDAD PRIVADA DEL VALLE


SERVICIOS DE LABORATORIO
MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS
PRACTICA 4

RECUENTO DE
ESCHERICHIA COLI EN ALIMENTOS LISTOS PARA CONSUMO

El grupo de microorganismo denominados coliformes forma parte de la familia


Enterobacteriaceae. Son bacilos Gram negativos aerobios y anaerobios facultativos,
producen acido a partir de la glucosa y otros carbohidratos, fermentan la lactosa con
producción de ácido y gas a 35ºC en 48 horas. Este grupo incluye Escherichia, Citrobacter,
Klebsiella y Enterobacter.

Escherichia coli es una bacteria cuyo hábitat es el intestino de los hombres y animales de
sangre caliente y debido a esto se ha utilizado como indicador de contaminación fecal
El grupo coliformes fecales se define como bacilos Gram negativos aerobios – anaerobios
facultativos, que fermentan lactosa, formando ácido y gas a 44.5ºC en 24 horas,
presentes en el intestino del hombre y los animales caliente se incluye a dos géneros
Escherichia, Enterobacter, Klebsiella.

2. COMPETENCIA (S)

 Determina la presencia de Escherichia coli en diferentes alimentos, para la solución de


problemas que se presentan en el campo de trabajo del profesional.
 Identifica con pruebas bioquímicas las cepas encontradas en las muestras.

3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS


Cucharas (2), cuchillos (2), pinzas anatómicas (2), tijeras(2)

Agitador de tubos (1)


Alcohol al 96 %(50 ml)
Autoclave (2)
Balanza de 400 g (2)
Baño de agua termorregulador a 50 (1)
Cajas de Petri esteriles preparadas en la práctica anterior (50)
Espátula 5
Estufa de incubación regulada a 35 º C (1)
Frascos Schott 500 ml (7)
Hornilla (1)
Micropipeta automática 100 a 1000ul (4)
Piceta de agua (2)
Pipetas estériles de 10 ml.preparadas en la anterior practica
Pro pipetas(2)
Probeta de 250ml estériles, preparadas en la anterior práctica (4)
14Tubos con 9 ml de agua peptonada preparados en la práctica anterior

12
GUIAS DE PRÁCTICA CIENCIAS DE LA SALUD QUIMICA
Código de registro: RE-10-LAB-303 Versión 1.0

Gradilla (7)
Agua destilada 2 L
Frascos Schott 1000 ml (2)
Agar EMB(10g)
Caldo sulfato de lauril triptosa (15g)
Caldo verde brillante bilis al 3% (10 g)
Medio EC (10g)
Papel aluminio(2m)
Peptona(5g)
Acido tartárico (2g)
Agar patata dextrosa (15 g)
Tween (10 g)
Matraz de 250 ml (6)
Guantes para calor (1 par)

4.- TECNICA O PROCEDIMIENTO

 Preparar las diluciones de la muestra de alimento.


 Sembrar 1 ml de cada dilución de la muestra en placas petri, previamente esterilizadas e
identificadas
 Verter en cada placa 15 ml del agar previamente fundido y mantenido a 50ºC
 Mezclar el inoculo con el medio fundido, una vez solidificado el agar, invertir las placas
rápidamente.
 Incubar a 35ºC por 24a 48 horas
 Seleccionar la dilución cuyas placas contengan entre 25 a 250 colonias y contar las
colonias típicas color rojo intenso con precipitado, colonias atípicas color rosado, amarillas
o café claro con o sin precipitado.
 Seleccionar 3 a 5 colonias sospechosa e inocular en caldo verde brillante al 3 %, incubar
a 35ºC durante 48 horas al finalizar el tiempo observa la formación de gas de glucosa.

5.- TIEMPO DE DURACION DE LA PRÁCTICA


200 minutos

6.- MEDICION, CALCULOS Y GRAFICAS

CT= Recuento presuntivo Nº de colonias confirmadas


Nº de colonias sometidas a confirmación.

