CICLO 1. INMUNOLOGÍA.

EXPOSICIONES
GRUPO 2. NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA
De acuerdo a la OMS: “la bioseguridad es un enfoque estratégico e integrado para analizar y gestionar los
riesgos relevantes para la vida y la salud humana, animal y vegetal y los riesgos asociados al medio
ambiente”. Involucra la gestión del riesgo biológico, relacionado a manipulación, almacenamiento y
eliminación de agentes biológicos y toxinas.
Gestión de riesgos
● Evaluación
o identificación de riesgos
o evaluación de probabilidades
o identificación de peligros y amenazas
o evaluación de consecuencias.
Antes de realizar cualquier actividad en el laboratorio, es importante realizar una evaluación de riesgos para
identificar y valorar los posibles peligros que puedan surgir. Esta evaluación debe incluir el tipo de agentes
biológicos manipulados, el nivel de riesgo asociado, las medidas de control existentes y cualquier otro factor
relevante.
● Mitigación
o eliminación/sustitución
o controles de ingeniería
o control administrativo
o estandarización y capacitación
o equipos de protección personal
Una vez identificados los riesgos, es crucial implementar medidas de mitigación para reducir la probabilidad
de exposición. Esto incluye el uso de equipos de protección personal (EPP), prácticas seguras de trabajo,
procedimientos de descontaminación y el uso de barreras físicas para prevenir la propagación de agentes
biológicos.
● Desempeño
o Auditorias
o seguimiento de mejoras
o indicadores
Es importante realizar un seguimiento continuo del desempeño de las medidas de control implementadas
para evaluar su eficacia y realizar ajustes si es necesario. Esto puede incluir la revisión de los protocolos de
seguridad, la capacitación del personal y la realización de auditorías internas para garantizar el
cumplimiento de las normas de bioseguridad.
Principios de bioseguridad

1. Universalidad
Se debe incluir a todos los departamentos del laboratorio. Todas las muestras y materiales biológicos deben
considerarse potencialmente peligrosos y tratarse con el mismo nivel de precaución, independientemente de
su origen o clasificación de riesgo.

2. Evaluación de riesgos
Conocimiento de la probabilidad de que ocurran daños y manejarlos de forma segura. Antes de manipular
cualquier agente biológico, se debe evaluar el riesgo asociado y determinar las medidas de control necesarias
para prevenir la exposición.
 3. Uso de barreras
Evitan la exposición directa a muestras potencialmente contaminantes. Se deben utilizar barreras físicas,
como bata de laboratorio, guantes, mascarillas, gafas de protección y pantalla facial, para prevenir la
exposición directa a agentes biológicos.

4. Medios de eliminación del material contaminado

Sin riesgo para los operadores y comunidad. Todos los materiales contaminados deben eliminarse de manera
segura siguiendo los procedimientos establecidos, como la descontaminación con agentes químicos, la
autoclave o la incineración.
Niveles de bioseguridad
1. Grupo 1
agentes de peligro potencial mínimo para el personal y el medioambiente
2. Grupo 2
agentes de moderado peligro potencial para el personal y el medio ambiente
3. Grupo 3
agentes que pueden causar enfermedades serias o letales como resultado de la exposición
4. Grupo 4
Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades graves y que se transmiten fácilmente de un individuo
a otro, directa o indirectamente.

1. Nivel de bioseguridad 1 (BSL-1): Este nivel se aplica a laboratorios de investigación básica donde se
realizan trabajos con agentes de bajo riesgo para los humanos y el medio ambiente. No se requiere ningún
equipo de protección especial y las medidas de seguridad son mínimas.
2. Nivel de bioseguridad 2 (BSL-2): En este nivel se trabajan con agentes de riesgo moderado para los
humanos y el medio ambiente. Se requieren medidas de seguridad adicionales, como el uso de batas, guantes
y gafas de protección. Los laboratorios clínicos suelen trabajar en este nivel, ya que se manejan muestras de
pacientes que pueden contener agentes infecciosos.
3. Nivel de bioseguridad 3 (BSL-3): En este nivel se realizan trabajos con agentes patógenos que pueden
causar enfermedades graves en los humanos y que se transmiten por vías respiratorias. Se requieren medidas
de seguridad más estrictas, como el uso de equipos de protección respiratoria y controles de acceso más
estrictos. Se utilizan en laboratorios de investigación de enfermedades infecciosas como la tuberculosis o la
influenza.
4. Nivel de bioseguridad 4 (BSL-4): Este nivel se aplica a laboratorios de investigación con agentes
patógenos extremadamente peligrosos que pueden causar enfermedades con alta mortalidad y para las cuales
no hay tratamiento efectivo. Se requieren medidas de seguridad muy estrictas, como el uso de trajes de
presión positiva y sistemas de descontaminación de aire. Estos laboratorios se utilizan para trabajar con
enfermedades como el Ebola o el virus del Ébola.
Niveles de bioseguridad 1 y 2
Los laboratorios de diagnóstico y de atención de salud (de salud pública, clínicos o de hospital) deben estar
diseñados para cumplir, como mínimo, los requisitos del nivel de bioseguridad 2
Manual de seguridad

● Acceso
● Protección personal
● Procedimientos
● Zona del trabajo de laboratorio
● Gestión de la bioseguridad
● Diseño e instalaciones del laboratorio
● Manipulación de desechos
GRUPO 3. INSTRUMENTOS Y EQUIPOS
Son esenciales para realizar experimentos o pruebas. Permiten a los científicos manipular y medir diferentes
condiciones o variables en sus ensayos
En términos de tamaño, los instrumentos suelen ser más pequeños y portátiles, mientras que los equipos
pueden ser más voluminosos y estar fijos en el laboratorio.
En cuanto a la complejidad, los instrumentos suelen ser más simples y fáciles de utilizar, mientras que los
equipos pueden requerir un mayor conocimiento técnico y habilidades especializadas para su
funcionamiento.
En términos de funciones, los instrumentos se utilizan para medir y analizar diferentes propiedades y
características de las sustancias, como la temperatura, la concentración, el pH, etc. Los equipos por otro
lado, se utilizan para realizar tareas específicas, como la centrifugación, la destilación, la cromatografía, etc.
INSTRUMENTOS DE LABORATORIO
1. Material para medida de volúmenes aproximados
● Matraz Erlenmeyer: recipiente de vidrio que por su forma es útil para realizar mezclas por agitación y
para la evaporación controlada de líquidos. su forma permite la utilización de tapones. se puede utilizar
para la retención y medición de muestras líquidas químicas o en la preparación de disoluciones.
● Vaso de precipitado: Pueden ser de vidrio pyrex, normal o de plástico. de acuerdo al volumen que
poseen: 10 mL hasta 500 mL. Sirve para contener liquidos o sustancias que a su vez pueden ser
calentadas, en este caso, se utiliza una rejilla de asbesto,para que tenga una temperatura uniforme.
● Probetas: consiste en un cilindro graduado, es decir, lleva grabada una escala por la parte exterior que
permite medir determinados volúmenes de líquidos o soluciones
 2. Material volumétrico para medidas de gran precisión
● Pipeta: son instrumentos utilizados en el laboratorio, generalmente de vidrio, que permiten medir y/o
dispensar volúmenes de forma exacta. Las pipetas se clasifican en:
■ Pipetas Volumétricas: Se emplean para transferir y dispensar un volumen exactamente conocido de
disoluciones patrón o de muestra. Consiste en un tubo largo y estrecho con un ensanchamiento en la
parte central y que en su parte superior comprende la línea de aforo que indica el volumen máximo
que debe alcanzar el líquido y puede dispensar volúmenes que van de 0,5 a 100 mL o más.
■ Pipetas graduadas o de Mohr: pueden medir distintos volúmenes de líquido, ya que lleva una escala
graduada, pudiendo medir volúmenes entre 0,1 y 25 mL. Estas pipetas son ajustadas (por vertido), es
decir la cantidad del líquido vertido corresponde al volumen impreso. Hacen posible la entrega de
volúmenes fraccionados
■ Pipetas serológicas: utilizados para medir y transferir volúmenes de líquidos de manera precisa y
exacta. Estas pipetas se utilizan como en la preparación de medios de cultivo, pruebas de
aglutinación, diluciones seriadas, entre otros.
Las pipetas serológicas tienen la punta calibrada, las graduadas no la tienen calibrada y las
volumetricas miden sólo un volumen de líquido
■ Micropipeta: instrumento de laboratorio empleado para absorber y transferir pequeños volúmenes de
líquidos, en el orden de los microlitros. Y permitir su manejo
● Bureta:Está formada por un tubo de cristal, con una escala graduada en su lateral que permite leer con
precisión la cantidad de líquido que se está midiendo. Se utiliza principalmente en titulaciones, que son
procedimientos químicos en los que se determina la concentración de una sustancia en una muestra.
3. Otros materiales o material de uso específico
● Placas de vidrio: consta de una placa que posee una serie de distribuciones o concavidades separadas
entre sí, las cuales se utilizan para la realización de reacciones químicas. suelen usarse para pruebas de
aglutinación y floculación
● Placas de porcelana: estas son utilizadas para realizar reacciones químicas, ideales para aquellas donde
se evidencie algún cambio de color. para pruebas de inmunohistoquimica
● Placas Microtiter: son utilizadas para microtitulación, en su mayoría de plástico (poliestireno) con
varios pozos (cavidades), separados entre sí, Facilitan la manipulación y el análisis en caso de un gran
número de muestras. son utilizadas para pruebas ELISA
● Laminas portaobjetos y cubreobjetos: se utilizan comúnmente en pruebas de microscopía para observar
y analizar muestras biológicas
● Propipeta: se utiliza para succionar y verter líquidos a través de una pipeta
● Piseta: Contenedor cilíndrico generalmente de plástico con una abertura, al cual se le coloca agua
destilada y algunos solventes orgánicos como etanol, metano y se utiliza para lavado.
● Cronómetro: instrumento utilizado para medir un intervalo de tiempo determinado.
● Termómetro: Es un instrumento utilizado para medir la temperatura con un alto nivel de exactitud.
Puede ser parcial o totalmente inmerso en la sustancia que se está midiendo.
se puede utilizar ambos para una prueba de floculacion, entre otras
● Gradilla: Sirve para almacenar y transportar muestras contenidas en tubos de ensayo, permitiendo
organizar, clasificar y proteger los tubos.
● Varillas agitadoras: instrumento que puede ser plástico o de vidrio y sirve para mezclar o revolver por
medio de agitación algunas sustancias.
● Soporte universal: Es utilizado para sostener diferentes instrumentos de laboratorio, como pinzas,
pipetas, buretas, embudos, entre otros.
● Tubos de ensayo: tienen como propósito principal contener líquidos y sólidos a los cuales se les va a
someter a reacciones químicas u otras pruebas, generalmente de vidrio. Aunque no tiene una graduación
precisa, se puede observar y estimar el volumen mediante la comparación visual con otros recipientes.

