SEPARACION DE CELULAS

SEPARACIÓN
CELULAR
Técnica de separación física o inmunológica.
Tienen la ventaja de que dan un alto rendimiento
mas rápido que la clonación, aunque no con la
misma pureza.
Las técnicas de separación más exitosas
dependen de las diferencias en:

 La densidad de células
 La afinidad de los anticuerpos a los epítopos
de superficie celular
 Tamaño de célula
 Dispersión de luz o de emisión fluorescente.

Las separaciones más eficaces a menudo emplean dos o más parámetros

para obtener un alto nivel de pureza.
 DENSIDAD CELULAR Y LA SEDIMENTACIÓN ISOPICNICA

La separación de las células por densidad puede

ser realizada por centrifugación a baja g con un
equipo convencional.
Las células se sedimentan en un gradiente de
densidad a una posición de equilibrio equivalente
a su propia densidad.

El medio de la densidad no debe ser tóxico ni

viscoso a altas densidades y debe ejercer poca
presión osmótica en solución.
Albúmina sérica Percoll

Ficoll
Un gradiente puede ser
generado por:
• Capas de diferentes
densidades de Percoll
con una pipeta, jeringa
o bomba.
• Con un gradiente
especial.
• Centrifugado de alta
velocidad.
 VARIACIONES

POSICIÓN DE LAS CÉLULAS

• Las células se pueden incorporar en el gradiente

durante su formación por centrifugación.
• las células se pueden dañar a una alta fuerza de
g.
• Percoll, Isopaque, y metrizamida puede ser
absorbido por las células
Otros medios

Ficoll es uno de los medios más populares, ya que,

al igual que Percoll, puede ser tratado en autoclave.
Ficoll es un poco más viscoso a altas densidades y
puede causar que algunas células se aglutinen.

Metrizamida (Nycomed), un derivado no iónico de

metrizoato, que es una sustancia yodada, es menos
viscoso a altas densidades, pero puede ser tomado
por algunas células.
 SEDIMENTACIÓN ISOPICNICA
Sedimentación Isopicnica es más rápida que la
velocidad de sedimentación y da un mayor
rendimiento de las células de un determinado volumen
de gradiente.

La densidad celular puede verse afectada por:

• La absorción del medio utilizado para formar el
gradiente
• La posición de las células en el ciclo de crecimiento
• El suero.
 Tamaño de las células y
velocidad de sedimentación
• La sedimentacion celular esta influenciada por
el tamaño celular, factor que es determinante a
1 g.

v: velocidad de sedimentacion mm/h

r: radio celular μm
• La unidad de sedimentación de gravedad no es
capaz de manejar un gran numero de células
1x106 células/cm2, a menos que las diferencias
de densidad sean relativamente grandes entre
los tipos de células.
Elutriación centrifuga
Técnicas basadas en anticuerpos
• Estas son una serie de técnicas que aprovechan
el enlace especifico de un anticuerpo con la
superficie celular.

• Lisis
• Señalización
• Fluorescencia celular activada
• Separación inmunomagnetica
Separación inmunomagnetica
Sorteo magnético
14.4 CLASIFICACION ACTIVADA POR FLUORESCENCIA CELULAR
Opera mediante la
proyección de un flujo
único de las células a
través de un haz de
láser de tal manera
que la luz dispersada
por las células es
detectada por uno o
más
fotomultiplicadores y
registro.
Si las células se tratan previamente con una
mancha fluorescente o un anticuerpo
fluorescente, la emisión de fluorescencia
excitada por el láser es detectado por un
segundo tubo fotomultiplicador
• La información obtenida a continuación, se
procesa y se muestra como un gráfico de
puntos, o en un número de otros formatos
Un citómetro de flujo es un instrumento
analítico que procesa la salida de los
fotomultiplicadores para analizar la
constitución de una población de células
• Un clasificador de células activadas por
fluorescencia es un instrumento que utiliza las
señales de emisión de cada célula para
ordenar la célula en uno de varios tubos
donde es recogidas las muestras y un depósito
de residuos.
Este método puede ser utilizado para las células
separadas de acuerdo con las diferencias que
puedan ser detectados por :
• Dispersión de la luz (por ejemplo, tamaño de
celda) o de
• Fluorescencia (por ejemplo, ADN, ARN, o el
contenido de proteína; actividad de la enzima;
antígenos específicos)
• Probablemente se ha utilizado más
ampliamente para células hematopoyéticas,
para el que la desagregación en la suspensión
de una sola célula obligatoria es relativamente
simple, pero también se ha utilizado para los
tejidos sólidos como de pulmón, la piel y el
corazón.
• Es una herramienta muy potente, pero está
limitado por el rendimiento de células
aproximadamente 1 × 107 células
 OTRAS TÉCNICAS
METODO BASE PARA LA EQUIPO COMENTARIOS
SEPARACION
Velocidad de Tamaño de la célula Separación por Técnica sencilla, no
sedimentación a 1 g embudos y muy alta resolución
deflectores o rendimiento
Sedimentación Densidad celular Centrifuga Simple y rápida
isopicnica
Elutriación Tamaño celular, Centrifuga especial Rápido,
centrifuga densidad. y rotor elutriador rendimiento celular
alto, proceso
complejo
Cromatografía por Antígenos de la Esterilizable,
afinidad superficie celular, Cromatografía en
Carbohidratos de la columna
superficie celular
14.6 ENFOQUE DEL PRINCIPIANTE A LA
SEPARACIÓN CELULAR
• Es mejor empezar con una
técnica simple tal como
centrifugación en
gradiente de densidad o
• MACS.
• Si la resolución o el
rendimiento es
insuficiente, entonces
puede ser necesario
emplear FACS o
elutriación centrífuga.
• Cuando se requiere una purificación de varios
registros y de cultivo selectivo no es una
opción, será necesario emplear al menos un
fraccionamiento de dos pasos, de una manera
análoga a la purificación de proteínas
• En muchos de estos procedimientos, la
separación en gradiente de densidad se usa
como un primer paso, con la panorámica o
MACS como un segundo, y la purificación final
se realiza por FACS.