ISO 7218:2007

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Requerimientos generales y Directrices para los
exámenes microbiológicos
 ISO 7218

El sentido común en el
laboratorio

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 ISO 7218, 2007
INTRODUCCIÓN

 Solo aquellos microorganismos que estén presentes en

la muestra sean aislados y enumerados

 Los microorganismos no contaminen el ambiente

INTRODUCCIÓN

Medidas de higiene personal

Empleo de técnicas de trabajo

Asegurar

• Ausencia de contaminación de origen externo

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 ISO 7218, 2007

Precauciones a tener en cuenta durante los

análisis microbiológicos

Establece las principales medidas para la preparación,

esterilización y almacenamiento de medios de cultivo, así
como para la utilización de equipos

Abarca el análisis de bacterias, levaduras y mohos

Afecta a la microbiología de los alimentos para consumo

humano, la alimentación animal y las muestras ambientales
procedentes de la producción de alimentos y la producción 5
primaria
 OBJETO
 Asegurar la VALIDEZ de los análisis microbiológicos de
los alimentos

 Asegurar técnicas generales iguales en todos los

laboratorios

 Conseguir unos resultados homogéneos en todos los

laboratorios

 Seguridad del personal de laboratorio 6

 3. Instalaciones ISO 7218, 2007

 Diseño y organización en la distribución del lab

 Análisis de muestras de producción primarias separado del
de otras muestras
 Recepción y preparación de la muestra SEPARADAS

Reduce el riesgo de contaminación cruzada

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 ISO 7218, 2007
3.2 Consideraciones de Seguridad

 Categoria de riesgo 1 (ningún o muy bajo riesgo para el

individuo y la comunidad)
Baja probabilidad de producir enfermedad en humanos y
animales

 Categoría de riesgo 2 (riesgo moderado para el indivíduo y

muy bajo para la comunidad)
Patógeno que puede causar enfermedad en humanos y animales
pero muy improbablemente causará daño a los trabajadores del
laboratorio, a la comunidad o al medio ambiente. Hay
tratamiento efectivo, hay medidas preventivas y el riesgo de
diseminación de la infección es limitado.
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 ISO 7218, 2007
3.2 Consideraciones de Seguridad
 Categoria de riesgo 3 (alto riesgo para el individuo y bajo para
la comunidad)
Patógeno que habitualmente causa enfermedad seria en
humanos y animales, pero no suele diseminarse desde un
individuo infectado a otros. Hay tratamiento efectivo y se
dispone de medidas preventivas.

 Categoría de riesgo 4 (alto riesgo para el indivíduo y para la

comunidad)
Patógeno que habitualmente causa enfermedad seria en
humanos y animales y puede transmitirse desde un individuo
infectado a otros directa o indirectamente. Generalmente no hay
tratamiento efectivo ni se dispone de medidas preventivas.

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 ISO 7218, 2007
3.3 Diseño del Laboratorio

• Áreas destinadas a las Muestras y Análisis

• Áreas Generales

SEPARADAS
 ISO 7218, 2007
Diseño del Laboratorio
3.4.2 Áreas asociadas a las muestras y a los análisis
Se considera una buena práctica tener localizaciones separadas o áreas claramente
designadas para

Recepción y conservación de muestras

Preparación de muestras (materia prima)
Examen de las muestras, desde la dilución inicial hasta la incubación
Manipulación de presuntos patógenos
Conservación de cepas de referencia y otras
Preparación y esterilización de medios de cultivo y equipos
Conservación de medios de cultivo y reactivos
Examen de esterilidad de productos alimenticios
Descontaminación
Limpieza del material de vídrio y otro equipo
Conservación de productos químicos peligrosos, preferiblemente guardados en
cabinas especialmente diseñadas, armarios, habitaciones….
 ISO 7218, 2007
Diseño del Laboratorio

Debería considerarse disponer de áreas separadas para

3.4.3 Áreas generales

Entradas, pasillos, escaleras, ascensores
Áreas administrativas
Servicios, habitaciones para cambiarse la ropa
Archivos
Almacenes
Salas de descanso
Otros
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3.5 Distribución y característica de los edificios
3.5.1 OBJETIVO: -
Que el ambiente del laboratorio no afecte a la fiabilidad de los resultados

