Segunda Especialidad en Hemoterapia y Banco de Sangre

Metodologías
(ELISA y CLIA)
y Sistemas
Automatizados

Dr. Amadeo Sáez Alquezar

 Inmunoensayos
 Definición de Inmunoensayos
 ELISA
 CLIA (CMIA), eCLIA
 Ensayos (características)
 Equipamientos
 CLIA (características y ventajas)
 Tendencia
 Interferentes
 Control de calidad

INMUNOENSAYOS PARA ENFERMEDADES INFECCIOSAS

PRUEBAS CUALITATIVAS
 Definición de inmunoensayos
• Inmunoensayos son métodos de laboratorio que utilizan Ac /
Ag para la detección de diferentes analitos.
• Reacción de ligación entre el analito, a ser detectado, y un Ac o Ag
• Los inmunoensayos pertenecen a dos metodologías*
• ELISA
• CLIA y ECLIA
• Pruebas Rápidas que tienen formatos y características
diferentes
• POCT

(*): actualmente
 Características de las pruebas
serológicas cualitativas
Los inmunoensayos Cualitativos.
• Detectan si el parámetro (Ac o Ag) investigado está
presente o ausente
• Cada prueba tiene su valor de corte (cut off)
• El índice: valor de lectura / Cut off define si la muestra es
reactiva o no-reactiva.
• La mayoría de los laboratorios adopta la “zona gris” que
corresponde a un % alrededor del valor de corte, donde
los resultados son considerados indeterminados
 Valores de corte para las pruebas
serológicas
Máxima Sensibilidad Cutoff Máxima Especificidad
Frecuencia

Resultados de la prueba

Sin infección (RNR) (VPN 100%)

Infectados (RR) (VPP 100%)
CLIA

ELISA
 ELISA o Ensayo Inmunoenzimático
Enzyme Linked Immunosorbent Assay

• Desarrollado inicialmente por Engwall & Perlman en

Suecia y por Weemen & Schuurse en Holanda.
• Uno de los reactivos (Ag o Ac) está inmovilizado em una
fase sólida, en cuanto el otro puede estar ligado a una
enzima, preservando-se la actividad enzimática y la
actividad inmunológica del anticuerpo o del antígeno.
• Detecta cantidades extremamente bajas de antígenos o
anticuerpos con elevada precisión.
Engvall E, Perlman P (1971). "Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
Quantitative assay of immunoglobulin G". Immunochemistry 8 (9): 871–4.
 Pruebas ELISA: componentes
• Fase sólida
• Más usada: placa de poliestireno
• Sustratos cromógenos
• Más usados: OPD y TMB
• Enzimas (marcador del conjugado Ag
o Ac)
• Más usadas: peroxidasa e fosfatasa
alcalina

TMB (3,3',5,5';-tetrametilbenzidina)

(OPD): ortofenilenodiamina Horseradish peroxidase (HRP)

Pruebas ELISA

Conjugado

Conjugado
 Inmunoensayos - ELISA
FORMATOS

• Ensayo Directo “Sándwich”: IgG

• Anti-HBs; anti-HBc; anti-T.gondii.

• Ensayo Directo “Sándwich”:

Detección de Ag
• Ag HBs; Ag HBe; Ag HVD; Ag p24.

• Ensayo Competitivo
• Anti-HBc;

• Inmuno Captura : IgM reverso

• Anti-VA IgM; anti-HBc IgM; anti HVD IgM;
Ensayo Directo “Sándwich”: IgG
Anti-HBs – Anti-HBc
H2O2/TMB

HRP

AgHBs AgHBs

H2SO4

Positivo
Fase sólida
Ensayo Directo “Sándwich”:
Detección de Ag
Ag HBs, Ag HBe, Ag HD

HRP

H2O2/TMB

AgHBs

H2SO4

Positivo

Fase sólida
 Ensayo Competitivo
Anti-HBc H2O2/TMB

AgHBc
Del suero

HRP H2SO4

AgHBc adicionado

NEGATIVO

Fase sólida
 Inmuno Captura : IgM reverso
anti-HAV (IgM), anti-HBc (IgM), anti-Delta (IgM)
H2O2/TMB

HRP
Ag
H2SO4

Anti-IgM

Positivo
Fase sólida
Plataformas ELISA
 Tipos de luminiscencia
Luminiscencia es la emisión de luz asociada a la disipación de
energía de una sustancia que se encuentra en un estado
eléctricamente excitado

• Fotoluminiscencia o Fluorescencia
• Excitación por fotones de luz (infrarrojo, ultravioleta o
visible)
• Bioluminiscencia
• Mediada por enzimas en sistemas biológicos
• Luciferasa-luciferina
• Quimioluminiscencia (CLIA)
• Excitación por reacción química (óxido reducción,
mediada por enzimas)
• Electro quimioluminiscencia (e-CLIA)
• Excitación por estímulo eléctrico
 Quimioluminiscencia
Luminiscencia es la emisión de luz asociada a la
disipación de energía de una sustancia que se encuentra
en un estado eléctricamente excitado.

