Integrantes: Angelo Cocio

Ignacio Rojas
Asignatura: Bioquímica Aplicada
Fecha: 27/08/07
Objetivos:

 Aprender a trabajar con soluciones calibradoras.

 Validar una curva de calibración.

 Aprender a utilizar la regresión lineal para el

análisis de las curvas de calibración.
 ¿ Qué es una curva de calibración?
•Se trata de una curva de referencia construida a partir de la respuesta de
cantidades conocidas de un analito ante una reacción.

•Se utiliza para determinar la cantidad del analito (ej. proteínas) presente en
una muestra incógnita.

•Se relaciona la concentración del

analito con la intensidad de color
que genera una reacción.

•La relación mientras sea lineal

cumple con la ley de Lambert-
Beer.

•La intensidad del color se puede

determinar por el método
fotocolorimétrico.
 Fotocolorimetría:
- Incide un haz de luz monocromático perpendicularmente a un tubo de solución
coloreada.

- Parte de energía incidente (I0) es absorbida por la solución y otra transmitida (I1)

- I1 depende de c= concentración solución(moles / L)

l= distancia atravesada por la luz
-Según la ley de Lambert-Beer:
ε= coeficiente de extinción molar
I0 = I1 x 10-εx ℓ x c

I0 = 10-εx ℓ x c
I1
Log I0 = ε x ℓ x c
I1
ε x ℓ x c= A A= absorbancia

ε y ℓ = cte.= factor de
calibración

A=k x c  Ec. de una recta que pasa por origen.

Así se puede determinar
c=A la concentración de la
k solución problema.
MATERIALES

Materiales de Laboratorio: Equipos:

A) Matraces aforados A) Espectrofotómetro

B) Vasos precipitados B) Micropipetas

automáticas
C) Puntas para p100, p200

D) Tubos Khan de vidrio C) Balanza analítica

Materiales de laboratorio:

Matraz aforado:

Recipiente con un fondo plano y un cuello

largo y delgado. una marca alrededor del
cuello que indica un determinado volumen de
líquido.

Vasos precipitados:

Contenedor de líquidos, cilíndricos, con fondo

plano; tiene capacidades que van desde 1 mL.
hasta varios litros. Son de vidrio o de plástico.

Aquéllos cuyo objetivo es contener ácidos o

químicos corrosivos, tienen componentes
resistentes a la corrosión.

Suelen estar graduados, pero esta graduación es

inexacta
Puntas o tips para p100 y p200:

Sirven para tomar volúmenes con las

micropipetas. Se debe procurar no
presionar la punta muy fuerte a la
micropipeta.

Tubos Khan de vidrio

Son tubos sellados que se usan para el

transporte de muestras (ej. sangre).

Tienen una presión interna menor a la

externa de manera que al insertar la aguja,
el fluido en su interior sale por diferencia de
presiones.
Espectrofotómetro
Es un instrumento que se usa para medir
la absorbancia de una muestra en función
de la longitud de onda de la radiación
electromagnética.

El espectrofotómetro consta de los

siguientes componentes clave: fuente,
dispositivo de dispersión, área de muestra
y uno o más detectores.

Fuente genera radiación electromagnética: Puede que genere luz de longitudes de

onda entre 400-700 nm, o bien para la zona ultravioleta (200-400 nm).

El dispositivo de dispersión: selecciona una determinada longitud de onda.

El área de muestra es donde se contiene el material bajo estudio.

El detector sirve para medir la intensidad de la radiación.

Micropipetas automáticas

Nos sirven para medir con exactitud y

reproducibilidad volúmenes cuyo
orden es el de los microlitros (106L ).

Los errores de medición que se

pueden cometer dependen en gran
medida del usuario y no de la
micropipeta.
Balanza Analítica
Instrumento que sirve para pesar
elementos cuya capacidad va desde 1 gr.
hasta algunos Kg.

Se usa en casos en que se necesita una

alta precisión como en el caso de la
confección de las curvas de calibración.
Construcción de la curva de calibración:
•Preparar varias concentraciones lo más exactas posibles (soluciones
calibradoras) de lo que se desea analizar, a partir de una solución patrón o
estándar. (ej. ONF 5x 10-4 M)
•Para la preparación de los calibradores (sustancias químicas de certificada
pureza) se debe utilizar un diluyente puro el cual debe ser medido con
exactitud.

• A cada tubo se le agrega la solución patrón ( ej. : estándar de glicógeno 0.025%

p/v) en diferentes concentraciones dependiendo del rango del método, excepto
el blanco.