7.- CUESTIONARIO

 Que pruebas se realiza para la confirmación de E. coli


 Que medios de cultivo se utiliza para la determinación de coliformes en alimentos
 Que características bioquímicas presenta E. coli

13
GUIAS DE PRÁCTICA CIENCIAS DE LA SALUD QUIMICA
Código de registro: RE-10-LAB-303 Versión 1.0

UNIVERSIDAD PRIVADA DEL VALLE


SERVICIOS DE LABORATORIO
MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS
PRACTICA 5

PRUEBAS DE IDENTIFICACION DE Escherichia coli

1. CONOCIMIENTO TEORICO REQUERIDO


Dentro de las pruebas de identificación de las bacterias se aplica:
o Características de crecimiento en los medios de cultivo
o Características morfológicas reacción a la tinción de Gram
o Prueba de la catalasa
o Prueba de la coagulasa
o Pruebas bioquímicas
o Pruebas serológicas

2 COMPETENCIA (S)
 Identificara las características de las colonias de E. coli en medio selectivo
 Aplicara los diferentes tipos de siembra para la serie bioquímica para Escherichia coli
 Identificara las reacciones positivas y negativas para la Escherichia coli

3. MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPOS


Tubos con Caldo lauril triptosa (CLT) preparados en la practica anterior (105)

Tubos con Caldo verde bilis brillante preparados en la practica anterior (105)

Tubos con Medio EC preparados en la practica anterior (105)


Alcohol al 96 % (50 mL)
Micropipeta automática 100 a 1000 ul (4)
Estufa de incubación regulada a 35 º C (1)
Agitador magnético (1)
Balanza de 400 g(2)
Frascos Schott 500 mL (3)
Hornilla
Gradillas (7)
Autoclave
Marcador (3)
Pro pipetas(4)
Picetas de agua (2)
Tubos durham (315)
Asa microbiológica 7

Pipetas graduadas de 10 ml (7)


Agar TSI (10)
Agar citrato de Simmons (10g)
Agar lisina iron (5g)
Medio de MR-VP (5g)
Medio SIM (5g)
14
GUIAS DE PRÁCTICA CIENCIAS DE LA SALUD QUIMICA
Código de registro: RE-10-LAB-303 Versión 1.0

Peróxido de hidrogeno 10Vol(5 mL)


Tubos con citrato de sodio (2)
Colorantes de Gram (1 kit)
Varillas de tinción (2)
Microscopios(6)
Aceite de inmersión (2 mL)
Portaobjetos (15 unidades)
Rojo metilo
α naftol 5% en etanol 5 ml
KOH 40%

4. TECNICA O PROCEDIMIENTO
Características morfológicas y crecimiento
o Observar las características de las colonias en stereomicroscopio y anotar
o Realizar una tinción de GRAM de la colonia observada
o Seleccionar 5 colonias aisladas para pruebas bioquímicas

PRUEBAS BIOQUIMICAS
Las colonias seleccionadas sembrar en agar TSI, Agar citrato, agar lisina, Medio SIM,
caldo MR_VP
Incubar 24 horas a 37ºC
Lectura e interpretación

5. DURACION DE LA PRÁCTICA
200 minutos

6. MEDICION, CALCULOS Y GRAFICAS


Realizar las lecturas e interpretación relacionar con tablas de referencia

7. CUESTIONARIO
1. Para qué sirve la prueba de la catalasa y fundamento
2. Componentes de TSI Y y tipos reacciones que presenta
UNIVERSIDAD PRIVADA DEL VALLE
SERVICIOS DE LABORATORIO
MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS
PRACTICA 6

RECUENTO DE
STAPHYLOCOCCUS AUREUS

1. CONOCIMIENTO TEORICO REQUERIDO

Staphylococcus aureus, como el resto de las especies del género Staphylococcus, es


un germen ubicuo que se encuentra en la piel y mucosas de la mayoría de los animales
de sangre caliente, así como en los alimentos de origen animal. Existen portadores sanos
ocasionales, intermitentes o permanentes de este microorganismo.

Las fosas nasales del hombre constituyen el reservorio principal del germen desde
donde se disemina a la piel, manos, rostro, pelo, etc. La tasa de portadores nasales se
considera del 20 al 50 %. Haciendo una toma de las fosas nasales con un hisopo estéril,
se obtienen cantidades de St. aureus que exceden 10 3 colonias/hisopo. Por otro lado, su
ubicuidad hace que se encuentren en el ambiente: aire, suelo, aguas, vestidos, etc.