Un átomo de H en su estado fundamental. Electrón en nivel 1 si

absorbe un quantum de energía = nivel 2 pasa a un estado
Excitado de alta energía.
Cuando el electrón vuelve a su nivel original ocurre liberación
de energía.
 Quimioluminiscencia (CLIA)

 Producción de luz por una reacción química

• Reacción de óxido-reducción
• Ésteres de acridina (NaOH + H2O2) Éster de acridina

• H2O2 agente oxidante

• NaOH altera el pH para que ocurra
la reacción de oxidación
• Quimioluminiscencia amplificada por
enzimas
• ALP – AMPPD* AMPPD
 Quimioluminiscencia Convencional y
amplificada por enzima
La quimioluminiscencia convencional combina dos
líquidos para obtener una reacción con surgimiento
instantáneo de luz (flash), que aparece rápidamente
y desaparece rápidamente, dejando muy poco tiempo
para detectar la señal.
La reacción de quimioluminiscencia amplificada por
enzima produce una luz de brillo (Glow) que dura
más tiempo permitiendo que el sistema haga varias
lecturas. > precisión del resultado

RLU: Unidades relativas de luz

Electro-Quimioluminiscencia
(eCLIA)
La Electro-quimioluminiscencia consiste en un
proceso de reacciones químicas que generan
luminiscencia a partir de un estímulo eléctrico.
Las especies reactivas que producen la
luminiscencia son generadas en la superficie de
un electrodo.

Rutenio / Tripropilamina (TPA)

Inmunoensayos CLIA (CMIA)
• Técnica “sándwich” (IgG / Ag)
• Ensayos competitivos
• Ensayos por Inmuno captura

PRUEBAS
ETAPAS INCUBACIÓN DISPERSIÓN

Ensayo competitivo;
1 1x 1x
Ensayo Sándwich
Ensayo Competitivo 1 2x 1x
Ensayo Sándwich 2 2x 2x

(CMIA): Ensayo inmunológico quimio luminiscente

magnético
CLIA - Técnica Sándwich
Incubación

FA
muestra Ac marcado
Partícula
paramagnética

Separación magnética

Glow

Lavado
AMPPD
Sustrato
RLU
CLIA - Método Competitivo

Incubación

muestra Ag marcado
Partícula
paramagnética

Separación magnética
Glo
w
Lavado
AMPPD
Sustrato RLU
CLIA - ARCHITECT® HIV Ag/Ab Combo
Assay
 CLIA / MCIA

Cobas (Roche) Alinity (Abbott) Advia CentaurXP (Siemens) Dxl (Beckman Coulter)
Plataformas de CLIA
 Ventajas de los inmunoensayos
CLIA
• Los CLIAs tienen un alcance de detección mucho más amplio
que los ELISAs y son extremadamente sensibles para detectar
concentraciones de analitos muy bajas. Sensibilidad más alta.
• No es necesaria ninguna reacción de parada como en los
ELISAs.
• Las incubaciones son más cortas en los ensayos CLIA.
• Mayor velocidad en el procesamiento de las muestras.
• Especificidad elevada (depende del test empleado)

La denominación CLIA incluirá, a partir de ahora, también

los testes eCLIA
Elección de la Metodología en función
de la concentración del analito
Turbidimetria

Nefelometria

Unidad Denominación
ELISA Gramo 1,0
Miligramo 0,001
IF
Microgramo 0,000001
CLIA / RIA Nanogramo 10-9
Picogramo 10-12
Fentogramo 10-15
1pg/mL 1ng/mL 1µg/mL 1mg/mL

Concentración del analito

Adaptado de Sultan F; Merck Chimie SAS

 ELISA x CMIA
ELISA CLIA/CMIA
Soporte Micro placa Partícula magnética
Posibilidades Acceso aleatorio
Velocidad +++ ++++
Pequeño porte Pequeño porte
Opciones Médio/Gran porte Médio porte
Gran porte
Equipamientos Abiertos / Cerrados Cerrados
Tendencia Disminuir;
(próximos principalmente em las Aumentar
mayores rutinas
años)
 ELISA / CLIA / e-CLIA
EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO;
ANÁLISIS DE LOS EQUIPAMIENTOS

