TRABAJO PRCTICO N3

2017
Inmunologa Gral. e Inmunoqumica

ENZIMOINMUNOANALISIS
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

INMUNOFLUORESCENCIA
Microscopa de fluorescencia

INMUNOTRANSFERENCIA
Western Blot

Dra. Barrios, Bibiana (bbarrios@fcq.unc.edu.ar)

Dra. Gorosito Serrn, Melisa (mgorosito@fcq.unc.edu.ar)
Bioq. Mir, Soledad (msmiro@fcq.unc.edu.ar)
Lic. Rojas, David (drojas@fcq.unc.edu.ar)
 1 Semana18-22 de septiembre

21/09 Recuperar en otra Comision

1 PARCIAL 25/09 al 06/10

2 Semana 9-13 de octubre

Dra. Barrios, Bibiana (bbarrios@fcq.unc.edu.ar)

Dra. Gorosito Serrn, Melisa (mgorosito@fcq.unc.edu.ar)
Bioq. Mir, Soledad (msmiro@fcq.unc.edu.ar)
Lic. Rojas, David (drojas@fcq.unc.edu.ar)
 Objetivos:

ELISA Indirecto: evaluar la presencia de IgG especfica para

Trypanosoma cruzi (Diagnostico Serolgico de enfermedad de
Chagas).
Semi-cuantitativo

ELISA Sndwich: Determinar la concentracin de IgE total

Ejemplo: Determinacin de citoquinas en plasma
Cuantitativo
 Etapas de la Interaccin Ag-Ac
Primaria

Primer reconocimiento Ag-Ac

Altamente especfica

Rpida

No visible

Poco influenciada por T, electrolitos

Ac: anticuerpo
Ag: antgeno
 Ag o Ac se pueden conjugar, uniendo de manera
covalente, a diferentes sustancias

Radioistopo Radioinmunoanlisis
Medicin de Radioactividad

Fluorocromo Inmunofluorescencia
Medicin de Fluorescencia

Enzimas Enzimoinmunoanlisis
Medicin de Color

La tcnica de ELISA aprovecha la alta actividad de algunas enzimas que permite

amplificar la seal generada por la muestra.
 ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
Enzimoinmuno-anlisis de adsorcin)
Uno de los inmunorreactantes se inmoviliza (adsorbe) sobre un soporte slido

Ac. Captura

Fundamento:
Ac. Conjugado (E)
1. Reaccin de un inmunoreactante con un Ag o Ac.
2. Deteccin de esta reaccin mediante un conjugado
enzimtico.
Ag 3. Permite la deteccin de Ag o Ac.
Ac. Captura 4. Cualitativo, semicuantitativo y cuantitativo.
5. Sensible y especfico.
 Tipos de ELISA

Deteccin de anticuerpos especficos

ELISA Indirecto IgG especfica para Trypanosoma cruzi sp.

Deteccin de IgE como antgeno

ELISA Sandwitch IgE Total

 Cmo determinamos la presencia de
Acs IgG especficos para Trypanosoma
cruzi?
 ELISA Indirecto
1 Paso: Inmovilizacin del Ag a la fase slida

Fase slida:
Placas de ELISA (poliestireno o cloruro de
polivinilo-PVC)

1. Alta capacidad de unin

2. Baja desorcin
3. Alta transparencia

Tipos de unin:
No Covalente Interaccin hidroffica,
depende de la carga del Ag
Buffer Carbonato pH:9.6
Covalente Tratamiento qumico previo
de la placa
Adsorber: retener en la superficie de un cuerpo molculas o iones de otro cuerpo.
Sensibilizar la placa de ELISA: inmovilizacin de antgeno/s de T. cruzi en cada well de
la placa de ELISA.
 ELISA Indirecto: Esquema General
1. Sensibilizacin (Ag)
2. Lavado
3. Bloqueo
4. Incubacin de la muestra (Ac; Controles Positivo y
Negativo)
5. Lavado
6. Deteccin (Ac anti cadena h conjugado con la Enzima)
7. Lavado
8. Revelado (TMB)
1 4 6 8
 ELISA Indirecto
Sensibilizacin Lavado
Elimina molculas que no
interaccionan lo
suficientemente fuerte
Bloqueo
Bloqueo de sitios libres
con protenas que no
interaccionan con el
sistema Ag-Ac

