“ELISA

ENZYME LINKED IMMUSORBENT ASSAY

ENSAYO INMUNOADSOBENTE LIGADO A ENZIMA
 EL USO DE ENSAYOS

Si una sustancia es elegida como una sustancia de interés, de investigadores e

industria deben ser capaces de probar su presencia, actividad y
concentración. El producto debe ser “ensayado”.
Otros ensayos son hechos para potencia, toxicidad y estabilidad.
Los ensayos son efectuados en cada paso en la investigación, desarrollo,
manufactura y control de calidad de un producto.
 INTRODUCCIÓN A ELISA

ELISA- acrónimo de Ensayo por Inmunoadsorción Ligado a Enzimas.

Una técnica que mide o identifica la cantidad de la proteína especifica en una
solución.
ELISA- Se usa un anticuerpo o muestra para reconocer una proteína especifica
(Ag) y un anticuerpo secundario ligado a enzima, la cual causa un cambio de
color en presencia de un sustrato.
Entre mas desarrollo de color se observe en una ELISA, indica un título mayor
de anticuerpo.
 VENTAJAS DE ELISA

Sensibilidad: niveles de nanogramos o menores.

Reproducible
Reactivos mínimos
Cualitativo y cuantitativo
• Cualitativo ejemplo: Prueba de VIH
• Ensayos cuantitativos ejemplo: vigilancia de medicamentos

Gran campo de aplicación: los beneficios pueden ser cubiertos con Antígenos o Anticuerpos
Capaz de automatizarse: alta velocidad
No hay riesgos de radiación
 FUNDAMENTO DEL ELISA
Ag o Ac fijado a una Ag o Ac en la muestra Conjugado: Sustrato
fase sólida Ac unido a una
enzima

Cambio de color
 COMPONENTES DE ELISA

❑ Fase sólida

❑ Antígeno o anticuerpo

❑ Conjugado: enzima

❑ Sustrato
FASE SOLIDA
 ANTICUERPOS Y ANTÍGENOS
Los anticuerpos utilizados en el Los antígenos usados se
método ELISA son de origen purifican o son
monoclonal o policlonal que se recombinantes se utilizan
suministran como antisuero no como conjugados marcados
fraccionado o fracciones de o enzimáticos y son
inmunoglobulina purificada, inmóviles o solubles,
pueden ser solubles o estar dependiendo del protocolo
inmóviles en un soporte sólido. de análisis.
El reactivo que se forma de
la unión covalente entre
enzima y antígeno o
anticuerpo es el conjugado.
INTERACCIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO
 CARACTERÍSTICAS DEL AC RELACIONADAS CON EL
RECONOCIMIENTO DEL AG
o Especificidad

o Diversidad

o Afinidad y avidez
 ENZIMAS

• La enzima debe tener una reactividad específica

• Debe ser fácilmente acopladas a ligandos y el anticuerpo conjugado debe ser estable

• La reactividad debería ser retenida después del ligado de la Enzima al antígeno/anticuerpo

• Las enzimas escogidas no deben estar presentes en las muestras de paciente

• Ejemplo de enzimas
• Peroxidasa de Rábano picante, Fosfatasa Alcalina, Oxidasa Glucosa
 SUSTRATOS

Requerimientos del sustrato:

• Solubles en agua

• Fácil de manipular

• No tóxicos

• Bajo costo
 ADICIÓN DE SUSTRATO

• Preparar el sustrato al mezclar 1:1

• Agregar 100 µl/pozo

• Incubar por 10 minutos, Evitar el desarrollo excesivo de color (La

especulación no será capaz de ser leída)

• Terminar la reacción al agregar 0.5 M H2SO4 (El color cambia de azul a

amarillo)
 TIPOS DE ELISA

Directo

Indirecto

Competitivo

Sandwich
 SANDWICH

• La Placa de ELISA es cubierta con un anticuerpo para detectar un antígeno

especìfico
• Preparar la superficie en la cual una cantidad conocida de anticuerpo de
captura es plaqueado

• Bloquear cualquier sitio de ligadura no especifica en la superficie

• Aplicar la muestra que contiene el antígeno a la placa

• Lavar la placa para eliminar el exceso de antígeno o anticuerpo

• Aplicar los anticuerpos primarios de enzima ligada como detección de

anticuerpos el cual también se ligará específicamente al antígeno

• Lavar la placa. Tal que los conjugados antígeno.-enzima no empalmado sean

removidos
• Usar un sustrato el cual es convertido por la enzima en un producto
colorido

• Medir la Absobancia de la placa para determinar la presencia y cantidad del

antigeno o anticuerpo.
 PLACA DE ELISA

• Placa de 96 pozos

• Esta hecha de plástico en el cual la proteína puede ser adsorbida (ligada) fácilmente

