ACCION DE AGENTES

FISICOS Y QUIMICOS
SOBRE
BACTERIOFAGOS
INTRODUCCION
En los últimos años se han prestado una atención considerable a un grupo de
organismos conocidos como virus bacterianos o bacteriófagos. Son parásitos de
células bacterianas.
Esta practica se divide en 2 secciones
 Efectos de los agentes físicos
 Inactivación termica
 Ultra vibración sónica
 Liofilización
 Almacenamiento a largo plazo
 Efecto de la temperatura en tasa de adsorción
 Fotorreactivacion después de la exposición a la luz ultravioleta
 Efectos de los agentes químicos
 Suspensión en varias soluciones salinas
 Efecto a varios valores de pH sobre la estabilidad de los fagos
MATERIALES Y METODOS
GENERALES
Medios: Fago:
 se uso triptosa fosfato para el crecimiento del  Bacteria huésped SK9
organismo huésped y también como diluyente  Fago PI
 Placas de agar de capa base al 1%
 Se prepararon tubos de agar de la capa superior Titulación de fagos
al 0.7% añadiendo agar triptosa fosfato.  Las muestras de fagos se titularon utilizando el
 Todos los medios se esterilizaron mediante método descrito por Adams
autoclave durante 15 minutos a 15 libras  Las placas se invirtieron y luego se incubaron
 El pH final fue de 7.4 durante la noche a 37 °C y se contaron con un
contador de colonia de Quebec.
TASA DE
ADSORCION A
DIFERENTES
TEMPERATURA
S  El fago se diluyo en solución salina y tanto los fagos
El primer paso en la multiplicación del
virus es la adsorción o unión a la
superficie de la célula huésped antes de
la penetración de la membrana celular.
Material y métodos
 La bacteria huésped SK9 se cultivo en medio triptosa
fosfato, se centrifugo y se resuspendio en una
cantidad igual a la cantidad salina fisiológica.
como en organismos hospedadores, se llevaron a
temperatura deseada antes de mezclarse.
 En tiempo 0, 1mL de fago PI se añadió a 9 mL de
bacteria huésped SK9 y se agito en un tubo.
 Medio mL de las muestras se retiraron a intervalos y
luego se diluyeron 1/2000 en solución salina para
detener la adsorción.
 Se tomo un titulo de fagos para determinar el titulo
original y las muestras se centrifugaron durante 10
minutos y el sobrenadante se titulo.
 Las constantes de velocidad se calcularon a partir de
esta formula:
TASA DE
ADSORCION A Resultados
DIFERENTES Las constantes de velocidad para la conexión del fago
TEMPERATURA PI a la bacteria hospedadora SK9 en solución salina de

S 489 x 10 -12 Cm3/min a 1° a 729 x 10 -11 a 45° (figura 1).

A una temperatura dada, se alcanza la velocidad máxima de

adsorción de virus y los aumentos adicionales de
temperatura no dan como resultado una constante de
velocidad mayor.

La velocidad de adsorción máxima para este sistema se

encuentra entre 28° y 37° ya que no se produce ningún
aumento por encima de la temperatura mas alta.