EQUIPOS DE LABORATORIO
1. CENTRÍFUGA: se utiliza para separar los componentes de una mezcla en función de su densidad. Para
ello, la muestra se coloca en tubos en una plataforma que gira a alta velocidad, logrando que las
partículas más pesadas se muevan hacia el fondo del tubo y las más ligeras quedan en la parte superior.
2. REFRIGERADOR CON TERMÓMETRO: Su función consiste en mantener, en un ambiente
controlado diversos fluidos y sustancias, para que los mismos se conserven en buenas condiciones.

3. COAGULOMETRO: es un equipo utilizado para medir el tiempo de coagulación de la sangre. La

función principal es realizar pruebas de coagulación, como el tiempo de protrombina (TP) y el tiempo de
tromboplastina parcial activada (TTPa).

4. CONTADOR DE CELULAS: es un equipo utilizado para contar células presentes en una muestra
biológica, como la sangre. Puede utilizarse para contar células del sistema inmunológico, como
linfocitos, monocitos, neutrófilos, entre otros

5. MICROSCOPIO permite observar objetos a través de un lente de aumento para obtener una imagen
ampliada de los mismos. Se utiliza para estudiar la morfología y características de los diferentes
componentes del sistema inmunológico, ejemplo: anticuerpos. INMUNOFLUORESCENCIA: consiste
en la unión de anticuerpos marcados con fluorocromos a antígenos específicos presentes en la muestra

6. ESPECTOFOTOMETRO: es un equipo utilizado para medir la absorbancia de una muestra a

diferentes longitudes de onda. La función principal es determinar la concentración de una sustancia en
una muestra, basándose en la cantidad de luz absorbida por la misma a una longitud de onda específica.
Se utiliza para medir la cantidad de antígenos, anticuerpos u otras sustancias presentes en una muestra
biológica.

7. LECTOR DE ELISA: es un equipo utilizado para medir la cantidad de anticuerpos o antígenos

presentes en una muestra biológica. La función principal es cuantificar la intensidad de la coloración
producida por la reacción entre la enzima unida a un anticuerpo o antígeno y el sustrato químico presente
en la muestra.

8. TERMOCICLADOR: es un equipo utilizado en la técnica de PCR (Reacción en Cadena de la

Polimerasa), que es una herramienta fundamental en el análisis de muestras de ADN y ARN. Es
fundamental para la detección y cuantificación de agentes patógenos o la caracterización de perfiles
genéticos de diferentes organismos.

9. INCUBADORA: es un equipo que proporciona un ambiente controlado de temperatura y humedad para

el crecimiento y desarrollo de cultivos celulares y microorganismos. La función principal de la
incubadora es mantener las condiciones óptimas para el cultivo de células y la realización de
experimentos que requieran un ambiente estable y controlado.

10. CITOMETRO DE FLUJO: es un equipo utilizado para analizar y clasificar células individuales
basándose en diferentes propiedades como tamaño, forma, composición química y función celular. Se
utiliza para analizar la expresión de marcadores de superficie celular en diferentes tipos de células, así
como para cuantificar la presencia de células que expresan ciertos marcadores específicos

11. CRIOSTATO: es un equipo que se utiliza para mantener muestras biológicas a bajas temperaturas,
generalmente entre -20°C y -80°C, con el fin de conservarlas y protegerlas de la degradación. Se utiliza
para almacenar muestras de sangre, sueros, plasma u otros fluidos biológicos que se requieren para
realizar pruebas específicas, como pruebas de anticuerpos, detección de antígenos, etc

12. PARRILLA DE CALENTAMIENTO: es un dispositivo utilizado para calentar muestras y mantenerlas

a una temperatura constante. Su principal función es proporcionar calor de manera uniforme a las
muestras que se colocan sobre ella, lo que es esencial en muchas pruebas y experimentos en el campo de
la inmunología. Por ejemplo: ensayos de inmunofluorescencia
13. AGITADOR DE PIPETAS: es un dispositivo manual que se utiliza para agitar suavemente las pipetas
y ayudar a mezclar líquidos en pequeñas cantidades de forma precisa.

14. AGITADOR MAGNÉTICO: es un equipo automatizado que utiliza un imán giratorio para agitar
líquidos en recipientes como matraces o cristalizadores. Este tipo de agitador es más potente y permite
mezclar volúmenes mayores de líquidos de manera más eficiente que el agitador de pipetas.

15. BAÑO METÁLICO: es un equipo que se utiliza para calentar muestras o reactivos a una temperatura
constante y controlada. Su función principal es ayudar a mantener las condiciones óptimas para llevar a
cabo diferentes pruebas y ensayos en el laboratorio, como por ejemplo la incubación de cultivos
celulares, reacciones de ensayos enzimáticos, entre otros.

16. CAMPANA DE FLUJO LAMINAR: es un equipo utilizado para mantener un ambiente estéril y
protegido para la realización de experimentos y manipulación de muestras biológicas. Su función es
crear un flujo de aire limpio y filtrado que protege las muestras y evita la contaminación por partículas
en suspensión en el ambiente.

17. PHOTODOCUMENTADOR: es un equipo utilizado para capturar y documentar imágenes de geles de

ADN, proteínas u otras muestras biológicas que han sido separadas en un gel de agarosa o poliacrilamida
mediante técnicas de electroforesis.

18. EQUIPO DE ELECTROFORESIS: Es un instrumento utilizado para separar y analizar moléculas de

proteínas, ADN y ARN en función de su tamaño y carga eléctrica, así como para realizar estudios
cuantitativos de las mismas.

GRUPO 4. AGLUTINACIÓN Y HEMAGLUTINACIÓN

AGLUTINACION: “Fenómeno observable”

Es un método de inmunodiagnostico que se basa en una reacción de interacción de Ag particulados

(insolubles, o células) con sus Ac específicos, dando como resultado la formación de agregados/ complejos
inmunológicos solubles en forma de malla microscópica.

Los Ags particulados en suspensión con suero o que contengan Ac ante los determinantes o en partículas
inertes

Ag: Aglutinógeno (placa) “Formación de agregados por la unión de Ag/Ac.”

Ac: Aglutina (suero)

La diferencia entre la precipitación y la aglutinación es que el producto de la aglutinación es visible a simple

vista debido al tamaño más grande de los Agà ocurre en minutos complejos soluble.

Tipos de aglutinación:

Directa o activa: determinación de Ag que forman parte de una célula. Ag celular o de partículas insolubles
constitutivas de un m.o es aglutinado directamente por el Ac. Se determina al Ag.

Indirecta o pasiva: En la superficie de partículas inertes como látex, carbón o eritrocitos (Hemaglutinación
pasiva) se adhieren Ag particulados los recubren artificialmente y ocurre la aglutinación con la interacción
de un Ac. Se detecta / determina al Ac.

Pasiva en reserva: en la superficie de una partícula inerte se adhieren Ac específicos para que ocurra la
aglutinación tras la interacción con un Ag. Se detecta al Ag.

Inhibición de la aglutinación: ausencia de aglutinación: Ag ya fijado a partículas inertes.

Se da por la unión previa del Ag con Acs específicos, impidiendo que los Acs se unan con el Ag.