Ensayos serológicos SENSIBILIDAD

ESPECIFICIDAD
• Características y Desempeño
PEQUEÑO PORTE
Plataformas ELISA/CLIA MEDIO PORTE
GRANDE PORTE
• Velocidad; N0 de muestras/h

Control de Calidad CALIBRADORES

CONTROL INTERNO
EVALUACIÓN EXTERNA
 Tendencias para uso
de Inmunoenayos CLIA
• En laboratorios clínicos y bancos de sangre
existe una tendencia actual para el uso, cada
vez mayor, de inmunoensayos por CLIA (CMIA)
• El análisis de los resultados enviados al PNCQ,
por los participantes (bancos de sangre) de
programas de evaluación externa de serología:
 (%) de uso entre ELISA y CLIA
(2016 - 2018) en BS participantes
de los PEEC del PNCQ
49 55 55 49 52 54
50
% de ensayos ELISA o CLIA/eCLIA 41 44 43 48
34
en el Tamizaje serológico de 22
donantes de sangre
CH AGHBS CORE HIV HTLV HCV SÍFILIS
2016 2016

(%) de uso entre ELISA y CLIA (%) de uso entre ELISA y CLIA
(2016 - 2018) en BS participantes (2016 - 2018) en BS participantes
de los PEEC del PNCQ de los PEEC del PNCQ
62 63 61 59
57
50
48 79 80 75 78
45 65 71
37 41 39 41 59
36
29
25 19 20 26 25 20
12

CH AGHBS CORE HIV HTLV HCV SÍFILIS

CH AGHBS CORE HIV HTLV HCV SÍFILIS
2017 2017 2018 2018
Equipamientos automatizados para CLIA
Posibilidades disponibles en el mercado

• Desempeño de las Plataformas

• 180 testes/h
• 240 testes/h
• 480 testes/h
• >500 testes/h
• Laboratorios
• Pequeño porte
• Medio porte
• Grande porte
Ventajas: diversidad de equipamientos
(CLIA)

• La flexibilidad de los equipamientos

• Pequeño porte
• Medio porte
• Grande porte
• Permite que los laboratorios puedan adecuarlos a sus
rutinas manteniendo la ejecución de las pruebas y
personalizando el control de sus resultados.
 Interferentes
 Interferencia Endógena
Autoanticuerpos
Acs Heterofilos
Acs anti animales
Efecto Pro-zona

 Interferencia Exógena
Biotina
Estreptoavidina-Biotina
 INTERFERENTES
Cualquier sustancia o proceso capaz de
interactuar y falsear las reacciones,
modificando los resultados de las
pruebas de laboratorio.

• Interferencia endógena (analito

dependiente)
• Interferencia exógena (analito
independiente)
INTERFERENTES
 INTERFERENTES - AUTOANTICUERPOS

• Son inmunoglobulinas que reconocen antígenos del propio organismo. (Ej:

LES)
• La prueba de anticuerpos antinucleares (ANA) sirve de auxilio en el
tamizaje, en el diagnóstico y en la avaluación de enfermedades autoinmunes.
• Además de las enfermedades autoinmunes, autoanticuerpos pueden estar
presentes en otras situaciones.
• Individuos sanos pueden exhibir reactividad de sus inmunoglobulinas contra
constituyentes de su propio organismo.
INTERFERENTES - AUTOANTICUERPOS
 INTERFERENTES – ANTICUERPOS
HETERÓFILOS
• Anticuerpos humanos poli específicos.
• Reaccionan con inmunoglobulinas de dos o más especies
• Son Ac débiles de baja avidez
• Exhiben propiedades de autoanticuerpos (FAN) y pueden
ser Ac idiopáticos.
• Pueden perjudicar resultados de inmunoensayos.
• Mononucleosis infecciosa: son Acs IgM que reaccionan
contra Ags de la
superficie de hematíes de carnero y caballo pero no con
células de riñón de cobaya.
• Pueden ser observados en casos de linfomas, hepatitis,
enfermedades
autoinmunes y en ancianos.
 INTERFERENTES
Ac humanos circulantes reactivos contra proteínas animales
(Ac anti animales) – human anti-animal antibody (HAAA)

• HAAA (human anti-animal antibody): anticuerpos humanos circulantes

reactivos contra proteínas animales. Cuando están presentes en el
suero circulante,(hasta 40%), pueden causar interferencia en los
inmunoensayos por ligación y bloqueo de los sitios de ligación en la
captura y en la señalización de los anticuerpos, promoviendo
resultados falsamente altos o falsamente bajos.

