Guía de Prácticas de Biología Celular y Molecular Escuela de Medicina Humana – USAT

PRÁCTICA N° 6

Microscopía
I. INTRODUCCIÓN.
El Microscopio óptico es una herramienta de suma importancia en el laboratorio de
Biología Celular, a través del cual se pude obtener imágenes dimensionales del objeto
observado al ser atravesado por la luz mirando a través de los oculares. De un lado el
microscopio provee aumento y permite ver detalles de objetos tan pequeños que no
son visibles a simple vista (menor de 0,1 mm).36
Existe una gran variedad de microscopios que, según la fuente de iluminación
utilizada, se agrupan en:
Microscopios ópticos19: La fuente de iluminación es la luz.
a. De campo claro. Permiten la observación de preparaciones en sus colores
naturales o contrastados mediante tinciones, resaltadas sobre un fondo más
brillante.
b. De campo oscuro. Permiten la observación de formas celulares que destacan
brillantes sobre un fondo oscuro. Este efecto se consigue utilizando diafragmas
especiales.
c. De contraste de fases. Gracias a la utilización de diafragmas y objetivos
especiales, que consiguen aumentar las diferencias en el índice de refracción de
las células y el medio que las rodea, permiten la observación de células vivas, ya
que no es necesario realizar ninguna tinción de las mismas.
d. De interferencia. Permiten observar células vivas sin teñir, obteniéndose una
imagen en relieve de las mismas.
e. De fluorescencia. La fuente de iluminación proporciona luz ultravioleta que excita
ciertas moléculas presentes en las células (bien de forma natural o añadida a la
preparación) que emiten fluorescencia en el espectro visible.
Microscopios electrónicos37: La fuente de iluminación es un chorro de electrones
y las lentes son electroimanes.
a. De transmisión. Permiten la observación de muestras teñidas con sustancias que
son resistentes al paso de electrones y cortadas dando lugar a láminas finas,
denominadas cortes finos. Los electrones no son visibles directamente por lo que
éstos se envían a una pantalla que emite fluorescencia más o menos intensa según
el número de electrones que inciden en ella. Las estructuras celulares que se tiñan
más intensamente impedirán el paso de electrones y por lo tanto no permitirán la
emisión de fluorescencia, por lo que estas estructuras aparecerán oscuras en un
fondo más brillante. Se consiguen entre 10 000 y 100 000 aumentos.
b. De barrido. Permiten la observación de células enteras, sin necesidad de cortes
finos, de modo que aparecen los relieves originales y las superficies externas.
Alcanzan entre 1 000 y 10 000 aumentos.
Durante las prácticas se empleará el microscopio óptico de campo claro, cuyos
componentes fundamentales (mecánicos, de iluminación y ópticos). La capacidad de
un microscopio para observar diferentes estructuras se refleja en el número de
aumentos y en el límite de resolución (LR).

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El número de aumentos de un microscopio resulta de multiplicar los aumentos que

proporciona cada una de las lentes presentes entre la fuente de iluminación y el ojo.
El límite de resolución (LR) se define como la distancia mínima a la que se deben
encontrar dos puntos para que puedan observarse como distintos. El microscopio es
mejor cuanto menor sea el LR del mismo. El LR viene definido por la fórmula:

AN (Apertura numérica) = n. sen α; λ = Longitud de onda de la luz utilizada

Donde: n es el índice de refracción del medio y α es la mitad del ángulo de apertura
El Microscopio consta de las siguientes partes en su estructura:
A. Sistema Mecánico:
 Pie o Base
 Brazo o columna
 Tubo óptico
 Revolver
 Platina
 Tornillos Macro y Micrométrico
B. Sistema Óptico:
 Lentes convergentes que incluyen oculares y objetivos
C. Sistema de Iluminación:
 Espejo o lámpara de iluminación
 Condensador
 Diafragma y Portafiltro.