Aglutinación Ejemplo de ensayo Fundamento del método

DIRECTA Determinación del Ag. Suspensión de Ac provoca la aglutinación.

eritrocitos al 5% tipiaje
Ag aglutina

PASIVA Determinación del Ac. ASO. Ac provoca la aglutinación

Pesquisa del Ac Ag es aglutinado.

heterofilos de la Mono.

PASIVA REVERSA Determinación del Ag. PCR, FR Ac aglutina

Ag provoca la aglutinación.

INHIBICION DE LA Determinación del Ag. Determinación de HCG

AGLUTINACION humana. (prueba de
embarazo)

IMPORTANCIA CLINICA DE LA APLICACIÓN DE METODOD SEROLOGICOS POR LA

AGLUTINACION EN EL DIAGNOSTICO CLINICO.

Los ensayos realizados no solo contribuyen al diagnóstico, sino también al pronóstico y seguimiento de gran
variedad de clínicas.

Constituyen la base de las pruebas inmunológicas para la de Ag microbianos y los Ac sintetizados ante ellos
y demostrar prevalencias o no de ciertos microorganismos.

Aglutinación à alto grado de sensibilidad y enorme cantidad de sustancias identificables.(por aglutinación

pasiva)

RESUMEN 5 características de las reacciones de aglutinación:

1. Requieren presencia de electrolitos del medio.

2. Ocurren en ausencia de complemento.

3. Están influenciadas por pH, T° y otras condiciones físicas y químicas.

4. La agitación mecánica facilita la formación de agregados (aglutinaciónàchoque de moléculas)

5. Tiene lugar en 2 fases:

- Interacción Ag/Ac.

- Intervención de fuerzas no covalentes.

Ag soluble: precipitación.

Ag particulado: aglutinación

Etapas: pre analítica, post analítica y sus controles.

 GRUPO 5.

ELISA E INMUNOPRECIPITACIÓN

PRECIPITACIÓN:

Las reacciones de precipitación son las más simples de realizar y visualizar, al hacer reaccionar un antígeno
soluble con un anticuerpo correspondiente. Al antígeno en cuestión se le llama precipitógeno, es
multivalente (posee varias copias del mismo determinante antigénico) y puede ser de naturaleza proteica,
toxinas u otros productos de bacterias, hongos, virus, etc. Al anticuerpo se le llama precipitina y por lo
general pertenece a las IgG. Estas reacciones son comunes en los laboratorios de diagnóstico, que usan
medios líquidos o sólidos (agar) para realizar la prueba.

La inmunoprecipitación: es una técnica de laboratorio utilizada para aislar y purificar una proteína
específica a partir de una mezcla de proteínas. Esta técnica se basa en la capacidad de los anticuerpos para
reconocer y unirse específicamente a la proteína de interés. Es un método de purificación y enriquecimiento
de proteínas diana en función de reacciones específicas antígeno-anticuerpo.

Se basa en la capacidad de los anticuerpos para reconocer y unirse específicamente a una proteína de interés
en una mezcla de proteínas.

Tipos de Inmunoprecipitación:
La primera de proteína individual se utiliza para purificar y detectar una proteína de interés específica en una
muestra. En esta técnica, un anticuerpo específico se utiliza para inmovilizar y precipitar la proteína de
interés de una mezcla compleja de proteínas. Luego, la proteína se extrae y se analiza utilizando técnicas
como la electroforesis en gel y la espectrometría de masas para su identificación y caracterización.

La inmunoprecipitación de complejos proteicos: se utiliza para purificar y estudiar interacciones

proteína-proteína en un sistema biológico. En esta técnica, se utiliza un anticuerpo específico para
inmovilizar un complejo proteico en una muestra de interés. Luego, el complejo proteico se extrae y se
analiza para identificar las proteínas que interactúan con el objetivo proteico.

Inmunoprecipitación de cromatina: es un método utilizado para determinar la ubicación de los sitios de

unión del ADN en el genoma para una proteína particular de interés, interaccion proteina adn, identifica
secuencias específicas de adn

la inmunoprecipitación de ARN: selecciona ribonucleoproteínas Luego tenemos estos 2 métodos, la

principal diferencia entre estos dos métodos es el soporte utilizado para la inmunoprecipitación. La
inmunoprecipitación en solución se realiza en una solución líquida, mientras que la inmunoprecipitación en
matrices de gel se realiza utilizando una matriz de agarosa o resina en forma de gel.

la inmunoprecipitación en solución: los anticuerpos específicos para la proteína de interés se incuban con
la muestra en una solución líquida. Los complejos anticuerpo-proteína se pueden capturar utilizando perlas
magnéticas recubiertas con proteína A/G, que se une a la porción Fc de los anticuerpos. Después de la
incubación, las perlas magnéticas se separan y se lavan para eliminar otras proteínas no específicas.
Finalmente, se realiza la elución de la proteína inmunoprecipitada para su análisis posterior.

La inmunoprecipitación en matrices de gel: los anticuerpos específicos se inmovilizan en una matriz en

forma de gel, como agarosa o resina. La muestra se carga en la matriz y los complejos anticuerpo-proteína se
forman a medida que los anticuerpos se unen a la proteína de interés. Después de la incubación, se lavan los
contaminantes no específicos y se eluye la proteína inmunoprecipitada para su análisis posterior.

La inmunoprecipitación en solución: es generalmente más rápida y puede ser más adecuada para muestras
complejas. Sin embargo, la inmunoprecipitación en matrices de gel puede proporcionar una mayor
especificidad y pureza de la proteína de interés.
Inmuno Difusión Radial (IDR)
Esta técnica permite cuantificar de manera sencilla inmunoglobulinas de isotipo G, M y A o Antígenos
solubles (C3, C4) presentes en muestras biológicas. La técnica se basa en la difusión de la muestra
conteniendo el antígeno a medir (inmunoglobulinas o antígenos solubles) en una matriz semisólida de agar
en la que se encuentra disuelto el Ac específico. La muestra biológica se introduce en los orificios
cilíndricos excavados en el agar y a medida que el antígeno difunde en forma radial, se alcanza la relación
Ag-Ac que permite la formación de precipitados visibles. Una vez finalizada la difusión se mide el radio (R)
de los precipitados que es proporcional a la concentración de antígeno (C). La concentración de proteína en
la muestra biológica (Cx) se calcula realizando una curva de calibración utilizando muestras de patrones de
concentración conocida.

Inmunoelectroforesis (IEF)
La inmunoelectroforesis es una técnica cualitativa que permite la identificación de diferentes componentes
proteicos presentes en distintas muestras biológicas (suero, orina, etc) a través de arcos de precipitación. La
técnica se realiza preferentemente en geles de agarosa y se distinguen dos etapas: 1) Las muestras se
someten a una separación electroforética.

Terminada la electroforesis, las proteínas interaccionan con los Acs específicos aplicados en el agar en un
canal paralelo al eje de migración. Luego de un período de difusión de los Acs, se observan arcos de
precipitación cuya forma y posición dependen de las características inmunoquímicas y de la concentración
de cada proteína.

En la inmunoelectroforesis, el suero con los anticuerpos se coloca cerca del polo positivo y migra hacia el
polo negativo. Los antígenos de interés se cargan cerca del polo negativo y migran hacia el polo positivo.
Las inmunoglobulinas migran hacia el polo negativo y las proteínas, dada su carga neta negativa, lo hacen
hacia el positivo.

La técnica se realiza preferentemente en geles de agarosa y se distinguen dos etapas:

1.- La muestras se someten a una separación electroforética

2.-Terminada la electroforesis, las proteínas interaccionan con los Acs específicos aplicados en el agar en un
canal paralelo al eje de migración. Luego de un período de difusión de los Acs, se observan arcos de
precipitación cuya forma y posición dependen de las características inmunoquímicas y de la concentración
de cada proteína

Electroforesis por inmunofijacion: Consiste en la separación electroforética de proteínas en un gel,

seguida de inmunoprecipitacion in situ con anticuerpo monoespecífico. Las proteínas que no se precipitan se
eliminan mediante lavado y se revelan bandas de inmunoprecipitacion con tinción para proteínas

Inmunoelectroforesis por contracorriente: El principio básico del método implica la electroforesis en un

medio de gel del Ag y el Ac en direcciones opuestas de manera simultanea a partir de pozos separados con
la precipitación resultante en un punto intermedio a sus orígenes

NOTA: Esta es 10 veces más sensible que las técnicas estándar de difusión doble, sin embargo esta técnica
es solo semicuantitativa.

Electroinmunodifusión única unidimensional (Técnica de Laurell): Su fundamento es medir la cantidad

de antígenos diferentes a las Igs, en esta técnica el antisuero para el Ag particular o para los Ags específicos
que se deseen medir.

Inmunoelectroforesis bidimensional

Transferencia Western

Transferencia Puntual
Medio Liquido: Inmunoturbidimetria e Inmunonefelometria

Cualitativa: Se usa poco ya que existen mejores métodos para detectar presencia o ausencia, además,
debido a lo que mencionamos antes sobre la posible existencia de más de un complejo en la mezcla, para
utilizar este método debemos asegurarnos de que uno de los reactivos esté puro.

