TP ELISA indirecto

Titulación

INMUNOLOGÍA
ELISA: Enzime Linked Immuno-Sorbent Assay
(Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas)
 Captura: detecto Ag
 Indirecto: detecto Ab Título:
ACTIVIDAD de Ac por un Ag
(cantidad y afinidad)
DILUCIÓN
No es concentración
 Placas de ELISA de PS
96 Wells

Minimizar errores de
Volumen

A= ƐxlxC
1) Sensibilización

OVA
• 0,1 ug/fosa

• 1 ug/fosa

• 10 ug/fosa

100 ul ph=9
16 horas, cámara húmeda
4°C
 OVA
2) Bloqueo Proteína de leche

• Proteína no relacionada con

mi sistema de trabajo
• Paso común en mayoría de
técnicas inmunoquímicas
• Evitar pegado inespecífico
• 200 ul 1h 37°C
3) Primer incubación:
Ac primario

10 diluciones seriadas ½ para cada

condición
Solución diluyente:
PBS-leche 1%-Tween20 0,05%
SCN en 4 diluciones menores
Lavados

Solución PBS-Tween20 0,05%

Luego de cada paso
SC Anti-OVA

B0

SCN
4) Segunda
incubación: Ac
secundario
 Podemos decidir qué revelar

 Conjugado a HRP

 moAb anti IgG de conejo

 Dilución fija en todas las fosas

(manual)
5) Revelado

Solución: OPD (1ug/ml) y H2O2 (1%)

en buffer citrato, 100 ul

H2SO4 4N para terminar rx, 50 ul

Análisis de resultados

Factor dilución – log (1/DIL) - Abs