•Todos los tubos deberán tener el mismo volumen final, por lo que hay que
diluir con agua destilada, y agitar.

•Luego se agrega el reactivo: ej. reactivo de Biuret.

•Método de Biuret va a ser especifico para las proteínas,

ya que contiene Cu en se composición por lo que se unirá
al enlace pepitico, que se manifiesta en el color violeta
de la solución.
Validación de la Curva de Calibración

Para validar los resultados obtenidos de un experimento se deben

tener en cuenta los siguientes factores:

- Los cálculos que se realizan para las mediciones deben incluir la

menor cantidad de pipetas y micropipetas.
- Preparar por lo menos 3 concentraciones de la sustancia de interés.
- La construcción de la curva debe incluir los intervalos de confianza.
- Validación por métodos estadísticos
Límite de detección: Cantidad medida más pequeña de analito que
puede ser detectado en una medición única con cierto nivel de
confianza.

Límite de cuantificación: Cantidad medida más pequeña de analito

que puede ser determinada cuantitativamente con exactitud
aceptable.

Especificidad: Habilidad del procedimiento analítico de evaluar

solamente un determinado analito, aunque se encuentre en
presencia de más sustancias en el sistema.
Regresión lineal: Método para obtener la relación más precisa entre
la variable independiente y los múltiples valores que puede tomar la
variable dependiente.

Permite encontrar la ecuación de la recta que mejor asocia los

valores de las mediciones experimentales presentes en la curva de
calibración.

Y = señal medida
X = variable independiente
a = coeficiente lineal
b = coeficiente angular
Desviación estándar: Método utilizado para medir la dispersión de
los valores de las mediciones respecto a su promedio.
Error estándar: Corresponde a la desviación estándar de los
promedios muestrales en el conjunto de valores de los resultados
obtenidos
Intervalo de confianza: Es el rango dentro del cual puede estimarse
que los resultados de las mediciones obtenidas se encuentran
posicionados. Por lo tanto su estimación se presenta entre un límite
inferior y uno superior.
Exactitud: Grado de cercanía entre un valor aceptado (el verdadero)
y el valor obtenido.

Grado de inexactitud Grado de exactitud

Precisión: Nivel de coincidencia entre los resultados obtenidos de

una misma muestra y bajo mismas condiciones. Se expresa por el
coeficiente de variación que corresponde a la variación estándar
relativa.

Grado de imprecisión Grado de precisión

Esta asociado a la repetibilidad de una operación.

Repetibilidad: Precisión obtenida en los resultados de un
procedimiento sometido a las mismas condiciones. Éstas involucran
el tiempo, el operador, método, el ambiente, la misma muestra, el
equipo, los materiales.

Reproducibilidad: Precisión obtenida en los resultados de un

procedimiento sometido a diferentes condiciones. Aplicado a
estudios interlaboratoriales para estandarizar una metodología.
Ejemplo: DETERMINACION DE LA GLICEMIA

Solución patrón de glucosa 0.2 mg/ml  rango :0.01- 0.2mg

•Se preparan 4 tubos con diferentes concentraciones de glucosa a partir de la

solución patrón.
•Entonces si: 0.2 mg1ml x=0.25ml
0.05mg X
-Se hace lo mismo para todas las concentraciones, quedando:

Tubo 1 2 3 4 blanco Muestra

problema
Glucosa 0.2 0.25 0.5 0.75 1 - -
mg/ml (ml)
Mg glucosa 0.05 0.1 0.15 0.2 - -
Muestra - - - - - 1
problema
(ml)
H2O 0.75 0.5 0.25 1 1 -
Después se mezclan y se ponen a hervir por 10 minutos, luego se sacan y sin
agitar se enfrían.
Se agregan 1 ml de reactivo de somogyi a todos los tubos.
 Se mezcla nuevamente y se agregan 7 ml de agua destilada

Mezclar y determinar absorbancia a 540 nm, y se obtiene:

Tubos mg de Glucosa Absorbancia (540
nm)
0,0 0
Como la ec. es y = 5.4667x
1
0,05 0,27
Pendiente= 5.4667= k= factor
2
3 0,1 0,56 de calibración.
4 0,15 0,79

5 0,2 1,11 Como la muestra problema tiene

Muestra problema - 0,41 una A de 0.41, y como k= 5.4667
podemos calcular la
Curva de Calibración concentración del analito:
y = 5,4667x
Absorbancia (540 nm)

1,4
c=A/k  c= 0.41/ 5.4667
1,2
1
0,8 c= 0.0749 mg/ ml
0,6
0,4
0,2
0
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25
mg de Glucosa