15
GUIAS DE PRÁCTICA CIENCIAS DE LA SALUD QUIMICA
Código de registro: RE-10-LAB-303 Versión 1.0

St. aureus es una bacteria inmóvil, Gram+, esférica y usualmente agrupados en racimos,
aerobia-anaerobia facultativa, catalasa positiva. Produce generalmente la enzima
coagulasa, fermenta el manitol y otros azúcares formando ácido pero no gas, El
crecimiento ocurre en un amplio rango de temperatura (6,5 a 50ºC), siendo el óptimo 30
– 40 º C. La producción de enterotoxina se realiza entre 10 y 46 º C, con temperatura
optima de 37 a 45 º C. Tolera concentraciones altas de cloruro de sodio y es capaz de
desarrollarse aeróbicamente en alimentos con baja Aw (0,86)

El crecimiento de St. aureus en alimentos presenta un riesgo en salud pública debido a


que algunas cepas producen enterotoxinas termoestables (A, B,C…E), las cuales causan
intoxicación alimentaria de alta incidencia.

El germen se suele destruir a temperatura de pasteurización pero no siempre. La


intoxicación estafilococia es el resultado del consumo de un alimento en el cual ha crecido
S. aureus produciendo, como consecuencia de ello, enterotoxina/s. La mayoría de los
brotes de intoxicación estafilococia son producidos por cepas de esta especie que
elaboran enterotoxina A y/o D.

La enterotoxinas son las responsables de la aparición de síntomas de intoxicación


estafilocócica (estafiloenterotoxicosis) ocasionados por la ingestión de alimentos
contaminados. También, ciertas cepas de St. aureus están capacitadas para producir
coagulasa y, en menos amplitud, termonucleasa (TNasa). Ambas se usan como
marcadores de la producción de enterotoxinas y como medio de identificación del germen.

2. COMPETENCIA (S)

 Determina la presencia de Staphyloccocus aureus en diferentes alimentos, para la


solución de problemas que se presentan en el campo de trabajo del profesional.
 Determina la capacidad de producir toxinas en las especies de Staphylococcus
encontradas, para la solución de problemas que se presentan en el campo de trabajo
del profesional.

3. MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPOS


Cajas de petri (10)
Base de Agar bair Parker(15g)
Telurito de potasio (2g)
Cloruro de sodio (3 g)
Huevos (2 unidades)
Peptona (5)
Frascos Scott de 250 ml (4)
Frascos de vidrio de 500mL(2)
Balanza de 400 g(2)
Estufa de cultivo(1)
Tubos con tapa rosca(10)
Asa de drigaski(3)
Espátula(4)
Gradilla (2)
Probeta de 250 ml(2)
Autoclave(1)
Pipetas de 10 mL(4)
Frasco Scott de 500 mL(2)
Hornilla (1)
Propipetas(2)
Micropipeta de 100 a 1000ul(2)
16
GUIAS DE PRÁCTICA CIENCIAS DE LA SALUD QUIMICA
Código de registro: RE-10-LAB-303 Versión 1.0

Marcadores(2)
Cucharas (2), cuchillos (2), pinzas anatómicas (2), tijeras(2)
Micropipeta automática 100 a 1000 ul (2)

4. TECNICA O PROCEDIMIENTO

Diluir 25 g. o ml de la muestra en 225 ml de agua peptona, y realizar las diluciones


requeridas.

Distribuir 0,1 a 0,2 ml de cada dilución en la superficie de placar con el agar Baird Parker
y extender el inoculo usando el asa de Drigalsky en toda la superficie del agar. Incubar a
35 º C durante 24 a 48 horas.

Seleccionar para el recuento las placas que contengan entre 20 a 300 colonias típicas.
Realizar el recuento de todas las colonias de color negro, una vez contadas estas colonias
en las placas elegidas, la cifra obtenida se multiplica por el factor de dilución de la placa,
lo que da como resultado el recuento total de St. aureus en 0,1 gramos del producto
analizado. Expresar el resultado en gramos o ml del producto analizado.

5. DURACION DE LA PRACTICA
200 minutos

6. MEDICION, CALCULOS Y GRAFICAS


Anotar los valores obtenidos y realizar el cálculo empleando:
Recuento S aureus = Recuento presuntivo x Numero de colonias confirmadas/
número colonias sometidas a confirmación.