Evitar el riesgo de contaminación cruzada

-ejem. - diseño de no retorno
- trabajo de manera secuencial asegurando la integridad de la muestra
- actividades separadas en TIEMPO o ESPACIO

y, además:

Evitar condiciones extremas tales como exceso de

Temperatura,
Polvo,
Humedad,
Vapor, Mantener el espacio de trabajo
Ruido, limpio y ordenado
Vibraciones…
A >volumen de trabajo>espacio
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3.5Distribución y característica de los edificios
3.5.2 Características:
Paredes, techos y suelos lisos, fáciles de limpiar
Suelos antideslizantes
Tuberías aisladas herméticamente
Puertas y ventanas diseñadas para poder cerrarse y
limpiarse
Tª ambiente (18-27ºC)
Calidad del aire (sistema de filtración)
Sistema de extracción para evitar la exposición al polvo
de los medios de cultivo
Emplear cabinas de flujo laminar y cabinas de seguridad
Ambiente protegido de la radiación solar
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3.5Distribución y característica de los edificios
3.5.3:Otros aspectos
Disponibilidad de agua corriente, suministro eléctrico, gas
Iluminación adecuada
Mobiliario y mesas de material liso, impermeables fáciles de
limpiar
Mobiliario diseñado para la fácil limpieza
Ausencia en la zona de análisis de documentos etc
Disponibilidad de lugares para guardar la documentación
Lavamanos en todas las salas
Autoclave para la destrucción del material de desecho
Sistemas de seguridad de protección contra el fuego, duchas
de emergencia y lavaojos.
Servicios de primeros auxilios
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3.6 Limpieza y desinfección
Reparación y mantenimiento de roturas en suelos,
paredes, techos, mesas, para evitar acúmulos de
microorg.
Desinfección y limpieza periódica
Mantenimiento periódico de los sistemas de
ventilación y sus filtros.
Verifiación periódica de la calidad microbiológica de
las superficies de trabajo y del aire
Estimar la contaminación de las superficies
 Placa de contacto con agentes neutralizantes
 Exponer una placa (no selectiva)
al aire 15 min
 4. el personal ISO 7218, 2007

4.2 Competencia (criterios objetivos de evaluación)

4.3 Verificación permanente de la competencia (controles internos, IL…)
4.5 Higiene
• Evitar la contaminación de la muestra y de los medios de cultivo
• Evitar el riesgo de infección del personal
• Ropa limpia y de un material no inflamable
• No usar esa misma ropa fuera del área de trabajo
• Usar protectores de pelo y barba
• Uñas límpias y preferiblemente cortas
• Lavar las manos antes y después de ir al servicio
• Secarse con papel de un solo uso
• Cuando se trabaja con la muestra expuesta, el medio de cultivo o cuando
se está inoculando, evitar hablar, toser, etc
• No comer ni beber en el laboratorio ni utilizar las neveras o los congeladores
para los alimentos de consumo personal
• Tomar precauciones cuando se tengan infecciones en la piel
• Pipetear con la boca está totalmente prohibido
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5. Aparatos y equipos

 Antes de utilizar verificar si cumplen con la

intención prevista (Uso)
 Mantener límpios y en buenas condiciones de
funcionamiento (BPL) (Mantenimiento)
 Cuando sea necesario calibrar frente a
estándares (Verificación)
 Para equipos con control de Tª comprobar
homogeneidad y estabilidad (Verificación)
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 ISO 7218, 2007
5. Aparatos y equipos
• Operador
• Medio ambiente
 5.2 Cabinas de seguridad • Muestra
 5.3 Balanzas y diluidores gravimétricos
 5.4 Homogenizadores, y mezcladores • 1-3 min

 5.5 pHmetros
No usar el mismo autoclave para esterilizar
 5.6 Autoclaves el material limpio y para descontaminar el
equipo o los medios de cultivo usados a la vez
 5.7 Preparador de medios
Lavar y enjuagar exhaustivamente
 5.8 Incubador entre cada lote de medios (agua pura)