Muestra: suero
Ag de T. cruzi de pacientes. Diluciones seriadas.
PBS - Tween 20 El suero del paciente contiene protenas
PBS - 10% SBF
como las inmunoglobulinas de diferentes isotipos con diferente especificidad adems de otras
protenas (albumina, alfa-globulinas, beta- globulinas, etc.).
Muestra Deteccin Revelado

DO

IgG especfica Ac anti-IgG Sustrato de la Enzima

+ Cromgeno
 ELISA Indirecto

TMB TMB oxidado

incoloro absorbe a 450nm

Espectrofotmetro
 Qu controles se incluyen en el ELISA?

Control Negativo Pool de sueros humanos con serologa negativa

(carece de Igs especficas contra T. cruzi).

Siempre la reaccin es NEGATIVA

Control Positivo Un pool de sueros humanos con serologa

positiva (contiene Igs especficas contra T.
cruzi).

Siempre la reaccin es POSITIVA

Blancos de la Reaccin Diluyente de la muestra

Interpretacin de Resultados

1. Semicuantitativa.
2. Positivo o Negativo (todo o
nada).
3. En los informes se expresan
como ttulo.
 Determinacin del TTULO
Ttulo: es la mxima dilucin de la muestra a la que la reaccin sigue
siendo positiva.
Absorbancia mayor a 2 veces la absorbancia del control negativo
(Abs > 2 Abs C-)
Muestras y controles

Dilucin C- C+ A B C D E F G H i J Ttulo
A: 1/512
1/2
B: 1/128
1/4 C: 1/128
F: 1/256
1/32
H: 1/32
1/64 I: 1/32
1/128
1/256

Cul de los pacientes son

1/512

positivos y cuales negativos???

1/1024 Blancos
 Cmo se calcula el dilucin de corte?
Pool de sueros
negativos para Chagas

Muestra C+
Pura +
1/2 +
1/4 + T. cruzi

1/8 +
1/16 +
1/32 +
1/64 - T. gondii
Blanco
Rx cruzadas

1/32 Dil. de corte para el Chagatest en Crdoba

 ELISA Sndwich: Esquema General
1. Sensibilizacin (Ac Captura anti cadena h)
2. Lavado
3. Bloqueo
4. Incubacin de la muestra (suero, estndar de IgE)
5. Lavado
6. Deteccin (Ac anti cadena h conjugado con la Enzima)
7. Lavado
8. Revelado (TMB)
 ELISA Sndwich
Determinar la concentracin de IgE total

Sensibilizacin Lavado Bloqueo

Elimina molculas que no Bloqueo de sitios libres
interaccionan lo con protenas que no
suficientemente fuerte interaccionan con el
sistema Ag-Ac

Ac de Captura anti IgE () PBS - Tween 20 PBS - 10% SBF

Muestra Deteccin Revelado

DO

IgE () Ac anti-IgE
Ac anti-IgG () Sustrato de la Enzima
+ Cromgeno
 Curva Testigo o Estandard

Solucin de concentracin conocida de IgE

Se realizan diluciones seriadas de concentracin conocida.
Se obtiene una curva de calibracin dosis respuesta
 Curva Testigo o Standard
Concentracin D.O.
UI/mL
500 2

250 1

125 0.5

62.5 0.250

31.25 0.125
Curva de
calibracin 15.625 0.062
partiendo de
7.81 0.031
testigo de
500 UI/mL 3.9
Caractersticas de un testigo:
1.95
1. De concentracin conocida
0.8
2. Estable en el tiempo
Blanco 0.071 3. Reacciona especficamente
Blanco 0.072 en el sistema