7. CUESTIONARIO

1. Qué tipo de alimentos se ven implicados con la presencia de St. aureus.


2. Por qué se determina la presencia de la termonucleasa
3. Cuáles son las características de las colonias de St. aureus en el agar Baird Parker
4. Por qué adicionamos la emulsión de telurito y yema de huevo al agar Baird Parker

17
GUIAS DE PRÁCTICA CIENCIAS DE LA SALUD QUIMICA
Código de registro: RE-10-LAB-303 Versión 1.0

UNIVERSIDAD PRIVADA DEL VALLE


SERVICIOS DE LABORATORIO
MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS
PRACTICA 7

PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN DE Staphylococcus aureus

1. CONOCIMIENTO TEORICO REQUERIDO


Dentro de las pruebas de identificación de las bacterias se aplica:
o Características de crecimiento en los medios de cultivo
o Características morfológicas reacción a la tinción de Gram
o Prueba de la catalasa
o Prueba de la coagulasa
o Pruebas bioquímicas
o Pruebas serológicas

2 COMPETENCIA (S)
 Identificara las características de las colonias de Staphylococcus en medio selectivo
 Interpretará la prueba de la coagulasa y catalasa para Staphylococcus

3. MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPOS

Tubos pequeños con tapa de rosca (30)


Pipetas de 10 mL(6)
Micropipeta automática 100 a 1000 ul (4)
Puntas para micropipeta 100 a 1000 ul
Micropipeta automática 10 – 200 ul (2)
Puntas para micropipeta 10 a 200 ul
Centrífuga (1)
Gradillas (4)
Frascos Schott de 250 ml (6)
Balanza de 400 g(3)
Hornilla (1)
Probeta de 100 ml (3)
Espátulas (4)
Autoclave (1)
Caldo cerebro corazón (5g)
Peróxido de hidrogeno 10Vol(5 mL)
Jeringa de 5 ml (3)
Torniquete(2)
Tubos de hemolisis (10)
Tubos con citrato de sodio (2)
Estufa de cultivo a 35`C
Colorantes de Gram (1 kit)
Goteros para tinción
Varillas de tinción (2)
Estereomicroscopio(1)
Microscopios(6)
Aceite de inmersión (2 mL)
Portaobjetos (15 unidades)
Agujas bacteriológicas
Algodón (20g)
Alcohol al 70 %(10 mL)

18
GUIAS DE PRÁCTICA CIENCIAS DE LA SALUD QUIMICA
Código de registro: RE-10-LAB-303 Versión 1.0

4. TECNICA O PROCEDIMIENTO
Características morfológicas y crecimiento
o Observar las características de las colonias en stereomicroscopio y anotar
o Realizar una tinción de GRAM de la colonia observada
o Seleccionar 5 colonias aisladas para pruebas bioquímicas

PRUEBA DE LA COAGULASA

 Repicar 3 a 5 colonias típicas y sembrar en caldo cerebro-corazón. En forma paralela


realizar cultivos de cepas control positivo.
 Incubar a 35 º C durante 20 a 24 horas.
 Traspasar 0,1 ml de cultivo a un tubo con 0,3 ml de plasma de conejo.
 Incubar a 35 º C y examinar periódicamente por un lapso de 6 horas para observar la
formación de coagulo. Solamente un coagulo firme y completo permanece en su lugar
al agitar o invertir el tubo, es considerado positivo para S. aureus. Si se obtiene una
coagulación parcial como las designadas con 2+ o3+, estas colonias deben ser
confirmadas mediante la prueba de la Termonucleasa.

5. DURACION DE LA PRÁCTICA

200 minutos

6. MEDICION, CALCULOS Y GRAFICAS


Realizar las lecturas e interpretación relacionar con tablas de referencia

7. CUESTIONARIO

1. Para qué sirve la prueba de la catalasa y fundamento


2. Como se interpreta la prueba de la coagulasa.

19
GUIAS DE PRÁCTICA CIENCIAS DE LA SALUD QUIMICA
Código de registro: RE-10-LAB-303 Versión 1.0

UNIVERSIDAD PRIVADA DEL VALLE


SERVICIOS DE LABORATORIO
MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS
PRACTICA 8

DETECCIÓN DE SALMONELLA

1. INTRODUCCIÓN
Bacilos cortos ( 1- 2 um) Gram negativos, pertenece a la familia Enterobacteriaceae,
anaerobios facultativos con flagelos peritricos, quimioorganotrofos, oxidasa negativos,
catalasa positivos con un metabolismo oxidativo y fermentativo, fermentan los azucares
con producción de ácido principalmente glucosa y otros azucares, son móviles excepto
gallinarium y pollorium, crecen en medios cultivos selectivos formando colonias de 2 –
3 mm de diámetro