• Temperatura estable y uniforme

• Que no le de la luz del sol directamente
• No llenarlo 19
• Limpiar y desinfectar regularmente
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5. Aparatos y equipos
• Conservación de muestras para análisis: 3ºC±2ºC
• Otros usos 5ºC±3ºC
Utilizar diferentes cámaras o al menos diferentes contenedores para conseguir una
separación física en la conservación de:
 5.9 Neveras y cámaras de refrigeración
• Medios de cultivo sin inocular y reactivos
 5.10 Congeladores y ultracongeladores
• Muestras
• Cultivos de microorganismos y medios inoculados
 5.11 Baños termostáticos -15ºC , -18ºC
Por debajo de -70ºC
 5.12 Vapor fluente y baños de agua
hirviendo
 5.13 Horno de esterilización
 5.14 Horno microondas 160ºC , 180ºC

 5.15 Lavavajillas

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¡Ojo! Verificar que el material queda libre de sustancias inhibidoras

 ISO 7218, 2007
5. Aparatos y equipos

 5.16 Microscopio óptico

 5.17 Mechero bunsen o incinerador de asas.
 5.18 Dispensadores de medios de cultivo y reactivos
 5.19 Mezcladores “Vortex”
 5.20 Contadores de colonias
 5.21 Equipos para cultivos en atmósferas modificadas
 Anaeróbiosis [O2]<1% y [CO2]9-13%
 Microaerofilia [O2] 5-7% y [CO2]10% Verificar con indicador
Químico o Biológico

 5.22 Centrífuga 21
 ISO 7218, 2007

5. Aparatos y equipos

5.23 Placas calefactoras (limpiar)

5.24 Sembrador espiral (v3 determinado)
5.25 Destiladores, desionizadores y unidades de ósmosis
inversa (<25µsiemens; control microbilog)
5.26 Cronómetros/Temporizadores
5.27 Pipetas y pipeteadores
5.28 Termómetros y dispositivos para monitorización de
temperatura
5.29 Separador inmunomagnético
5.30 Sistemas de filtración
5.31 Otros equipos y “software”
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 ISO 7218, 2007

6. Preparación del material de vidrio y de otro material

de laboratorio

 Material adecuado
• Calor seco: 1 hora a 170ºC
 Utilizarse adecuadamente • Calor húmedo: 15´ a 121ºC
 Esterilizado o bien desechable • Compuestos químicos

 Almacenado alejado del polvo

Después de usar

• Descontaminación Al menos 30´ a 121ºC

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 ISO 7218, 2007
7. Preparación y utilización de medios de cultivo
 ISO/TS 11133 -1 e ISO/TS 11133 -2
8. Muestras de laboratorio
• Representativa del lote de producto
• Que no se cambie o dañe durante el transporte y almacenamiento
• Protegida de contaminaciones externas ocasionadas por el aire, el recipiente,
los equipos de toma de muestra o por una incorrecta manipulación.
• Etiquetada y perfectamente empaquetada
• Enviada inmediatamente y procesada sin demora (24h, 36h si no -18ºC)
Tª transporte
- productos estables: temperatura ambiente (<40ºC)
productos congelados: < -15ºC y preferiblemente < -18ºC
otros productos no estables a Tª ambiente: 1-8ºC
Tª almacenamiento
- productos estables: temperatura ambiente (18-27ºC)
productos congelados: < -15ºC y preferiblemente < -18ºC
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otros productos no estables a Tª ambiente: 1-8ºC
 ISO 7218, 2007
8.5.2 Conservación y Destrucción de las Muestras

Conservar las muestras de laboratorio hasta los RESULTADOS

Nota:
Habitualmente no se acepta la práctica de re-testar las muestras, debido a los posibles
cambios en el “status” microbiológico

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 ISO 7218, 2007
9. Examen

9. 1 Precauciones higiénicas durante el análisis

• Evitar contaminar el ambiente

• Evitar contaminar la muestra

Algunos aspectos a destacar:

“Los aerosoles son la causa principal de infección y de contaminación
ambiental”
Ejem:
• Al abrir placas Petri, tubos, botellas
• Cuando se utilizan agitadores, jeringas, centrífugas, etc
• Cuando se vacían pipetas
• Cuando se esterilizan agujas o asas de siembra
• Cuando se abren ampollas que contienen cultivos liofilizados 26
 ISO 7218, 2007
9. Examen
9. 1 Precauciones higiénicas durante el análisis