En el desarrollo de las prácticas serán usados 2 tipos de microscopios:

1. El microscopio estereoscópico, el cual es binocular, con aumentos de 4 a 40 veces.
Permite observar muestras opacas y realizar disecciones de estructuras en organismos
pequeños, ya que en él puede manipularse la muestra mientras se observa.
Proporciona una imagen tridimensional.
2. El microscopio compuesto, que puede ser monocular o binocular. Permite obtener
aumentos de 100 a 1500 veces. Los objetos a observar deben ser muy pequeños o
cortados en láminas tan delgadas que la luz pueda atravesarlos. Estos se colocan en
láminas de vidrio especiales denominadas porta-objetos y cubre-objetos. Las
imágenes que se obtienen son bidimensionales e invertidas.

II. OBJETIVOS.
2.1. Identificar las partes de un microscopio óptico
2.2. Explicar cómo se forman imágenes en el microscopio óptico.
2.3. Ejecutar correctamente preparaciones en fresco y en seco definiendo el uso
de los diferentes objetivos según el caso.

III. MATERIAL Y PROCEDIMIENTOS:

3.1. Materiales y equipos
3.1.1. Materiales:
1. Biológico: (POR MESA DE TRABAJO)
 Cabellos (2 unidades)
 Insecto o arácnido (1 unidad)
 Orina (50 ml)
2. De vidrio: (POR MESA DE TRABAJO)
 2 tubos de ensayo 13X100

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 10 láminas portaobjetos
 10 láminas cubreobjetos
 1 placa petri
 1 pipeta pasteur con chupón de goma
3. Reactivos y colorantes: (POR MESA DE TRABAJO)
 Azul de metileno (20 ml)
 Aceite de inmersión (5 ml)
4. Otros: (POR MESA DE TRABAJO)
 1 pizeta con agua destilada (300 ml)
 Papel milimetrado (10x10 cm)
 5 hisopos
 2 Estiletes
 1 Gradilla
 1 tijera
 3 Microscopios
 1 Estereoscopio

3.1.2. Equipos e instrumentos:

 1 centrífuga

3.2. Procedimientos.

3.2.1. Recomendaciones para el uso y mantenimiento del

Microscopio.
 Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y
bajar la platina completamente. Si el microscopio se recogió
correctamente en el uso anterior, ya debería estar en esas
condiciones.
 Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas
metálicas.
 Comenzar la observación con el objetivo de menor aumento: 4x o
5x (ya está en posición) o colocar el de 10x si la preparación es de
bacterias.
 Para realizar el enfoque:
 Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación,
empleando el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse
mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre
el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose
dañar alguno de ellos o ambos.
 Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando
lentamente el objetivo de la preparación con el macrométrico y,
cuando se observe la muestra, algo nítida, girar el micrométrico
hasta obtener un enfoque fino.
 Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi
enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico
para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por
completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo
anterior y repetir la operación de enfoque inicial. El objetivo de 40x
enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que
ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se
descuidan las precauciones anteriores o mancharlo con aceite de
inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el
objetivo de inmersión.
 Empleo del objetivo de inmersión:
 Bajar totalmente la platina.

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 Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo

de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde
habrá que echar el aceite.
 Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a
medio camino entre éste y el de 40x.
 Colocar una gota de aceite de inmersión sobre el círculo de luz.
 Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del
objetivo de inmersión.
 Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente
hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota
como si la gota ascendiera y se adosara a la lente.
 Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de
trabajo entre el objetivo de inmersión y la preparación es
mínima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de
accidente es muy grande.
 Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la
preparación, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre
esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto, si desea
enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la
operación desde el enfoque inicial.
 Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la
platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el
revólver. En este momento ya se puede retirar la preparación
de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión
en posición de observación.
 Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando una
solución limpiadora y un papel especial para óptica. Comprobar
también que el objetivo 40x está perfectamente limpio.