Semicuantitativa: Tampoco se usa, constituye un método poco práctico.

Cuantitativa: Esta es la primera técnica que permitió medir en masa la cantidad de Ag. o Ac. presente en
una solución.

Inmunodifusión doble: Se basa en principio, de que cuando el antígeno y el anticuerpo se difunden en un

medio semisólido, ejemplo el agar. Forman complejos inmunitarios estables que se pueden analizar
visualmente ( tiñiendolo con azul de Coomasie).

Aplicaciones clínicas de las diferentes pruebas de inmunoprecipitación.

Detección cualitativa de anticuerpos contra el virus de la Hepatitis C (IgG, IgM, IgA) en suero humano,
plasma o sangre entera.

Detección y ayuda en el diagnóstico de la infección por el VHC.

Analizar proteínas

Detección de Dengue

Indicar las limitaciones y causas de error de las diferentes pruebas de inmunoprecipitación.

El análisis de una única muestra no debe ser el único criterio de diagnóstico

No se puede utilizar la presencia continuada o la ausencia de Ac para determinar el éxito o el fracaso del
tratamiento

Los resultados de pacientes inmunodeprimidos deben interpretarse con precaucion

El diagnóstico final debe basarse en los resultados de la prueba junto con otros hallazgos clínicos y
analíticos

Todos los resultados deben ser considerados con otra información clínica disponible para el médico.

Explicar el fundamento de la técnica de Inmunonefelometría

Método rápido para medir la concentración de antígenos. Los complejos que se forman de la unión
antígeno-anticuerpo son demasiado pequeños para formar precipitados, pero dispersan la luz que se hace
pasar a través de ellos, y así se les puede medir mediante un aparato denominado nefelómetro.

Definir Inmunocromatografía

Es una técnica inmunológica que permite visualizar la reacción antígeno-anticuerpo por la acumulación del
oro coloidal del conjugado en zonas específicas del papel de nitrocelulosa donde se fijan previamente
anticuerpos de captura

Diferenciar los métodos de inmunoprecipitación pasivos y activos.

Activa: Ag y Ac se mueven en direcciones opuestas

Pasiva: Ag y Ac se mueven en la misma dirección

TÉCNICA DE ELISA

El Ensayo de inmunoadsorción ligado a enzima es una técnica biomolecular que combina la especificidad de
un anticuerpo con la sensibilidad de los ensayos enzimáticos. En esta técnica se emplean anticuerpos o
antígenos unidos de manera covalente a enzimas. Las enzimas conjugadas se seleccionan con base en su
capacidad para catalizar la conversión de un sustrato en un producto coloreado, fluorescente o
quimioluminiscente.

Este ensayo cuenta con diferentes tipos que permiten detectar cualitativamente la presencia de un
determinado anticuerpo o antígeno. Así mismo, puede prepararse una curva estándar basada en
concentraciones conocidas de anticuerpo o antígeno,y usarla para determinar la concentración de una
muestra.

ELISA DIRECTO

Es el más simple y rápido de todos, donde un anticuerpo primario marcado con una enzima se unirá
directamente a un antígeno previamente inmovilizado, permitiendo la detección y/o cuantificación del
mismo al añadir un sustrato que produzca una coloración particular al reaccionar.

ELISA INDIRECTO
Es parecido al ELISA directo pero en dos pasos, lo que permite amplificar la señal obtenida. En este caso, el
antígeno se une al fondo del pocillo de la microplaca y posteriormente se añade un anticuerpo primario
específico del antígeno. Luego, se agrega un anticuerpo secundario conjugado con una enzima que se une al
anticuerpo primario y esto producirá una reacción visible al agregar un sustrato.

ELISA SANDWICH
Se usan dos anticuerpos específicos de dos epítopos diferentes presentes en el antígeno diana. El anticuerpo
de captura se une al fondo del pocillo de la microplaca uniéndose a uno de los epítopos del antígeno. El
anticuerpo de detección se une a un epítopo diferente del antígeno y está conjugado a una enzima que
permitirá su detección al agregar un sustrato.
Este ensayo tiene una particularidad, pues para que funcione, los dos anticuerpos usados para las fases de
inmovilización (captura) y detección del antígeno, deben ser un par de anticuerpos monoclonales específicos
para epítopos diferentes de dicho antígeno.

ELISA COMPETITIVO
Es una variante más compleja, donde se usa un antígeno de referencia que competirá con el antígeno de la
muestra para unirse al anticuerpo primario. Primero, debe incubarse una solución Ag-Ac para ser agregada a
un pocillo cubierto por antígeno. Mientras más antígeno está presente en la muestra de fase de solución
inicial, menos anticuerpo libre estará disponible para unirse al pozo cubierto con antígeno.

Después de eliminar por lavado el anticuerpo no unido, puede añadirse un segundo anticuerpo conjugado
con enzima específico para el isotipo del anticuerpo primario, para así determinar la cantidad de este unido
al pozo.

Cuanto más alta es la concentración de antígeno en la muestra original, más baja es la señal final.

¿QUÉ NOS OFRECE ELISA?

Este tipo de pruebas son característicos por su alta sensibilidad y su gran flexibilidad en cuanto a usos, pues
al poder detectar antígenos o anticuerpos específicos, su rango de acción es amplio, acá les traemos algunos
casos particulares como:
El Elisa Sandwich es ideal para:

· Medición de concentraciones de citocina soluble en sobrenadantes en cultivo de tejido, suero o líquidos

corporales.

· Diagnóstico de embarazos al detectar la presencia de la hormona GCH en sangre u orina.

· Diagnóstico de COVID-19, al detectar anticuerpos producidos frente a la infección.

Mientras que el Elisa Indirecto es ideal para:

· Detectar la presencia de anticuerpos séricos contra el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH)

GRUPO 6. VDRL

La prueba denominada VDRL recibe su nombre de las siglas del Venereal Diseases Research Laboratory,
institución que la desarrolló alrededor de 1946. Es una de las pruebas serológicas que ayudan al diagnóstico
de sífilis o enfermedad de Lues, causada por la espiroqueta Treponema pallidum. Por su bajo costo,
simpleza y rapidez, es utilizada como primer tamizaje serológico para la detección de esta infección, seguida
de pruebas confirmatorias, como la inmunofluorescencia indirecta para anticuerpos anti-treponémicos (ej.
FTA-ABS, fluorescent treponemal antibodies absorption test), u otras.

La infección por treponemas patógenos al humano como el T. pallidum, induce la producción de anticuerpos
anti treponémicos, que reconocen tanto a dicha bacteria como a cepas estrechamente relacionadas. Además,
durante el desarrollo de la infección se produce otro tipo de anticuerpos, que van dirigidos contra
componentes normales del hospedero, tales como la cardiolipina, un fosfolípido abundante en membranas
(por ejemplo la membrana mitocondrial). Se ha propuesto que la destrucción tisular durante la infección
treponémica hace que se produzcan este tipo de autoanticuerpos. La serología tradicional denominó
originalmente como "reaginas" a los anticuerpos contra la cardiolipina.

El examen VDRL mide anticuerpos inespecíficos contra material lipoidal liberado de las células huésped
dañadas, así como material de estructura proteica y posiblemente cardiolipina, liberados desde los
treponemas. Los anticuerpos antilipoidales son anticuerpos que se producen no sólo como consecuencia de
la sífilis y de otras enfermedades treponémicas, sino también en respuesta a enfermedades de naturaleza
aguda y crónica en las cuales se produce daño de los tejidos. La técnica VDRL permite el análisis cualitativo
y cuantitativo de las muestras de suero y LCR

FUNDAMENTO DE LA PRUEBA

Se utiliza una solución alcohólica que contiene cardiolipina (0,03%), colesterol (0,9%) y lecitina (0,2%).
Esta es la

"solución madre" de antígeno, que se obtiene comercialmente. Con ella se prepara una suspensión de
trabajo, estable durante un día, en la cual, al pasar los componentes desde la solución alcohólica hacia un
medio acuoso, forman cristales de colesterol recubiertos con el antígeno. Por tanto, el colesterol actúa como
medio de soporte para evidenciar la microaglutinación. La función de la lecitina (fosfatidilcolina) es la de
estabilizar los microcristales.

MUESTRA: Suero, plasma o líquido cefalorraquídeo (LCR)

Obtener suero fresco e inactivarlo a 56°C por 30 min. Esto inactiva el complemento, el cual puede interferir
en la reacción. Si el suero ha permanecido más de 4 hr desde que se inactivó, hay que re-inactivarlo. (Puede
ser o no inactivado dependiendo de la prueba)

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

Reactivo: presencia de floculación.

No reactivo: ausencia completa de floculación.

La formación de grumos de los microcristales indica una aglutinación positiva. La presencia de grumos
pequeños, junto con cristales sin aglutinar, se considera como positivo débil (reactivo débil). Los
microcristales sueltos y dispersos homogéneamente indican un resultado negativo (no-reactivo).