A dems ensayamos en la misma placa, simultneamente la MP, el

blanco y la curva de calibracin.
 Curva Testigo o Standard

Valores de referencia

Por extrapolacin de la DO obtenida en

Recin Nacidos 5 UI/mL
Menores de 1 ao 15 UI/mL
De 1 a 5 aos 60 UI/mL el problema se determina la
De 6 a 9 aos 90 UI/mL concentracin
De 10 a 15 aos 200 UI/mL
Adultos 150 UI/mL
 ELISA Indirecto vs Sndwich

Semicuantitativa Cuantitativa
Ttulo Concentracin
Problemas Tcnicos
 Problemas de Sensibilizacin
Alta [Ag] Baja [Ag]

Baja D.O.
 Problemas de Bloqueo

Alta D.O. en el blanco y en el Control Negativo

Problemas con el Ac Conjugado

Baja D.O. en el Control Positivo

 Inmunofluorescencia
El fundamento de la misma (al igual que Western Blot y ELISA) se basa en la
especificidad Antgeno-Anticuerpo.
Es una tcnica que emplea anticuerpos conjugados a fluorocromos.
Estos fluorocromos nos ayudan a evidenciar esta interaccin primaria.
Es una tcnica Cualitativa o Semi-cuantitativa (ttulo).
Fluorocromos: son molculas qumicas que Anticuerpo Conjugado
absorben luz a una determinada longitud de
onda y luego retornan a su estado basal de
energa emitiendo fotones a una longitud de
onda mayor.

Ag Ag

Microscopio de
Inmunofluorescencia
 Inmunofluorescencia Directa

+
Ej; deteccin de Ac conjugado Microscopio
Ag en Biopsias Bacteria intracelular, ej.

Inmunofluorescencia Indirecta
C.trachomatis.

+
Evaluar la presencia de
+ Anticuerpo secundario
anti-IgGh marcado con
Acs que reconocen Ag FITC
especficos
Anticuerpo secundario anti-

+
IgGh marcado con Biotina

Estreptavidina
conjugada con
fluorocromo
Mayor sensibilidad
 Inmunofluorescencia
Enfermedades Infecciosas (Dengue,
Aplicaciones Chagas, Sfilis, etc).
Enfermedades Autoinmunes (LUPUS)
Investigacin
Enfermedad de Chagas
Agente Etiolgico: Trypanosoma cruzi

La mayor parte de los

pacientes se diagnostican
en esta etapa
En el prctico
Inmunofluorescencia indirecta
Identificacin de Ac. IgGh dirigidos contra antgenos del T. cruzi
1- Incubar el suero del 2- Incubar con el 3- Microscopio de
paciente con las Anticuerpo secundario anti- fluorescencia
improntas igGh marcado con FITC

+ +
Lavar Lavar

Improntas con
tripomastigotes

Incubamos Microscopio de
Muestras problema Inmunofluorescencia
Control +
Contol -
Criterio para serologa positiva para Chagas recomendado
Se siembra una dilucin 1/32 del suero del paciente

Si esta dilucin del suero resulta positiva, se deben realizar diluciones

seriadas e informar el ttulo
Diagnstico de Chagas: se necesita
al menos dos pruebas diferentes
positivas. Si entre las dos que se
largaron hay discordancia (es decir,
una positiva y otra negativa),
entonces se larga una tercera para
asegurar el diagnstico. El ELISA ,
HAI y la IFI son semi-cuantitativos,
se informa el ttulo final.
Banco de Sangre
Laboratorio de Serologa

Para la enfermedad de Chagas:

Ttulo de corte: 1/32 (Crdoba)
 Western Blot, Inmunoblotting o
Inmunotransferencia
o Es un mtodo analtico perteneciente Placa radiogrfica

al campo de la biologa molecular

utilizado para la deteccin de protenas
en muestras de tejido homogeneizado,
suero o extractos proteicos

o El fundamento de la tcnica es la
especificidad Antgeno-Anticuerpo que
nos permite la deteccin de la protena
blanco dentro de una mezcla compleja
de protenas.