• La interferencia debe ser considerada cuando no exista correlación

con el estado clínico del paciente y en particular, para aquéllas
pruebas en que la decisión médica depende del resultado de los
mismos.
 INTERFERENTES
Ac humanos circulantes reactivos contra proteínas animales
(Ac anti animales) – human anti-animal antibody (HAAA)

Entre los HAAA detectados en humanos, los anticuerpos

antimurinos (HMA) son los más comunes, pero también
pueden ocurrir contra otros animales como cobayas,
vacas, cerdos y otros).

Anticuerpos endógenos deben ser llamados de HAAA

específicos cuando existe histórico de tratamiento médico
con inmunoglobulina animal o inmunoglobulina de la
misma especie usada en el Inmuno ensayo.
 Efecto Pro-zona
(efecto Hook; efecto gancho)
 Efecto Pro-zona
(efecto Hook; efecto gancho)
• COMO PUEDE SER EVITADO
a) Haciendo dilución de la
muestra
b) Usando ensayos de dos etapas

a) Ejemplo: SÍFILIS usando Pruebas de floculación no treponémicas

(VDRL, RPR)
Realizar la prueba con la muestra de suero pura y diluida 1 /
10
 Efecto Pro-zona

Inmunoensayo de una etapa

Ag Exceso
de Ag

Conjugado Separación Magnética

Posibles
RFN
 Efecto Pro-zona
b) Inmunoensayo de dos etapas
Ag
Lavado p/
1ª Etapa Eliminar el
Exceso
de Ag

2ª Etapa
Separación Magnética

Conjugado

Sin RFN
INTERFERENTES: Sistema Biotina-
estreptavidina

(*): 143 – 287 nmol/día

INTERFERENTES: Sistema Biotina-estreptavidina
Productos comercializados que
contienen biotina
 Sistema Biotina – estreptavidina
Interferencia analítica exógena de la biotina
 Sistema Biotina – estreptavidina
Interferencia analítica exógena de la biotina
 Sistema Biotina – estreptavidina
Interferencia analítica exógena de la biotina
Interferencia de la biotina en los inmunoensayos
con formato biotina - estreptavidina

Muestra

Conteniendo
apenas el =
analito *
Ac Ac
biotiniliado Marcado

Conteniendo
el analito
=
y biotina
Ac Ac (*): Micropartícula
biotiniliado Marcado Revestida con
estreptavidina

Analito Biotina
Interferencia de la biotina en los inmunoensayos
con formato biotina - estreptavidina
Interferencia de la biotina en los inmunoensayos
con formato biotina - estreptavidina

• Grimsey et al. 2017; International Journal of Pharmacokitetics

• Roche – junho 2018 – ARDL1300; www.roche.com.br
 Consideraciones finales.
• Características de los Inmunoensayos.
• Características de los equipamientos (plataformas).
• Los Inmunoensayos son sensibles y específicos pero pueden
sufrir interferencias.
• Diagramas de flujo o algoritmos ayudan en el diagnóstico y en
la confirmación de los resultados.
• El Control de Calidad.
• Además de los procedimientos de CC el conocimiento
técnico-científico de los profesionales responsables, es el
factor más importante para la seguridad de los resultados.
Control de Calidad
 Errores durante el proceso
analítico
Fase Pre-analítica
Fase analítica
Fase post-analítica
Evaluación de la calidad
 Control de calidad interno
PEIC
 Control de calidad externo
PEEC
PROCEDIMIENTOS PARA ASEGURAR LA CALIDAD

Sistema de Gestión de la Calidad

 para dirigir y controlar una organización con respecto a
la calidad
Buenas Practicas en el laboratorio
 Control de calidad
 Operaciones técnicas y actividades usadas para cumplir
completamente los requisitos de la calidad.
Certificaciones
Acreditaciones
 Frecuencia de Errores durante el proceso analítico

Paciente
Donante Pré-Analítica Analítica Póst-Analítica Resultado
 Frecuencia de Errores observados
durante el proceso analítico
Más del 80% de los problemas son generados antes y después
de la fase analítica, pero hay evidencias científicas que indican
que los errores analíticos son causa importante de problemas
que originan riesgos y daños para los pacientes.