Además de la temperatura, la adsorción del efecto esta

influenciada por la presencia de ciertos cofactores y sales
además del estado fisiológico de la célula huésped.
ALMACENAMIE
NTO A LARGO
PLAZO
La Información sobre la capacidad de
los microorganismos para permanecer
viables cuando son almacenados en
diversas condiciones es de primordial
importancia. Sin embargo el
bacteriófago suspendido en liquido
permanece viable durante algún tiempo.
Material y métodos
 Se diluyo una reserva de fagos recién preparados,
aproximadamente 4 x 10 5 / mL en caldo (pH 7.4),
solución salina (pH 6.8).
 Una muestra de cada uno se almaceno a 4°,
temperatura ambiente (23°) y 37° en tubos de ensayo
con tapón.
 Los títulos se realizaron a intervalos.
ALMACENAMIE
NTO A LARGO
PLAZO
La Información sobre la capacidad de
los microorganismos para permanecer
viables cuando son almacenados en
diversas condiciones es de primordial
importancia. Sin embargo el
bacteriófago suspendido en liquido
permanece viable durante algún tiempo.
Resultados
 El fago PI se inactivó completamente en tres días cuando se suspendido en agua
destilada a temperatura ambiente o 37°.
 La inactivación rápida también ocurre a 4° en agua. Ya que solo el 10% estaba
activo después de una semana
 En 4 semanas mas del 99.9% estuvo inactivo
 Se encontró que el fago PI era inestable a 37° o a temperatura ambiente en
solución salina y se inactiva al 60% después de una semana a 4°.
 La menor inactivación ocurre cuando el fago PI se mantiene en triptosa fosfato.
En este medio el 90% del fago es perdido en una semana a 37° y solo el 1%
permanece activo después de 2 meses a temperatura ambiente.
 Cuando el fago PI se suspende en triptosa fosfato y se almacena a 4°, pierde
muy poco en 3 semanas. Y en 2 meses, el titulo desciende al 20% del valor
original.
 Entonces este fago se puede almacenar en caldo por periodos cortos, pero es de
esperar también una caída considerable, por eso es preferible la liofilización de
las preparaciones madre para retener partículas de fagos viables.
LIOFILIZACION
Es una técnica de conservación basada
en la desecación de determinados
materiales por medio de la sublimación
del agua contenida en estos.
Hay muchos virus de mamíferos que
resisten a la liofilización y se
encontraron viables después de años de
almacenamiento.
Materiales y métodos
 Los lisados recién preparados se filtraron y se colaron a través de
un matraz de fondo redondo y se congelo rápidamente. Esta
congelación requirió menos de un minuto.
 El matraz se fijo a un aparato de liofilización, se evacuo y se dejo
secar durante 21 horas.
 Al finalizar el proceso de secado, en forma de copos marrones, se
raspo de los lados del matraz, se pesó y se coloco en un tubo con
tapón hermético.
 Otros lisados de fagos se marcaron primero a 4° en solución salina
o agua luego de ser liofilizada.
LIOFILIZACION
Es una técnica de conservación basada
en la desecación de determinados
materiales por medio de la sublimación
del agua contenida en estos.
Hay muchos virus de mamíferos que
resisten a la liofilización y se
encontraron viables después de años de
almacenamiento.
Resultados
 Aproximadamente 85% del fago se pierde en el proceso de
liofilización.
 Se produjo una perdida adicional del 6% durante el
almacenamiento después de 30 días, pero no se observo ninguna
disminución adicional durante 6 meses adicionales a 4°.
 A pesar de una caída tan grande en la actividad de los fagos, no se
experimento ninguna dificultad para preparar el fago PI recién
hechos a partir del material liofilizado.
 Los lisados que habían sido dializados en agua o solución salina
antes de la liofilización, no perdió titulo.
VIBRACION
ULTRA SONICA METODOS

 El fago se diluyo en triptosa fosfato y 50 mL metido en el

Se ha demostrado que los bacteriófagos oscilador sónico refrigerado por agua.
y otros virus son muy vulnerables a los  Un décimo de las muestras se retiraron a intervalos, se
efectos de la vibración de alta diluyeron y se colocaron en placas.
frecuencia.  Una muestra de colifago T6 también fue preparado y
tratado de la misma manera para comparar los efectos
sónicos en ambos fagos.
 Las constantes de velocidad se determinaron mediante la
formula:
VIBRACION
ULTRA SONICA

RESULTADOS

 Se encontró que el fago PI no estaba igualado en

aproximadamente la misma tasa que los colifagos T2, T4, T5 y T6 y
los fagos M2 y M3.
 En un minuto se destruyo la mitad del fago y solo el 2%
permaneció activo después de minutos de exposición.
 Se encontró que T2, T4, T5 y T6 se inactivan mas rápidamente que
los fagos pequeños T1, T3 y T7.

Dulbecco (1949): Publicó por
primera vez, una descripción
sobre fotorreactivación.
Hill y Rossi Dulbecco: Trabajó con
una preparación seca de fago, mostró
que no hay lugar de fotorreactivación
con el material seco.
MATERIALES Y
MÉTODOS
RESULTADOS
FOTORREACTIVACIÓN
Encontró: Los T colifagos, si Si se incuban bajo una luz
eran expuestas a luz ultravioleta visible fuerte, resultaba un
y a la aplicación de placas en las mayor de títulos. A comparación
células huésped susceptibles de los tratados en la oscuridad
Concluyeron: Que fotorreactivación
Fotorreactivación en estafilococos:
dependía del estado del fago en el
Se demostró que el fago aparece en
momento de la exposición a la luz
los siguientes experimentos
ultravioleta.
• Se irradió, utilizando un germicida de 15 vatios. Lámpara con un filtro que da máxima emisión a 2570 A.
• Muestras de fagos diluidos en TPB, expuestos por períodos de tres a tres minutos y medio, para causar
aproximadamente un 80% de inactivación. El fago irradiado en 12 platos. Cuatro-oscuridad, cuatro-debajo de
una lámpara y cuatro debajo de dos lámparas. Todas las placas se incubaron a 26 ° durante18 horas y luego
contadas.
• Los títulos de reactivación ascendieronal doble del título del fago irradiado no tratado con luz visible.
• Títulos del fago irradiado no reactivado promedió el 15% del fago original no tratado .
• La exposición a dos lámparas fluorescentes durante 18 horas dio como resultado títulos iguales a29% del
fago original sin tratar.
 CONCENTRACIÓN DE
IONES DE HIDRÓGENO

Friedman y Cowles: Encontraron que El colifago purificado es más estable a pH

dos de los cinco fagos de B. megatberium 6 pero la pérdida de título se produce a
eran estable durante una hora a 37 °C en valores de pH de 4,3 a 7 después de 24
caldo de diferentes pH. horas en caldo.