• Usualmente se plaquea y se deja reposar durante la noche

• Una solución amortiguadora es usada para no desnaturalizar el anticuerpo y

maximizar el enlace

• Pasos de bloqueo aseguran que no se dejen espacios vacios

• Reactivo de bloqueo usualmente 10% FBS

 CURVA ESTÁNDAR

• Diluciones en serie de la citocina son medidas

• Concentración exacta es requerida

• Un mapeo de la concentración (pg/mL o nr/mL) es trazada contra DO (

Densidad Óptica)
 SENSIBILIDAD DE ELISA

• Típicamente puede ser detectada la más baja concentración de Citocina

sobre un control negativo

• 2-3 S. D Señal de Fondo Arriba del Promedio

• Dependiendo del par de antígenos usados es la variación

• Ex 10 pg/mL
 BLOQUEO

• Reactivo de Bloqueo 10% FBS en PBS

• Alternativamente 1% BSA (Grado de inmunoensayo)

• Filtrar para remover partículas

• Placa es puesta a R.T.

• Agregar 200 µl por regulador de bloqueo de pozos

• Esperar por 2 horas a R.T.

• Por que bloqueamos?

 DESPUÉS DE BLOQUEAR

• Lavar 3 veces con PBS/Tween (Detergente)

• Agregar estándares + muestras

• Muestras son demostrativas de cultivos o suero/plasma de pacientes

• Usar 100 µl

• Dilución más frecuente es requerida si la señal es muy frecuente

• Estandares?
 PREPARACIÓN ESTÁNDAR

• Estándares son diluidos en los reguladores de bloqueo

• Comenzar por etiquetar 8 tubos Eppendorf de 1mL

• Preparar el tubo de mayor concentración (1mL)

• Llenar los tubos remanentes con el regulador de bloqueo de 0.5 mL

• Diluir en serie del más alto al más bajo

• Asumiendo que se tiene un tubo de reserva a 2ng/microL, Volumen 5 µl

• Usualmente la Citocina Estándar es descartada

• Congelacion-Descongelación afecta la Citocina

 DESPUÉS DE LA PREPARACIÓN ESTÁNDAR

• Agregar muestras, Estándares, Control negativo

• Control negativo debería ser el regulador que se use para la dilución estándar o el
medio de cultivo

• Incubar por 2 Hrs a R.T.

• Aspirar y lavar 5 veces

 ADICIÓN DE AC DE DETECCIÓN
• La Avidina es un Producto de Huevo de gallina
• La Avidina tiene una gran afinidad para la Biotina (Vitamina B)
• Vitamina B es conjugada en la detección de Anticuerpos
• Agregar detector de trabajo a 100microL/pozo
• Ex. Anticuerpo detector de existencia = 0.5 microg/mL
• Usar 10 µl de anticuerpo de existencia
• Agregar 5 µl de Enzima (Avidin-HRP)
• Dilución es 1:1000

• Incubar por 60 minutos a R.T

• Lavar 3 veces
 APLICACIONES DE INMUNOENSAYOS
[RIA & ELISA]
• Análisis de hormonas, vitaminas, metabolitos, marcadores de diagnosticos
• Ej. ACTH, FSH, T3, T4, Glucagon, Insulina, Testosterona, Vitamina B12, prostaglandinas,
glucotiroides

• Monitoreo de medicamentos terapéuticos

• Barbituricos, Morfina, Digoxina

• Procedimientos diagnósticos para detección de infecciones

• VIH, Hepatitis A, B, etc.
 EXACTITUD Y PRECISIÓN
• Exactitud significa que el ensayo está determinando la correcta concentración

• Precisión es la reproductibilidad de un ensayo

• Sensibilidad y especificidad son subconjuntos de exactitud y precisión

• Un ensayo que tiene la habilidad de producir resultados precisos y exactos y que no produce falsos
positivos es considerado especifico
• Un ensayo que tiene la habilidad de producir resultados precisos y exactos y que no produce falsos
negativos es llamado Sensible
 UN EJEMPLO DE UN EXPERIMENTO DE ELISA

• Antes de comenzar el trabajo, leer cuidadosamente las instrucciones del kit

• 1.- La placa de 96 pozos es etiquetada cuidadosamente y los primeros son

usados para dibujar la curva estándar
 RESULTADOS

• Después de leer los resultados la curva estándar es dibujada donde la

concentración es trazada en el eje X y la absobancia en el eje Y
• La concentración estándar es especificada en el eje X y la lectura de cada
estándar es especificada en el eje Y y la curva estándar es trazada
• La curva estándar es usada para determinar la concentración desconocida
para cada muestra mediante la localización de la a concentración opuesta a
la absobencia

Absorption
nm

Concentration ng/ml
• El control de calidad de la concentración de la muestra es determinado de la
curva estándar y si el resultado está en el rango dado por el Kit del
Fabricante los resultados pueden ser aceptados
• La muestra es agregada a la placa en duplicado o triplicado y entonces el
valor resultado promedio es calculado

• El control de calidad de la muestra el cual es provisto con el Kit es tratado

como las muestras de prueba