BIOLOGÍA MOLECULAR

Se denominan técnicas de biología molecular a todas los procederes de laboratorio que se usan para aislar
ácidos nucleicos o extraerlos con alta pureza, visualizarlos, cortarlos, pegarlos, amplificar una región en una
enorme cantidad de moléculas, cortar una determinada región con enzimas de restricción para ver si por una
mutación se gana o se pierde un sitio de restricción, entre otras múltiples variantes.

Aplicaciones en la Inmunología (Generalizado)

Para la inmunología, esta ha constituido un poderoso instrumento que ha permitido dilucidar varias
interrogantes sobre el funcionamiento del sistema inmune y, además, ha aumentado enormemente nuestra
habilidad para entender, diagnosticar y tratar una gran variedad de enfermedades inmunológicas, diagnóstico
de enfermedades hereditarias, búsqueda de alelos o marcadores moleculares asociados a características de
interés y el diagnóstico microbiológico.

GRUPO 7. CITOMETRÍA DE FLUJO E INMUNOFLUORESCENCIA

FLUORESCENCIA: Propiedad de una sustancia capaz de emitir luz visible cuando es expuesta a
radiaciones de bajas longitudes de onda y alta energía. La fluorescencia es el fenómeno donde la
absorción de luz de una longitud de onda dada por una molécula es seguida por la emisión a longitudes
de onda más largas (visibles).

INMUNOFLUORESCENCIA:Es una técnica de inmunomarcaje que consiste en conjugar compuestos

fluorescentes (fluorocromo) con el Ac mediante una unión covalente para lograr una detección de Ag
con una alta sensibilidad. Conjugación Fluorescente (Ac + Fluorocromo). La inmunofluorescencia es
una técnica de inmunomarcación que hace uso de anticuerpos unidos químicamente a una sustancia
fluorescente para demostrar la presencia de una determinada molécula.

Es decir, la inmunofluorescencia consiste en conjugar colorantes fluorescentes con anticuerpos, exponiendo

después este conjugado a los anticuerpos o antígenos correspondientes. Cuando la reacción es positiva y se
expone a la luz ultravioleta se producirá fluorescencia observable bajo el microscopio de
inmunofluorescencia. Se realiza un acople a un anticuerpo de un fluoróforo o una enzima que cataliza una
reacción por la cual se emite fluorescencia.

COMPUESTOS FLUORESCENTES MÁS UTILIZADOS EN LA TÉCNICA DE

INMUNOFLUORESCENCIA

FLUORCROMO EXITACIÓN EMISIÓN (nm)

(nm)
FLUORESCEINA 500 520
INDO-l 350 405/480
CFP 433/455 475/501
NARANJA DE 490 530/640
ACRIDINA
CALCEINA 495 520
RODAMINA 500 540
VERDE DE 506 526
CALCIO
AZUL DE EVANS 550 625

REACTIVOS Y MATERIALES NECESARIOS PARA LA REALIZACIÓN DE LAS TÉCNICAS DE

INMUNOFLUORESCENCIA.

· CONJUGADO

· ANTÍGENO

· LÍQUIDO DE MONTAJE

· SOLUCIÓN SALINA BUFER

· PORTAOBJETOS

MICROSCOPIOS UTILIZADOS EN LAS PRUEBAS DE INMUNOFLUORESCENCIA.

El microscopio de fluorescencia es una variación del microscopio de luz ultravioleta en el que los objetos
son iluminados por rayos de una determinada longitud de onda. La imagen observada es el resultado de la
radiación electromagnética emitida por las moléculas que han absorbido la excitación primaria y reemitido
una luz con mayor longitud de onda. Para dejar pasar sólo la emisión secundaria deseada, se deben colocar
filtros apropiados debajo del condensador y encima del objetivo.

En la actualidad se usan dos sistemas de microscopio según el tipo de luz que utilicen.

MICROSCOPIO DE LUZ TRANSMITIDA: pueden ser de campo oscuro o paraboloide

El microscopio de luz transmitida se compone básicamente de dos partes ópticas, el objetivo y el ocular, que
están conectados a través del tubo, la fuente de luz, la platina y el soporte. La fuente de luz del microscopio
de luz transmitida se compone normalmente de una bombilla para microscopios integrada en el soporte, que
se puede ajustar. El condensador del microscopio de luz transmitida es un sistema de lentes y espejos
bastante complejo, que proyecta la imagen en el ocular. El objetivo del microscopio de luz transmitida
ofrece una imagen real aumentada del objeto, que es aumentada nuevamente a través del ocular.

MICROSCOPIO CON ILUMINACIÓN DE LUZ INCIDENTE: el aprovechamiento de luz es el

máximo, eficiencia cuántica, trae consigo combinaciones de filtros y elimina los condensadores.
TÉCNICAS DE INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA E INDIRECTA

DIRECTA: El procedimiento se realiza en un paso básico de reacción. La muestra clínica que

presuntamente contiene antígenos del microorganismo bajo estudio es puesta en contacto con un anticuerpo
monoclonal dirigido contra dicho microorganismo conjugado con fluoresceína. Si el antígeno esperado está
presente se formará un complejo antígeno-anticuerpo. La reacción positiva en forma de fluorescencia verde
manzana puede verse con la ayuda de un microscopio de fluorescencia.

VENTAJAS DESVENTAJAS

Rápido porque solo se utiliza un Falta de sensibilidad para detectar

Ac y se necesita menos etapas bajos niveles de expresión del Ag

Unión específica con el Necesidad de marcar cada Ac de

anticuerpo primario interés: Consume tiempo

Menos costoso en comparación

de la IFI

INDIRECTA: Es una técnica de doble capa en donde se aplica el anticuerpo sin marcar directamente sobre
el sustrato de tejido y se visualiza por tratamiento con un suero anti-inmunoglobulina conjugado con
fluorocromo. El proceso consta de dos etapas:

Primera etapa: Se fijan sobre un portaobjetos los antígenos que constituyen el substrato conocido
específico (células que contienen virus, T. gondii, T. pallidum, etc.) sobre él se coloca el suero de quien se
sospecha la presencia de anticuerpos específicos, si la reacción es positiva se dará formación de complejo
antígeno -anticuerpo no visible ya que el anticuerpo no estaba marcado

Segunda etapa: Se agrega una anti-inmunoglobulina humana marcada, que reaccionará con el anticuerpo
del complejo producido en la primera etapa.

VENTAJAS DESVENTAJAS

Mayor sensibilidad y genera una Se realizan más etapas y es más

señal más intensa costoso que la IFD

Mayor amplificación de la señal Necesita microscopio de

debido a la unión de varios Ac fluorescencia de gran resolución
secundarios a cada Ac primario al igual que la IFD
DIFERENCIAS EN CUANTO A LA ESPECIFICIDAD Y SENSIBILIDAD DIAGNÓSTICA Y
ANALÍTICA ENTRE LAS TÉCNICAS DE INMUNOFLUORESCENCIA.

TIPO SENSIBILIDAD ESPECIFICIDAD

DIRECTA DIAGNÓSTICA: MENOR DIAGNÓSTICA: MENOR

ANALÍTICA: MAYOR ANALÍTICA: MAYOR

INDIRECTA DAGNÓSTICA: MAYOR DIAGNÓSTICA: MAYOR

ANALÍTICA: MENOR ANALLÍTICA: MENOR

PRINCIPIO, UTILIDAD Y VENTAJAS DE LA INMUNOFLUORESCENCIA AMPLIFICADA

Se usa para detectar Ac fijadores del complemento. Después de agregar el Ac primario y posteriormente
realizar el 1er lavado, se añade complemento fresco, que se fija alrededor de donde se han fijado los Acs.
Debido a los pasos de amplificación de la vía clásica del complemento, una molécula de Ac puede fijar
muchas moléculas de C3b al Ag que se revelan con Ac anti-C3b marcado con fluorocromo. TECNICA
MAS SENSIBLE

PRINCIPALES APLICACIONES CLÍNICAS DE LAS PRUEBAS DE INMUNOFLUORESCENCIA.

Determinación Treponema Pallidum agente etiológico de la Sífilis. Determinación por inmunofluorescencia

donde se observa la forma de espiroqueta.

Dengue: Las células fluorescentes representan células infectadas con el virus dengue. Infección evidenciada
con anticuerpos monoclonales para cada serotipo.

Biopsias renales: Anticuerpos contra Membrana basal glomerular de tipo IgG.

Virus Influenza B (IFD detección de antígeno)

Determinación de Anticuerpos anti Toxoplasma gondii, agente etiológico de la toxoplasmosis. El sustrato

antigénico utilizado es una suspensión de Toxoplasma gondii. Detecta antígenos de membrana.

CAUSAS DE ERROR TÉCNICO DE LAS TÉCNICAS DE INMUNOFLUORESCENCIA.

Los pocillos del portaobjeto estén defectuosos (Sucios, turbios)

Que los pocillos contengan poca cantidad de sustrato

Lavado incompleto o ineficiente de los pocillos pueden dar lugar a un fondo elevado

Intercambios de reactivos de distintos lotes

Tiempo de incubación inadecuado, igual que la temperatura.