2. COMPETENCIA (S)
 Determina la presencia del genero Salmonella en diferentes alimentos, para la
solución de problemas que se presentan en el campo de trabajo del profesional
 Describe las características detección de Salmonella, para la solución de problemas
que se presentan en el campo de trabajo del profesional

3.- MATERIAL Y MEDIOS


 Peptona(10 g)
 Cloruro de sodio (5g)
 Fosfato monobásico de potasio (5)
 Fosfato disodico(5g)
 Caldo selenito cisteína(10g)
 Caldo tetrationato(10 g)
 Agar verde brillante. Rojo fenol (BGA)(10g)
 Agar shigella- salmonella ( SS)(10 g)
 Frascos de vidrio de 500 mL (2)
 Frascos Scott de 500 mL(2)
 Frascos Scott de 250 mL (6)
 Cajas Petri (10)
 Probetas de 250 mL(2)
 Tubos con tapa de rosca (10 mL)
 Espátula (2)
 Balanza de 400 g (2)
 Hornilla (1)
 Pipetas de 10 mL(4)
 Picetas de agua (2)
 Autoclave(1)
 Cucharas (2), cuchillos (2), pinzas anatómicas (2), tijeras(2)
 Propipetas (2)

4. TECNICA O PROCEDIMIENTO

Método cualitativo que consiste en un pre enriquecimiento, enriquecimiento y


aislamiento de Salmonella en muestras de alimentos.
I.- Pre enriquecimiento
Esta fase permite que se estabilicen y recuperen las células que hay en la muestra,
pues se reparan células dañadas, que alcanzan las condiciones fisiológicas precisas

20
GUIAS DE PRÁCTICA CIENCIAS DE LA SALUD QUIMICA
Código de registro: RE-10-LAB-303 Versión 1.0

para su posterior desarrollo. Se suelen utilizar 25 a 50 gramos de muestra y la


siembra se realiza en medio liquido de agua peptonada tamponada
II.- Enriquecimiento selectivo
La finalidad del enriquecimiento selectivo es aumentar el porcentaje de Salmonellas,
permitiendo su proliferación, a la vez que se inhibe el crecimiento de otros organismos.
Se lleva a cabo transfiriendo distintos volúmenes del cultivo anterior a medios
específicos, que se incuban a sus temperaturas óptimas. Dentro de los medios más
usados son:
 Caldo de tetrationato. bilis – verde brillante (Muller- Kauffman) Transfieren 10 ml en
100 ml de caldo y se incuba a una temperatura de 42ºC o 43ºC durante un periodo
de 18 a 24 horas. Este caldo inhibe flora Gram positiva, el crecimiento de coliformes
y otras bacterias intestinales y estimula el desarrollo de Salmonella.
 Caldo Rappaport Vasiliadis se transfiere 0.1ml a 10 ml del caldo y se incuba a una
temperatura de entre 41ºC a 43ºC, a lo largo de 18 a 24 horas. Así se inhibe flora
competitiva y se estimula el crecimiento de Salmonella, cuyo crecimiento optimo se
obtienen a 42ºC
 Caldo selenito- cistina se transfieren 10 ml en 100 ml de caldo y se incuba a 37ºC
durante 24 horas. De esta manera se inhibe el crecimiento de gran parte de la flora
intestinal competitiva sin afectar a Salmonella, Shigella, Pseudomona, ni Proteus. La
cistina favorece el crecimiento de Salmonella.
III.- Aislamiento
El aislamiento se hace por estría en medios sólidos desde los caldos de
enriquecimiento. Estos medios contienen esencialmente agentes selectivos como
sales biliares, azucares como lactosa, sales para evidenciar la producción de Ácido
sulfhídrico e indicadores de pH.

5. DURACION DE LA PRÁCTICA
200 minutos
6. MEDICION, CÁLCULO Y GRAFICAS
No se aplica.
7. CUESTIONARIO
1. Mencione las infecciones que produce el género Salmonella.
2. Mencione los diferentes tipos de Salmonella que son patógenos para el hombre.
3. Cite las pruebas bioquímicas de identificación de Salmonella y sus características.

21

También podría gustarte