 Área de trabajo limpia y sin corrientes

 Descontaminación de la superficie de trabajo antes y después del trabajo.
 Tener disponible todo lo necesario para realizar el trabajo
 Realizar el trabajo sin demoras
 Separar las actividades “limpias” y “sucias” en tiempo y lugar
 Utilizar equipamiento desechable
 Los paquetes de material que no se terminen cerrarlas bién (ej. Placas petri)
 Absorber todo tipo de vertido con toallas impregnadas en etanol al 70%.
 Cabinas de seguridad biológica para manipular productos con mioroorg. Patógenos
 Cuidado al retirar las puntas de pipetas estériles, evitar que contaminen otras.
 Evitar que las pipetas toquen el borde o el cuello de las botellas de dilución.

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 ISO 7218, 2007
9. 2 Preparación de las suspensiones y diluciones iniciales

9. 2.1 General

 ISO 6887 o ISO 8261

 El tiempo entre el final de la preparación de la suspensión inicial y

el momento en que el inóculo entra en contacto con el medio de
cultivo no debe exceder 45 min

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 ISO 7218, 2007
9. 2. 2 Concentración

9. 2. 2.1 Centrifugación o Filtración de Membrana

9. 2. 2. 2 Inmunoseparación

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 ISO 7218, 2007
10 Recuento

 Examen directo (Microscopio)

 Inoculación de medios sólidos y líquidos

 Citometría de Flujo

 PCR tiempo real

 ISO 7218, 2007
10. 2 Recuento en medios sólidos

 Una placa por dilución de al menos dos

diluciones sucesivas

 Si se siembra una sola dilución, utilizar dos

placas

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 ISO 7218, 2007

10. 2. 3 Técnica de siembra en profundidad

18-20 ml en О 90mm ; unos 3mm de espesor

Agar fundido y atemperado a 44- 47ºC

10. 2. 4 Inoculación superficial

• Fácil observación de la morfología

• Distinción entre diferentes tipos de colonias
• No estrés por el calor del agar fundido
(se pueden obtener mayores recuentos)

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 ISO 7218, 2007

10. 2. 3 Técnica de siembra en profundidad

10. 2. 4 Inoculación superficial

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 ISO 7218, 2007
10. 2. 4 Inoculación superficial

10. 2. 4.2 Método del asa de extensión (o de la espátula)

10. 2. 4. 3 Método de la siembra en espiral

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 ISO 7218, 2007
10. 2. 5 Incubación

 Incubar inmediatamente después de inocular

 ¡Ojo! Tª
 No apilar mas de 6 placas Petri
 Separar las filas al menos 25 mm
 Examinar inmediatamentte después de la
incubación, (a veces se puden dejar en
refrigeranción hasta 48 horas).

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10. 3 Cálculo y Expresión de los Resultados obtenidos con medios Sólidos ISO 7218, 2007

 Contar solo las placas con < de 300 colonias

(Totales, típicas o sospechosas)
 Para que un resultado sea válido se considera generalmente necesario
contar las colonias de al menos una placa que contenga al menos 10
colonias (colonias totales, colonias típicas o colonías que cumplen con
los criterios de identificación)

10. 4. 2 Recuento de colonias de Mohos y Levaduras

• Contar las placas que contengan entre 10 y 150 colonias

36
 10. 3 Cálculo y Expresión de los Resultados obtenidos con medios Sólidos ISO 7218, 2007

• Inoculación de una placa Petri de 90 mm por cada dilución

• Recuento máximo de colonias totales (típicas y atípicas) ≤ 300
colonias
• Recuento máximo de colonias típicas o sospechosas: 150 por placa
• Nº de placas para posterior confirmación: 5
• Método de cálculo: Caso general (Rco. Colonias totales o típicas)

N
a
V n1  0,1n2 d
Donde: Σ a suma de las colonias contadas de las placas escogidas
n1: nº de placas escogidas de la primera dilución
n2:nº de placas escogidas de la segunda dilución 37

d: tasa de dilución correspondiente a la primera dilución

v: volumen del inóculo en ml aplicado a cada placa
 10. 3 Cálculo y Expresión de los Resultados obtenidos con medios Sólidos ISO 7218, 2007

Método de cálculo: Después de la identificación

b
a  C
A
Donde:
A: nº de colonias sospechosas (5) de cada placa para el recuento
b: nº de colonias que cumplen los criterios de identificación
C: nº total de colonias sospechosas contadas en cada placa

38
 10. 3 Cálculo y Expresión de los Resultados obtenidos con medios Sólidos ISO 7218, 2007

Método de cálculo: Contiene menos de 10 colonias

Si la placa contiene 4>colonias<10 Caso general

Expresión: “NE” nº estimado de microorganismos por ml o por g
Si la placa contiene < 4 colonias.
Expresión: Hay microorganismos presentes a nivel inferior a (4×d) por
gramo o ml.