FUNDAMENTO DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO

La Citometría de Flujo (CMF) es una técnica de análisis celular multiparamétrico cuyo fundamento se basa
en hacer pasar una suspensión de partículas (generalmente células) alineadas y de una en una por delante de
un haz de láser focalizado.

La citometría de flujo es una técnica muy potente que permite analizar múltiples parámetros en una célula y
se basa en la medición de la fluorescencia asociada a las células que han sido previamente marcadas con
anticuerpos monoclonales ligados a fluorocromos. Las poblaciones celulares se pueden caracterizar
mediante el uso de combinaciones de antígenos tanto de superficie como intracelulares.

CARACTERÍSTICAS DE LA TÉCNICA, METODOLOGÍA, EQUIPOS, INTERPRETACIÓN DE

LAS PRUEBAS.

La citometría de flujo es una tecnología que permite analizar y cuantificar de manera simultánea múltiples
características celulares a medida que son transportadas en un fluido e incidadas por un haz de luz. El
citómetro de flujo mide el tamaño y la granularidad de la célula, así como la fluorescencia relativa de la
misma. Estas características se determinan usando un sistema óptico acoplado a un procedimiento
electrónico que graba la manera en que la célula dispersa el haz de luz y emite fluorescencia.

Su principal función es alinear y transportar a las células dentro de una cámara de flujo hacia el haz de luz;
por tanto, es necesario que la muestra se encuentre suspendida en un fluido. Para lograrlo, se aplica una
propiedad hidrodinámica, que consiste en la inyección de la muestra en el centro de una corriente de fluido
envolvente, el cual puede ser agua o un buffer de fosfatos. Lo anterior se logra porque la presión de la
muestra es mayor que la presión del líquido envolvente. Gracias a este sistema, las células pueden ser
alineadas en “fila india”, y de esta manera se asegura que el haz de luz incida sobre una célula a la vez.

Un citómetro de flujo se encuentra compuesto por tres principales sistemas, el de fluidos, el óptico, y el
electrónico.

Sistema óptico.

El sistema óptico está compuesto por láseres y filtros, que se encargan de iluminar a las células y dirigir las
señales resultantes hacia los detectores apropiados. Las células, al ser incididas por el láser, tendrán la
capacidad de dispersar la luz de acuerdo con su tamaño y su granularidad. En caso de que la luz se disperse
frontalmente, se obtendrá un parámetro denominado FSC, que indica el tamaño de la célula. Por tal motivo,
aquellas células marcadas con fluorocromos serán excitadas por el láser y la luz será dirigida hacia un
detector, el cual recibirá la longitud de onda emitida por la excitación del fluorocromo. Gracias a este
sistema, se puede conocer el tamaño y la granularidad de la célula, así como las proteínas que se expresan
(marcadores), permitiendo así la identificación de diferentes tipos celulares. A medida que el citómetro
posea más detectores, mayor será su capacidad para identificar poblaciones celulares.

Sistema electrónico.

Una vez que la señal luminosa es generada cuando el haz de luz incide en la célula, ésta debe traducirse en
señales electrónicas. El sistema electrónico consta de sensores luminosos como fotodiodos y
fotomultiplicadores, que tienen la finalidad de convertir los fotones en electrones y éstos, a su vez, en
corriente eléctrica. De este modo, la señal eléctrica es recibida por la computadora y traducida en gráficos e
histogramas.
Anticuerpos monoclonales acoplados a fluorocromos.

Como se mencionó anteriormente, el marcaje celular con anticuerpos monoclonales acoplados a

fluorocromos, representa un paso crucial para la identificación de subtipos celulares mediante el uso de la
técnica de citometría de flujo. Los anticuerpos monoclonales permiten detectar y “etiquetar” poblaciones
específicas de células. Esta tecnología consiste en la creación de un anticuerpo que sea capaz de unirse a una
estructura específica (antígeno), mismo que se expresa en el tipo celular que se requiere identificar.
Adicionalmente, este anticuerpo debe contener una unión covalente a un fluorocromo, que emitirá luz
fluorescente cuando sea excitado por el láser; de este modo, la célula se “tiñe” y facilitará la identificación
de las células que se unieron al anticuerpo o marcador. Gracias al avance de la ciencia, hoy en día se cuenta
con una gran cantidad de anticuerpos acoplados a fluorocromos que, cuando son excitados, emiten
fluorescencia a diferentes longitudes de onda. Por ejemplo, algunas moléculas emitirán luz verde, naranja,
azul, roja o amarilla, dependiendo del fluorocromo seleccionado. Ello permitirá estudiar diversas
poblaciones celulares a la vez. Es importante mencionar que, dependiendo del modelo de citómetro de flujo
que se utilice, será la cantidad de colores que se puedan leer simultáneamente. En la Unidad de Citometría
de Flujo del Instituto de Ciencias de la Salud de la Universidad Veracruzana, se encuentra un citómetro de
flujo capaz de detectar hasta 16 parámetros diferentes, lo que permite obtener suficiente información para
analizar y caracterizar diversas poblaciones celulares.

ANÁLISIS DE RESULTADOS

Los resultados obtenidos pueden ser representados mediante diferentes estilos, desde una gráfica de puntos
hasta una figura tridimensional; la clave se centra en seleccionar los gráficos que reflejen los resultados con
precisión y sin generar confusiones. A continuación se describen las representaciones más utilizadas en esta
área:

Gráfico de puntos: Este gráfico muestra la relación entre dos marcadores diferentes y muestra a cada punto
como un evento (se define como evento a cualquier partícula que haya sido excitada por el láser). Por tal
motivo, el desplazamiento de los puntos hacia la derecha indica la expresión de un marcador X, mientras
que el desplazamiento de los puntos hacia arriba, muestra la expresión de un marcador Y.

Gráficos de densidad: Estos gráficos, además de representar a las poblaciones con base en la expresión de
dos marcadores, muestran la frecuencia relativa (densidad) de las poblaciones; por ejemplo, las poblaciones
con mayor número de eventos se representan mediante tonos de gris más intenso (gráfico de zebra),
mediante colores cercanos al naranja (gráfico pseudocolor), o mediante líneas (gráfico de contornos).

Histogramas: Los histogramas muestran la intensidad de expresión de un marcador versus el número de

eventos. El desplazamiento de la curva hacia la derecha indica mayor expresión del marcador, mientras que
la altura del pico indica la frecuencia de las células capturadas. En este sentido, es importante recalcar que el
área bajo la curva contiene a las células que se están analizando.

Gráficos 3D: Este tipo de gráficos permite comparar a las poblaciones con respecto a la expresión de tres
marcadores diferentes y la frecuencia relativa. Los histogramas también pueden ser representados en
gráficos de 3D, lo que permite la comparación de la expresión de dos marcadores diferentes versus el
número de eventos.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO.

Es una técnica rápida que analiza un elevado número de células en un corto periodo de tiempo. Se puede
utilizar para medir muchos parámetros, y obtener medidas cualitativas y cuantitativas de cada célula,
siendo una técnica con alta sensibilidad, especificidad y objetividad. Además puede utilizarse de forma
muy sencilla para diferenciar poblaciones celulares y determinar diferencias en tamaño y/o complejidad
en nuestras células favoritas por tratamientos o condiciones determinadas. Y también nos sirve para
medir, en general, cualquier “cosa” que podamos marcar en la célula; desde marcajes muy simples,
como transfecciones con GFP, hasta dobles marcajes con anticuerpos secundarios, etc.
 Sin embargo, para usar la citometría de flujo hay que tener un cierto dominio de la técnica. Cuándo un
biólogo, biotecnólogo, bioquímico o profesional de este sector oye hablar de «compensaciones»,
«emisiones de fluorescencia» o «ajustes de voltaje», probablemente miran a otro lado, pensando que esa
técnica no es para ellos. Y siempre pueden recurrir a un servicio de citometría que les facilite el trabajo.

La citometría de flujo también tiene algunas desventajas: no aporta información sobre la célula en su
contexto tisular, y las células tienen que encontrarse aisladas. Pero es interesante poder comprender y
analizar toda la cantidad de información que puede aportar un citómetro de flujo sobre nuestro cultivo o
nuestra muestra de poblaciones celulares. Y si no lo usamos para incluirlo en nuestros estudios, al
menos, podremos entender los papers que utilizan citometría y que pueden estar ofreciendo datos claves
sobre nuestro tema de investigación.

Simplificar el acercamiento a un citómetro y, sin grandes complejidades, ser capaz de utilizarlo en la

rutina de laboratorio es factible con unas cuantas horas de formación específica.

APLICACIONES DEL PRINCIPIO DE LA FLUORESCENCIA A LA METODOLOGÍA DE LA

CITOMETRÍA DE FLUJO.