o Los resultados son cualitativos y

semi-cuantitativos.
 Western Blot
1.Separacin de los componentes de una mezcla antignica por
peso molecular (por ejemplo: protenas del virus de VIH del T.
cruzi), sembrados en un gel (SDS-PAGE) por medio de electroforesis
(Lammeli et al, 1970).
Muestra Conjunto de protenas

Beta-mercaptoetanol SDS

Calor

Electroforesis

PESO MOLECULAR
 Western Blot
Acrilamida
Preparacin del gel SDS-PAGE Bis-acrilamida
Persulfato amnico, (APS)
TEMED, (N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina)
Electroforesis desnaturalizante Dodecilsulfato sdico (SDS)

El tamao del poro del gel est determinado por la concentracin de

acrilamida y bisacrilamida
Acrilamida: los monmeros de acrilamida son neurotxicos y
cancergenos.
Las muestras para analizar se cargan cada una en un posillo
Adems debemos cargar en los posillos controles y el marcador de
peso molecular

Mayor peso
molecular
Stacking Gel (concentrador): asegura que
todas las protenas cargadas en el gel se
acumulen y migren juntas hasta la interfaz con
el gel separador .

Running Gel (Separador): la separacin es

proporcional al peso molecular. Menor peso
molecular
 Western Blot
Corrida electrofortica

Fuente Externa
Separacin
por peso
molecular

gel

Las protenas con menor peso

molecular migran ms, las de
mayor peso molecular migran
menos
 Western Blot
2.Transferencia de las protenas a soportes donde mantienen una unin firme
(Towbin et al,1979).
o Blotting: Transferencia de macromolculas biolgicas (DNA, protenas, etc.) desde un
gel hasta una membrana inmovilizante, para su posterior deteccin en la superficie de la
misma.
o Las protenas mantienen el patrn de separacin que tenan en el gel.

Nitrocelulosa
Tipos de
Nylon
Soportes
PVDF
(Polyvinyldene difluoride)
Transferencia
gel soporte
slido Eficiencia de la transferencia
Rojo Ponceau

Marcador de
peso
molecular
 Western Blot
3. Identificacin de los componentes de la mezcla antignica
mediante interaccin con anticuerpos especficos.
o Interaccin Antgeno-Anticuerpo
o Anticuerpo conjugado con Enzima (Peroxidasa)
Inmunodeteccin
Directo Indirecto

I- Bloqueo de la membrana (BSA, prot. de Leche,

I- Bloqueo de la membrana (BSA, prot. de etc.) para cubrir los sitios libres.
Leche, etc.) para cubrir los sitios
II- Incubacin con el Ac .primario (puede ser el
libres.
suero de un paciente)
II- Incubacin con el Anticuerpo marcado
III- Incubacin con el Anticuerpo secundario
con peroxidasa.
marcado con peroxidasa.
 Western Blot
Revelado H2O2 + Luminol, al oxidarse el Luminol produce luz .

Luminol Se coloca en ntimo contacto la nitrocelulosa con una

placa radiogrfica.
Placa
Radiogrfica Esta luz marca la placa radiogrfica generando una
banda
Nitrocelulosa

Foto digital de la placa radiogrfica

Separacin Transferencia Revelado

gel nitrocelulosa placa radiogrfica

 Western Blot
Enfermedades Infecciosas
Enfermedades Inflamatorias
Aplicaciones

Protenas de secrecin
Factores de crecimiento
Investigacin

En el Hospital
Diagnstico de Chagas

Obtencin de Cortamos la
las protenas Separacin Transferencia nitrocelulosa
en tiras

Bloqueo
Incubar suero del
paciente y controles
Incubar Ac
secundario
conjugado
T. cruzi Revelar
Fase slida
 Western Blot
Diagnstico de Chagas

A: Control positivo
B: Paciente positivo
C: Paciente negativo

A B C

suero de pacientes