Microscopía óptica y

electrónica
Blga. María Leticia Amésquita Cárdenas
DEPARTAMENTO DE MORFOLOGÍA
HUMANA
BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
 MICROSCO
PÍA conjunto
Técnicas y Métodos
tamaño
visible objetos estudio
fuera rango
aumenta resolución

Imagen
Tres

elementos
Objeto Sistema óptico
Fuente iluminación
Morfológicos Ver objetos invisibles a
Bioquímicos simple vista, lente
Fisiológicos Evidenciar y distinguir mayor
magnifica objeto
Genéticos aumento detalles objeto estudio

Manufactura industrial desarrollo tecnológico disfrutamos hoy

Microscopia papel
desarrollo de diversas
áreas del conocimiento: Ciencias de la salud incrementa esperanzas de vida
permite observación metódica entorno celular
 MICROSCOPIA Técnica es misma
e implica:
ÓPTICA ELECTRÓNICA
Difracción
Reflexión o
Refracción

Microscopia óptica:
• Procesos
biomolecular y
biomecánicos
internos, producto
de transcripción, de
interés en biología
celular

Microscopia electrónica:
• Tridimensionalidad de
las estructuras
celulares
• Distribución espacial
componentes
moleculares interior
 En medicina
MICROSCOPIO
Mikrós=pequeño
uso ?????? Skopéoo=observar

Leeuwenhoek, (siglo XVII) Calr Zeiss

Microscopios simples:
Combino 2 lupas 260 X
Visualizó: protozoos, bacterias,
espermatozoides y GR.
Abbe (1877)
Mejora microscopía de inmersión
Mejora óptica microscopio sustituye agua x aceite de cedro
Obtener 2000 X.

COMPUESTO
SIMPLE

Utiliza una lente “Compuesto”

ocular biconvexa porque:
montada en Luz atraviesa
columna dos o más lentes
afirmada a base Aumentan
o pie. imagen 100 y
Aumenta imagen 1500 veces
de 10 a 15 veces.
MICROSCOPIO ÓPTICO CAMPO CLARO
Fundamento: Uso de luz incidente o reflejada forma directa

REFLEJADA

REFRACTADA

Iluminación brillante muestra estructuras

internas y contorno de cubierta externa
 COMPONENTE ÓPTICO
Conjunto de lentes, con disposición que producen
aumento de imágenes que se observan a través de ellas.
OBJETIVOS
Real invertida
Caracteriza:
Lentes convergente= convexas
Lentes divergente= cóncava
Elimina aberraciones afecta calidad imágenes.
Lentes establece calidad de imagen en cuanto:
nitidez y capacidad para captar los detalles de
la misma (poder de resolución).

Lentes dispuestos en soporte o

camiseta metal tiene inscrita serie
numéricas que indican
 CLASIFICACIÓN DE OBJETIVOS
De acuerdo a:

1. Medio existente entre objeto examinado y lente frontal del objetivo.

Secos: entre objeto y objetivo = aire 10X, 20X y 40X
inmersión: entre objeto y lente frontal objetivo= aceite de inmersión 100X

2. Corrección a que se somete las lentes

(a) Acromático: corrigen rayos luminosos

azules y rojos hace coincidir un solo plano
focal.
(b) Semiapocromático o fluorita, imágenes
bordes nítidos. Corrige esfericidad verde y
azul, alta capacidad trasmitir rayos onda
corta en M. fluorescencia.
(c) Apocromático: rayos azules, rojos y
verdes, en solo plano, obtiene imagen de
borde nítidos.
 Factores que aumentan la capacidad de los
objetivos para formar imágenes
Índice de refracción: Angulo de apertura:
Capacidad de objetivo de captar los rayos luminosos
refractados cuando atraviesan medio transparente. A
mayor ángulo, la lente frontal del objetivo aceptará una
mayor cantidad rayos

Velocidad de la luz en el aire

IR=
Velocidad de la luz en el medio

IR de: Agua = 1.3300

Aceite de inmersión = 1.5150
Fluorita = 1.4340
Vidrio (crown) = 1.5200
- Esquema muestra un objeto (1) que es atravesado
por un haz de rayos luminosos (2) los cuales son
captados por el objetivo (3) Al formarse el cono de luz
proveniente del objeto se determina un ángulo,
también llamado de apertura, donde α representa la
mitad del mismo
Apertura numérica (AN):
Cifra a considerar para determinar el rendimiento
lente objetivo:
AN = n x sen a

Donde a = la mitad del ángulo de apertura del

objetivo.
n = el índice de refracción del medio entre
objeto y objetivo.