Un rayo de luz monocromático, usualmente de luz láser, es dirigido hacia un finísimo chorro de líquido
hidrodinámicamente enfocado. Se colocan una serie de detectores en el punto en el que el chorro de líquido
atraviesa el rayo de luz. Uno se coloca en línea con el rayo de luz (a este detector se lo conoce como FSC,
por Forward Scatter o detector de Dispersión Frontal), y varios angularmente a la trayectoria del rayo (a
estos se los conoce como SSC, por Side Scatter, o detectores de Dispersión Lateral); además de uno o más
detectores de fluorescencia. Cada una de las partículas suspendidas con un tamaño de entre 0,15 a 0,20
micrómetros que atraviesan el rayo de luz lo dispersan, y las sustancias químicas fluorescentes que se
encuentran dentro o adheridas a la partículas son excitadas hasta emitir luz a una longitud de onda mayor
que la de la fuente de luz. Esta combinación de luz dispersada y fluorescencia es recogida por los detectores,
y por medio de un análisis en la fluctuación de la intensidad luminosa recogida por cada detector, es posible
derivar varios tipos de información acerca de la estructura física y química de cada partícula individual.

La citometría de flujo aplicando la fluorescencia Es un método analítico que permite medir la emisión de
fluorescencia y la dispersión del haz de luz que se genera cuando las células o partículas de una suspensión
son arrastradas y presentadas de una en una y a gran velocidad frente a un haz de luz láser.

El análisis de estas señales lumínicas genera información acerca del tamaño y complejidad celular,
permitiendo clasificar de forma detallada todas las células y partículas de una muestra.

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DEFINICIONES:

Afinidad y avidez del anticuerpo

GENERALIDADES DE LA REACCION AG/AC.

La reacción Ag-Ac es una interacción bimolecular en la que interactúa el determinante antigénico “epitopo”
del Ag con el dominio de la región variable de Ac. “fragmentos fab hipervariables- paratopo”

Se da con la finalidad de que haya un entrecruzamiento en la zona de equilibrio de los compuestos

inmunológicos.

Esta reacción conduce una reacción química reversible tanto para el Ag como el Ac pero no en las
alteraciones covalentes entre el epitopo del Ag y el dominio del Ac como: Fuerzas de Vander Walls, iónicas,
puentes de H+ de estas se necesita que un gran número de ellas ocurra para que se de la unión Ag-Ac y
posteriormente el entrecruzamiento de los complejos inmunológicos. También de que permanezcan el
tiempo suficiente.

Reactividad inmunológica Un Ac estimulado por un Ag puede reaccionar relacionándose de manera

cruzada con otro Ag no relacionado. Esto ocurre si dos Ags comparten 1 epitope idéntico o similar por lo
que la afinidad de 1 Ac por dicho epitope de reacción cruzada suele ser menor que el epitope original.
Especificidad.

Los Ac como cualidad más sobresaliente tienen la capacidad de unirse específicamente al Ag. Dicha unión
que puede ser manifiesta por diferentes técnicas consiste en 2 reacciones 1º y 2º, y son consecuencias de la
geometría complementaria existente en ambas porciones moleculares y resultado de la especificidad.

Reaccion1º Formación del complejo Ag-Ac: _Ocurre con gran rapidez y solo está limitada por la difusión.
No es observable pero puede demostrarse con métodos llamados “primarios” como: inmunofluorecencia,
radioinmunoensayo…

Reacción 2º Formación espontanea de complejos: Consecuencias directas de la reacción primaria (Red

tridimensional de complejos que se agregan espontáneamente). Es una reacción más larga que incluye las
manifestaciones que se presentan como consecuencia de las 1º interacciones. Aglutinación, neutralización…

La reacción Ag/Ac es espontanea no requiere E adicional.

El hecho de que la reacción Ag/Ac sea no covalente señala que, es fundamentalmente electrostática por lo
que también es reversible y se ve afectada por factores como Tº, pH, I. iónica, proporción Ag-Ac, etc.

FUNDAMENTOS FISICOS- QUIMICOS DE LA REACCION AG-AC.

Como ya sabemos las reacciones Ag-Ac involucran reacciones con uniones covalentes de tipo no
covalentes. Debido a que la fuerza de estas es débil (en comparación con enlaces covalentes) se requieren
gran número de estas para fortalecer la unión pero los factores que mantienen esta relación son afinidad del
Ac y avidez.

FACTORES FISICO- QUIMICOS QUE INFLUYEN EN LAS INTERACCIONES AG/AC.

● Concentración de los reactantes: La concentración es la zona de equilibrio para que se dé el

entrecruzamiento.

Las concentraciones Ag/Ac deben ser proporcionales si no lo son se pueden crear efectos pre o pro zona en
la reacción, que son carencia o exceso de Ag/Ac y no habrá entrecruzamiento de los complejos
inmunológicos.

● Fuerza iónica (y electrostáticas): es necesario proporcionar las cargas necesarias para que se dé la
interacción Ag/Ac se utiliza (NaCl), solución salina para neutralizar las cargas de la porción terminal
amino-carboxilo del Ac.
● Periodo de incubación: el tiempo necesario para alcanzar el equilibrio del entrecruzamiento óptimo.
Varía según el Ac – Medio de V de reacción.
● pH: no existe un pH óptimo pero entre 6- 7,3 se detectan la mayoría de los grupos sanguíneos
significativos.
 El pH estabiliza las fuerzas electrostáticas y brinda estabilidad a los enlaces no covalentes

Se mantiene un pH básico para cargas negativas (-), ion hidroxilo OH- y un pH acido para cargas positivas
(+), iones hidrogeno H+.

Con el pH pueden producirse cambios de la especificidad de los Ac, en especial los monoclonales, que
pueden ser controlados para permitir la reacción. Valores por debajo de 6 y por encima a 8 alteran las
reacciones disminuyendo la cantidad de Ac. Fijado.

● Temperatura: dependiendo de Ac va a variar la Tº optima, ya que suelen desnaturalizarse (66-70 ºC) por su
carácter proteico, por lo que se necesita una Tº 56ºC para inactivar el complemento y aumentar el choque
entre las moléculas posibilitando el encuentro de los sitios complementarios Ag/AC (agitación térmica).

La agitación mecánica también aumenta el número de choques entre moléculas pero se es excesiva o
prolongada las uniones no covalentes pueden romperse y no darse la unión Ag/Ac. La centrifugación,
por ejemplo, es útil en el caso en que el Ac tenga poca afinidad por Ag. La Tº ideal para promover la
reacción Ag/Ac en general varia de 0- 37ºC (aumenta la velocidad de reacción. Ej. IgMà 4ºC-27ºC ; IgG
à 37ºC

● Antígeno: Sustancia o molécula extraña capaz de interaccionar y desencadenar los productos efectores de
la Respuesta Inmunitaria, la producción de anticuerpos.

● Anticuerpo: las inmunoglobulinas son glicoproteínas producidas por células plasmáticas en respuesta a un
estímulo provocado por un antígeno.

● Suero sanguíneo / suero hemático: es el componente de la sangre resultante de la coagulación y

eliminación del coágulo, no contiene las proteínas involucradas en la coagulación (fibrinógeno).

Se puede definir suero también como la parte líquida de la sangre resultante de la coagulación, no presenta
factores de coagulación.

● Suero inmunológico: este término se refiere a los preparados biológicos que contienen anticuerpos, es
decir, es la porción líquida y acelular de la sangre que contiene inmunoglobulinas que activan al sistema de
defensa.

Los sueros son un tipo de inmunoestimulación pasiva, es decir, son un apoyo a nuestro sistema inmune cuya
base es la presencia y acción de los anticuerpos, su acción es rápida/específica frente a los antígenos

Suero = Plasma – factores de coagulación

➔ Función principal del suero: provocar una respuesta inmune rápida frente a los agentes patógenos, en
casos de urgencia médica donde se requiere generar o reforzar una respuesta contra una infección
grave la transfusión de suero es vital, se debe tener en cuenta que su acción no prevalece en el tiempo
(no genera respuesta inmunológica de memoria)

El método de acción del suero va a depender del propósito con el cual se utilice, sí es preventivo tendrá una
acción profiláctica, es decir, va a actuar en modo de defensa ante ese agente extraño impidieron su ingreso o
proliferación en el sistema, sí se utiliza con fines curativos tendrá una acción terapéutica su fin será el
tratamiento de la infección, pero su acción no es duradera, en consecuencia, debe ser administrada cuantas
veces sea necesario hasta erradicar la infección

● Antisuero: es un producto biológico utilizado como antídoto en el tratamiento de picaduras o mordeduras

venenosas de animales, el antisuero puede clasificarse como monovalente = cuando es capaz de actuar
 frente a un determinado veneno y suero polivalente = es capaz de actuar frente a una diversidad de
venenos.
➔ Antisuero monoclonal (mAB): un anticuerpo monoclonal es un anticuerpo homogéneo producido
por una célula híbrida producto de la fusión de un clon de linfocitos B descendente de una sola clona,
una única célula madre y una única célula plasmática tumoral.