Aunque los errores analíticos sean menos frecuentes debemos

destacar que pueden ser considerados los más
transcendentales porque acaban siendo la causa de más del
50% de los errores en la atención de los médicos para los
pacientes, donantes de sangre y receptores de transfusión.
CONTROL DE CALIDAD EN SEROLOGÍA
• Control de Calidad Interno
Sueros Control Interno (baja reactividad) - PEIC
Evaluación de kits
• Antes del Uso
• Lote a lote

• Control de Calidad Externo

Programas de Evaluación Externa de la Calidad – PEEC
 Sistema de Garantía de la Calidad

Donante Pre-Analítica Analítica Póst-Analítica Resultado

Control de
Calidad Evalua la imprecisión

Interno
Evalúa la Exactitud
Control de Calidad Externo
EVALUACIÓN DE LA CALIDAD
 EVALUACIÓN EXTERNA DE LA CALIDAD

• La frecuencia debe ser mensual, como mínimo.

• Se deben utilizar muestras control optimizadas e
imparciales que puedan garantizar la homogeneidad
y la exactitud de la evaluación.
• El reporte adecuado de los resultados debe ser
dentro de las primeras 72 horas para que se
puedan aplicar medidas oportunas.
Características de las pruebas serológicas para
tamizaje en bancos de sangre
Las pruebas usadas en el tamizaje serológico de donantes de sangre son
Cualitativas.
• Detectan si el parámetro (Ac o Ag) investigado está presente o ausente
• Cada prueba tiene su valor de corte (cut off)
• El índice: valor de lectura / Cut off define si la muestra es reactiva o no-
reactiva.
• La mayoría de los laboratorios adopta la “zona gris” que corresponde a un %
alrededor del valor de corte, donde los resultados son considerados
indeterminados
• Las metodologías empleadas son ELISA, CLIA y IC (pruebas rápidas)
Pruebas serológicas Cualitativas
Variables
• Valor de corte (cut off)
• Valor lectura / Valor de corte (Índice)
• Zona gris (ZG)
• Valores reportados dentro de la ZG
• Caracterización de las muestras control
• Deben servir como referencia.
Valor de corte para las pruebas
serológicas
Consideraciones sobre los PEECS
 Control de Calidad Interno
• Ronda analítica
– De acuerdo con el Clinical & Laboratory Standards
Institute (CLSI) la Ronda Analítica es el intervalo de
tiempo en que se llevan a cabo una serie de mediciones
de manera estable en términos de precisión y exactitud
– Pueden ocurrir efectos adversos que deberán ser
detectados de forma adecuada
– El número, la frecuencia y los niveles de los controles
depende del número y de la magnitud de la Ronda
Analítica
• Flujo continuo o lotes
• Pruebas manuales o automatizadas
 Sueros Control Interno (SCI) de baja
reactividad para monitorear las rondas
diarias en el laboratorio

DO: densidad óptica

o el valor de lectura
URL en CLIA
 Uso diario de SCI
Micro placas ELISA o Corridas cortas (CLIA)

• Micro placas
• SCI+ y SCI- por placa

• Corridas cortas
(alimentación continua)
• SCI al início
• SCI al final

Liberar los resultados solo después de revisar los SCI, además del
comportamiento de los resultados de las muestras de la rutina.
 Uso diario de SCI
Sistemas de alimentación continua
• En equipamientos de alimentación continua de muestras, es
importante establecer los períodos (a cada cuantas
muestras) en que deberán ser introducidos los SCI (+) y (-)
• Lo correcto seria entre cada 100 a 200 muestras
• Los periodos pueden variar de acuerdo con los parámetros,
marcas comerciales, plataformas, metodologías, etc.
• Consultar las orientaciones del fabricante (si las hay)

El Laboratorio es el único responsable por el diseño

del Programa de Control de Calidad
 Corridas largas en equipamientos
automatizados de flujo contínuo (CLIA)

• Número de SCI
Al inicio de la corrida
Durante la corrida
Al final de la corrida

También en algunos eventos, como por

ejemplo, el cambio de lotes de reactivos
Recomendaciones para Grandes rutinas

• Al inicio de las actividades (p/ ej. por la mañana)

• Pasar los calibradores recomendados por el fabricante
• Pasar los SCI (+ y -)
• Si todo está OK, iniciar la rutina
• Establecer critérios de turnos por períodos de 6
a 8 horas.
• Al final de cada turno:
• Pasar nuevamente los SCI (+ y -)
• Si todo está de acuerdo, continuar
• Si el SCI indica resultados alterados, calibrar nuevamente el
equipamiento. Pasar nuevamente el SCI.
Gráfico de Levey-Jennings – SCI
positivo y negativo
Reglas de Westgard
Muchas Gracias!

Preguntas?
amadeo62@gmail.com