Poder de resolución:
Calculado mediante la fórmula

Donde: delta= resolución expresada en micrómetros.

lambda = longitud de onda de la luz empleada.
Como la ANobj y la ANcond son iguales, resume
2AN.
Distancia focal: relación existente entre
longitud del tubo microscopio y amplificación
usada

Distancia de trabajo: espacio existente entre

el punto más bajo del objetivo y la muestra
 Nomenclatura de los objetivos
Posible identificar las propiedades de los objetivos

PROPIEDADES ESPECIALES
DIC = Interferencia de contraste diferencial
H = que puede emplearse en microscopios con platina caliente (heating stage)
 OCULARES
• Forma 2° imagen a partir de la imagen 1° del objetivo.
• Imagen es de mayor tamaño, virtual y derecha.
• Lente solo amplía número veces (5X,8X,10X,12X,15X) la imagen
objetivo.

Clasificación:
Disposición de lentes y diafragma, en tubo

a) Oculares negativos de Hüygens:

Dos lentes plano convexos, superficie convexa hacia abajo. Entre ambos esta
diafragma anular, localizado plano focal de lentes. Al diafragma se puede
diafragma
adherir puntero que suele ser elaborado por pestaña o pelo.

b) Oculares positivos o de Ramsden.

Dos lentes plano convexas, superficies curvas dirigidas hacia
adentro. El diafragma situado por debajo de lente; en el plano diafragma

donde se forma la imagen formada por objetivo.

 COMPONENTE MECANICO
Sistema de soporte Sistema de ajuste
Pinza

Tubo

Brazo
Platina
Escala

Sistema de enfoque

Píe
MACROMETRICO

MICROMETRICO
 COMPONENTE DE ILUMINACIÓN
Suele ser una lámpara
halógena de
Comprende partes microscopio que reflejan,
Fuente de luz intensidad graduable transmiten y regulan cantidad luz necesaria
para efectuar observación a través MO.

Condensador:
concentra la luz de la
lámpara en un punto
de la preparación

Filtro

Interruptor y graduación Diafragma o iris

de la luz (está dentro del
Lámpara
condensador):si se
cierra mejora el
contraste, pero empeora
la resolución
 TIPOS DE MICROSCOPIO
a) Campo oscuro: b) Contraste de fases:

Revela mayor
diferenciación de
estructuras internas
Muestra con claridad la
cubierta externa

Usa condensador especial con disco opaco que elimina todo
la luz en centro de haz. La única luz que llega a muestra
incide en ángulo, así, solo luz reflejada por muestra llega al
objetivo.
Revela bordes de célula brillantes, algunas estructuras
internas brillan y cubierta externa es visible
Observar microrganismos vivos
Luz pasa a través de un diafragma anular.
Los rayos luminosos directos (no alterados por
muestra) siguen un trayecto diferente del de
los rayos de luz que son reflejados o
difractados cuando atraviesan la muestra.
Estos dos conjuntos de rayos se combinan en
el ojo
MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA

Detectar:
Anticuerpos
Sustancias autofluorescencia (vit.A)
Células teñidas con fluorocromos.
ADN y ARN

Evaluación del efecto de cloroquina en linfocitos

humanos, mediante el ensayo cometa

linfocitos cometizados
MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA
Utiliza fuente de luz ultravioleta excitadora de los
fluorocromos con los que se tiñe la muestra a observar y
posee un filtro especial que permite el paso de luz
emitida por fluorocormo.
Detectar microbios en muestras de tejidos
Detecta sustancias autofluorescencia (vit.A)
Células teñidas con colorantes fluorescentes.

Evaluación del efecto de cloroquina en linfocitos

humanos, mediante el ensayo cometa

linfocitos cometizados
 El microscopio electrónico de transmisión
(MET)

Es sobre todo una herramienta de investigación

Complicada para el uso rutinario de laboratorio.
Utiliza haz de electrones y lentes electromagnéticas
Crear imágenes de gran resolución y detalle como ultraestructura interna de las células
Resuelve estructuras menores de 0.2 um
Produce imágenes bidimensionales
 Partes principales de MET

Cañón de electrones: emite electrones que

atraviesan espécimen

Lentes magnéticas : crean campos

que dirigen y enfocan haz de
electrones

Bomba de alto vacío: electrones pueden ser

desviados por moléculas de aire, por lo que se
debe hacer vacío total en interior de microscopio

Placa fotográfica o pantalla fluorescente:

registra imagen aumentada

Sistema de registro: muestra imagen

que producen los electrones puede ser
ordenador
 MICROSCOPIO ELECTRONICO DE BARRIDO

Utiliza haz de electrones para barrer el espécimen y producir la salida de electrones

secundarios, que son los que crean la imagen.
Usa para estudiar características superficie de célula
Resuelve estructuras menores de 0.2 um
Produce imágenes tridimensionales
REFERENCIAS
Alberts, La célula
Paniagua, Biología celular
Ross, Histología
Cooper, La Célula