Son anticuerpos idénticos porque son producto de un tipo de célula del sistema inmune, es decir, todos los
clones provienen de una célula madre

➔ Antisuero policlonal: son anticuerpos derivados de varios tipos de células B, los linfocitos
encargados de la respuesta ante elementos extraños (antígenos) mediante anticuerpos

Los anticuerpos policlonales, son una mezcla de inmunoglobulinas secretados en contra antígeno específico,
cada uno reconociendo diferentes epítopos

Los anticuerpos policlonales en el antisuero, son obtenidos mediante la inyección reiterada en un animal
experimental, donde se quiere obtener la respuesta inmune; luego de ese animal se toma una muestra de
sangre y de esa muestra se obtiene el suero que al ser purificado se obtienen esos anticuerpos policlonales de
interés

Antisuero monoespecífico: suero eficaz para un determinado epitope de Ag con el que reacciona. (Origen
in vitro)

● Suero patrón y suero control: un patrón es una solución absolutamente correcta en cuanto a
concentración e identidad, sirve referencia para calcular la concentración de una sustancia en una muestra
problema; se prepara a partir de una muestra química conocida, pesada y analizada con un alto grado de
exactitud contenida en un disolvente adecuado.

Un suero control es aquel que simula la composición química y características físicas de la muestra que se
está analizando, su valor se calcula por comparación con el valor dado por un patrón, este suero no reúne los
requisitos de exactitud de una patrón de referencia debido a que contiene otras sustancias de diferentes
concentraciones y por ello arroja resultados diferentes

● Plasma sanguíneo: es la porción líquida y acelular de la sangre, se obtiene al dejar la sangre desprovista
de células como los glóbulos rojos y de los glóbulos blancos. Está compuesta por: 90% de agua, 7% de
proteínas plasmáticas (50-75 mg/dl) y 3% restante de glucosa, vitaminas, hormonas, oxígeno, dióxido de
carbono y nitrógeno y productos de desecho del metabolismo como ácido úrico.

El plasma es el componente mayoritario de la sangre, representando aproximadamente el 55% del volumen

sanguíneo total, el 45% restante corresponde a los cuerpos formes (tal magnitud está en relación con el
hematocrito).

El plasma es un fluido coloidal, amarillento, cuya composición contiene 91% de agua, numerosas sustancias
orgánicas e inorgánicas

➔ Función principal del plasma: transportar los nutrientes que se absorben durante la digestión a todo
el cuerpo; también transporta productos de desecho (ácido úrico, creatinina, amonio, etc…) de las
células a los riñones para que se excreten mediante la micción, a su vez también transporta
electrolitos importantes para las funciones celulares (contracción muscular, sinapsis neuronal, etc).

El plasma al contener y transportar diversas proteínas ayuda al organismo contra infecciones y pérdida de
sangre

Es importante resaltar que la albúmina es la proteína con mayor concentración en el plasma, es muy
importante para la reparación de tejidos y crecimiento, además mantiene la presión osmótica de la sangre.
 La albúmina también está presente en el líquido intersticial, si no existiera la albúmina, el agua no circularía
en la sangre lo que a su vez aumentaría el volumen sanguíneo y causaría un aumento de la presión arterial,
se forzaría el trabajo el corazón y habría formación de edemas

● Las Inmunoglobulinas/anticuerpos son proteínas transportadas en el plasma a todo el organismo, que

reconocen y atacan sustancias extrañas en el organismo

El fibrinógeno, es otra de las proteínas presentes en el plasma, estas proteínas junto a las plaquetas ayudan a
la coagulación sanguínea

● Control de calidad: el control de calidad es el conjunto de mecanismos y acciones que requieren ciertas
herramientas para detectar errores en el sistema; la función principal es asegurar que los productos y
servicios cumplan con los requisitos mínimos de calidad

● Valencia del antígeno y del anticuerpo: es el número de determinantes antigénicos o epítopes de una
molécula antigénica, cuando es mayor a dos se denomina polivalente, la inoculación de un Ag polivalente
originará un receptor de anticuerpos con distinta especificidad, cada uno de los cuales provendrá de un clon
celular distinto (respuesta policlonal)

● Dilución: la dilución consiste en disminuir la concentración de la solución que contiene soluto y solvente, se
logra adicionando más solvente/diluyente a la solución concentrada inicial. Se toma una pequeña porción de
la solución concentrada en una alícuota, luego se pasa esa cantidad a una porción de diluyente, este paso se
repite hasta lograr la concentración requerida.

● Suspensión: una suspensión o un sólido en suspensión es una mezcla heterogénea formada por un sólido en
polvo o por pequeñas partículas no solubles (fase dispersa) que se distribuyen en un medio líquido (fase
dispersante/dispersora)

Cuando uno de los componentes es líquido y los otros son sólidos suspendidos en una mezcla, se les conoce
como suspensiones mecánicas; las partículas que forman parte de una suspensión pueden ser microscópicas
y de diferentes tamaños, dependerá del tipo de sustancia. Este tipo de suspensiones pueden proveer de
diferentes energías, para la elaboración de mezclas homogéneas y coloides distintos entre sí.

● Título de una muestra: se define como el inverso de la máxima dilución que da como reacción
francamente positiva en una prueba determinada

Ejemplo: el título de un suero puede ser 1 en 16 o 1/16

● Afinidad del anticuerpo: es la sumatoria de las fuerzas de atracción y repulsión de las interacciones no
covalente en un solo sitio de unión en el Ac con uno solo de epítopo del Ag. Los Ac de baja afinidad se unen
débilmente a los Ags por lo cual tienden a disociarse fácilmente.

Los Ac de alta afinidad se unen fuertemente a los Ags correspondientes, y por más tiempo. Aunque las
reacciones Ag/Ac son altamente específicas en algunos casos un Ac inducido por un Ag específico puede
reaccionar con otro Ag no relacionado, debido a que comparten epítopes idénticos o muy similares con el
Ag inductor. En este caso, la afinidad del Ac por el epítopo de reacción cruzada es menor que la demostrada
por el epítopo inductor original.

● Avidez del anticuerpo: es la sumatoria de las fuerzas de atracción y repulsión entre un Ac multivalente y
Ag de múltiples epítopes. La avidez de un AC refleja la verdadera fuerza de reacción Ag-Ac. La alta avidez
compensa la baja afinidad. Ej. La IgM pentamérica tiene más baja afinidad que la IgG, pero tienen alta
avidez debido a su multivalencia, lo que hace más fuerte y eficaz su unión al Ag.
 La alta avidez está determinada por 3 factores:

1. Afinidad intrisica del Ac. por el epitope.

2. Valencia del Ac y Ag.
3. Reordenamiento geométrico de los reactantes.

● Factor de Dilución: es el número de veces que debe diluirse una solución para obtener una de menor
concentración. Este factor permite determinar qué tan diluido se encuentra el último volumen con respecto al
primero.

● Diluciones seriadas: es una secuencia de diluciones simples en la que se reduce la concentración

progresivamente. Para crear una dilución seriada se parte de una solución concentrada y se preparan
diluciones al decimos (1/10) o al medio (1/2), obteniendo concentraciones relacionadas entre sí pero con
rangos más específicos

● Exactitud analítica: es la proximidad entre el resultado obtenido y el valor real. La exactitud debe
establecerse en todo el intervalo especificado para el método analítico
● Precisión analítica: es el grado de concordancia entre los resultados del ensayo individual cuando el
método se aplica repetidamente a varias alícuotas de una muestra homogénea
● Sensibilidad analítica: Es el cambio en la respuesta de un instrumento o método analítico al cambiar la
concentración de una cierta sustancia en una muestra.
● Especificidad analítica: es la fracción del total de negativos correctamente asignados en los recuentos
presuntivos
● Sensibilidad diagnóstica: se define como la probabilidad de que el resultado de la prueba sea positivo
(h+) en una persona afectada por la enfermedad (e+). Representa, pues, la fracción de verdaderos
positivos. Sería, pues, la probabilidad condicionada P(h+/e+) = a / (a + c)

● Especificidad diagnóstica: se define como la probabilidad de que el resultado de la prueba sea negativo
(h-) en una persona sana, que no padece la enfermedad (e-). Por tanto, representa la fracción de
verdaderos negativos. Sería, pues, la probabilidad condicionada P(h-/e-) =d /(b+d).

¿Cuál es la diferencia entre reacciones de aglutinación y precipitación?

Las reacciones de precipitación son medibles en cantidad y son fáciles de ejecutar.

Las técnicas de aglutinación son semicuantitativas y son más complejas de ejecutar

¿Cuál es la ventaja de las reacciones de aglutinación?

Su alto grado de sensibilidad, enorme variedad de sustancias identificables a través del uso de partículas que
están recubiertas por antígeno o por anticuerpo; la aglutinación de los antígenos nativos insolubles o de
partículas recubiertas por el antígeno puede evaluarse a simple vista con ayuda o sin ayuda del uso del
microscopio

Coombs propone 3 principales requerimientos para las pruebas de aglutinación:

1. Disponibilidad de una suspensión estable de células o partículas

2. La presencia de uno o más antígenos cercanos a la superficie

3. Conocimiento de que los anticuerpos incompletos/ no aglutinables no son localizables sin modificación.
Ejemplo: reacciones antiglobulina