• Se disolvieron triptosa de Baero y NaCl en agua, se llevaron al pH deseado y se esterilizaron en el

autoclave.
MATERIALES Y • Se disolvieron la glucosa y Na-HP04 por separado en agua y se esterilizaron, se enfriaron y se añadieron
a la solución de triptosa-NaCl. Se emplearon ácido clorhídrico (0,1 M) y NaOH (0,1 M) cuando fue
MÉTODOS necesario para ajustar al pH exacto. El fago se diluyó en el caldo de pH apropiado, luego se mantuvo en
un baño de agua a 37 ° o se almacenó a 4 ° durante 24 horas. Las muestras se retiraron a la hora y a las
24 horas para la titulación.

• En general, los dos virus y bacteriófagos de mamíferos son más estables cuando está mantenido en
suspensiones a valores de pH cercanos a la neutralidad. La zona de estabilidad del pH; sin embargo,
RESULTADOS varía en un rango de pH de 4-10 con muy pocos virus que sobreviven excepto por períodos cortos a pH
superiores a 10 o inferiores a 4.
 IONES CITRATO

Se han examinado varios sistemas de Se sugirió que la clasificación de estos

fagos con respecto al efecto de los iones organismos podría basarse parcialmente
citrato sobre la adsorción y la en su comportamiento en presencia de
multiplicación. citrato.

• Se prepararon tubos de agar de capa superior y placas de agar de capa

inferior que contenían citrato de sodio de 10 "a 10" M.
MATERIALES Y
MÉTODOS
• Se diluyó PI en TPB a 5 x 1oj / ml. Luego se tituló usando el agar citrato.
Los controles fueron titulado en agar TP estándar.

• La multiplicación de Pion la célula huésped fue no inhibido por ninguna

RESULTADOS
concentración de citrato de sodio probado.
 SALES DIVALENTES

Burnet y McKie: encontraron que la La adición de pequeñas cantidades de

dilución en sales de sodio, potasio o sales divalentes como calcio, magnesio o
amonio, resultó en una pérdida rápida bario previno parcial o completamente
cuando el fago se calentó a 60 °. esta inactivación.

• Todas las sales divalentes se prepararon en NaCl 0,15 M y se llevaron a pH

MATERIALES Y 7. El fago se diluyó y se añadió a las concentraciones de sal y después se
MÉTODOS incubó a 37º en un baño de agua. Los títulos se realizaron a la hora ya las 24
horas.
• Se inactivó completamente en una hora a 37 ° en presencia de iones de 10,2
o 10,3 M Cu ++, Pb ++ o Fe ++ y perdió 80% en 10,2 M Cd ++. Ninguna de
RESULTADOS las otras sales utilizadas en estas concentraciones evitó la inactivación más
que el control de 0.15 M NaCI. La estabilidad no aumenta cuando se diluye
en soluciones salinas divalentes.
 CLORURO DE SODIO

Cuatro de estos fagos se inactivaron

Solo se ha examinado un grupo de fagos para completamente en concentraciones de NaCl de
determinar el efecto de diferentes concentraciones 10(-1) a 5 X 10(-2) M después de una hora a 37 °.
de NaCl sobre la estabilidad de los fagos. Todos fueron estables durante el mismo período
de tiempo en 1 M soluciones.

• Se prepararon soluciones salinas usando NaCl de grado reactivo disuelto en

agua desionizada. El fago se diluyó en agua desionizada a la concentración
MATERIALES Y
deseada y luego a 0,1 ml. se añadió a los tubos que contenían 9,9 ml. de
MÉTODOS
cada solución salina a 37 °. Se continuó la incubación a 37ºC y se realizaron
títulos a la hora y a las 24 horas.

• En una hora a 37 ° del 5% al ​26%, se había inactivado en las soluciones que

contenían de 4 M a 10(-4) M de NaCl. La menor inactivación ocurrió a
RESULTADOS concentraciones de NaCl de 2 M a 4 M. Aproximadamente el 75% del fago
se perdió en 24 horas a concentraciones de sal de 4 M a 10(-2) M y más del
90% a (10-3) M a 10(-5) M.
GRACI