Método de cálculo: No contiene colonias

Expresión: Menos de 1/d microorganismos por (ml o g)

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 ISO 7218, 2007
10. 5 Enumeración empleando medio Líquido

Criterios:
• Detección visual de la turbidez
• Producción de gas
• Cambio de color
• Posterior crecimiento en medio de agar selectivo

Cada porción de análisis suministra un valor

CUALITATIVO

CUANTITATIVO NMP

40
 ISO 7218, 2007
11 Método de Detección (Método Cualitativo)

• Determinación de la presencia o ausencia de un

microorganismo particular en una cantidad dada
de producto

• 9 x P ml o 9 x P g
• Se suele pre enriquecer (para favorecer recuperación)
• Se suele incubar en caldos de enriquecimiento selectivo
• Se suele utilizar dos caldos de enriquecimiento selectivo

Aumenta la Sensibilidad del método 41

12 Métodos de Confirmación ISO 7218, 2007

 Usar solo cultivos PUROS

 Un cultivo puro se prepara por selección de una sola

colonia
 Se inocula en un medio de agar no selectivo
 Tras la incubación se selecciona una colonia bien
aislada para someterla a las pruebas de confirmación

42
 ISO 7218, 2007
12 Métodos de Confirmación

 12.3 Tinción de Gram

 12.4 Uso de galerías de identificación bioquímica
 12.5 Uso de sondas de ácidos nucleicos
 12.6 Métodos serológicos
Después de la identificación bioquímica

12.6.2 Pruebas de Aglutinación en porta

12.6.3 Pruebas de Aglutinación de Látex

13. INFORME DEL ANÁLISIS
 Especificar el método de Análisis
 La Tª de incubación si es necesario

 Resultados obtenidos

 Y… todo tipo de detalles o incidencias que pudiera

haber influido sobre los resultados
 Debe incluir TODA la información necesaria para la
completa identificación de la muestra (y es adecuado
que incluya la información necesaria para la
interpretación de los resultados de los análisis)
 La incertidumbre

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 ISO 7218, 2007
14 Validación de Métodos Microbiológicos

 Validación de métodos de referencia (se está

investigando en el subcomité ISO/TC34/SC9)
 Validación de métodos alternativos (ISO 16140)
 Validación de métodos propios (se está investigando por
el subcomité ISO/TC34/SC9)

45
15 Valoración de la calidad de los resultados/ ISO 7218, 2007
Control de calidad del funcionamiento

 15.1 Control Interno de la Calidad : todo

procedimiento diseñado por el laboratorio para
la evaluación contínua de su trabajo

 Objetivo: asegurar la consistencia de los

resultados día a día y la conformidad de los
mismos con los criterios previamente
establecidos

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15 Valoración de la calidad de los resultados/ ISO 7218, 2007
Control de calidad del funcionamiento

 Programa periódico para demostrar que la variabilidad

(entre analistas, entre equipos o entre los materiales) está
bajo control
 Uso de muestras inoculadas artificialmente con niveles variables de contaminación,
incluyendo “targets” y flora indeseable
 Uso de muestras natural o artificialmente contaminadas procedentes de varias
matrices
 Uso de material de referencia (incluyendo material de los ensayos de aptitud)
 Muestras duplicadas
 ……

 Periodicidad: depende de la naturaleza de los análisis y de su

frecuencia 47
15 Aseguramiento de la calidad de los resultados/ ISO 7218, 2007
Control de calidad del funcionamiento

 15.2 Cepas de Referencia

 15.3 Evaluación Externa de la Calidad (Ensayos de

Aptitud, ejercicios interlaboratorios)

 Participación periódica
 Utilización para evaluar las tendencias del laboratorio y para
comprobar la validez de su sistema de calidad global