3.2.2. Mantenimiento del microscopio y precauciones

 Cuando no se está utilizando el microscopio, hay que mantenerlo
cubierto con su funda para evitar que se ensucien y dañen las lentes.
Si no se va a usar de forma prolongada, se debe guardar en su caja
dentro de un armario para protegerlo del polvo.
 Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor
aumento en posición de observación, asegurarse de que la parte
mecánica de la platina no sobresale del borde de la misma y dejarlo
cubierto con su funda.
 Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian,
limpiarlas muy suavemente con un papel para lentes.
 No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está
utilizando el microscopio.
 Después de utilizar el objetivo de inmersión, hay que limpiar el
aceite que queda en el objetivo. Si el aceite ha llegado a secarse y
pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-
acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este tipo de limpieza,
porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden dañar las
lentes y su sujeción.
 No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio
(macrométrico, micrométrico, platina, revólver y condensador).
 El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo
siempre la mirada a la preparación para prevenir el roce de la lente
con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrándolo por el
tubo del mismo ni hacerlo mientras se está observando a través del
ocular.

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 Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama

sobre ella algún líquido, secarlo con un paño. Si se mancha de
aceite, limpiarla con un paño humedecido en alcohol.
 Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al
finalizar la sesión práctica.

3.2.3. Identificación de las partes del microscopio.

 Coloca el nombre de cada parte del microscopio en el gráfico:

1. . ........................................................... . 2. . ............................................................

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3. . ........................................................... 10...............................................................

4. . ........................................................... .............................................................

5. . ........................................................... 11. . ............................................................

6. . ........................................................... 12.. ............................................................

7. . ........................................................... 13.. ............................................................

8. . ........................................................... 14.. ............................................................

9. . ...........................................................

3.2.4. Variación de la superficie del campo visual.

 Recortar un pedacito de papel milimetrado de 1 cm2 y colocarlo
sobre un portaobjeto.
 Agregar una gota de agua y luego colocar un cubreobjeto.
 Enfocar el preparado con el objetivo de menor aumento y viendo
las marcas milimétricas determina el diámetro del campo visual.
 Sabiendo que la superficie del círculo del campo visual (S) es igual
a r2, donde  = 3,14 y r = ½ d, calcula el valor de esta superficie
para el objetivo de menor aumento.
 Ahora enfocar con el objetivo 10x y siguiendo el procedimiento
anterior, calcular para este objetivo, la superficie del círculo del
campo visual.
 Sabiendo que el diámetro del campo visual es inversamente
proporcional al poder de aumento de los objetivos, se puede
determinar el diámetro correspondiente al objetivo de mayor
aumento mediante la siguiente fórmula:
 A1   D2 
 A    D donde
A2 D 11
   

A1 = Número de aumento del objetivo de menor aumento.
A2 = Número de aumento del objetivo de mayor aumento.
D1 = Diámetro del campo observado con menor aumento.
D2 = Diámetro del campo observado con mayor aumento.

 Calcular el diámetro y la superficie del círculo del campo visual

para el objetivo de mayor aumento del microscopio.
 Comparar este valor obtenido con los anteriores
 Dibujar las observaciones y explica.

3.2.5. Profundidad del Campo Visual.

 Preparar un montaje húmedo de dos cabellos, dispuestos uno sobre
otro (en forma de cruz).
 Visualizando con el objetivo de menor aumento, ubicar el
portaobjeto de manera que el cruzamiento de los cabellos quede
en el centro el campo.
 Ahora visualizar a 400x
 ¿Ambos cabellos tienen el mismo plano focal (nivel de enfoque)?
Fundamente su respuesta.
 Observar a 50x y dibujar.

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3.2.6. Preparados microscópicos en fresco.

 Colección de orina: En varones, colectar el chorro intermedio de la

primera orina de la mañana en un frasco de vidrio o plásticolimpio
o estéril. En mujeres, realizar higiene de la zona uretral y luego
colectar el chorro intermedio.
 En un tubo de ensayo 13x100 colocar 6 ml de orina y centrifugarla
a 3000 rpm por 5 minutos.
 Descartar el sobrenadante y agitar vigorosamente el sedimento con
lo que queda de líquido en el fondo del tubo.
 Con una pipeta pasteur tomar el homogeneizado y en una lámina
portaobjetos coloca una gota de la muestra
 Poner encima una lámina cubreobjeto.
 Observar con los objetivos 5x, 10x y 40x. NO USAR EL OBJETIVO
DE INMERSIÓN.
 Esquematizar lo observado a 400x en una circunferencia de 10 cm
de diámetro, tratando de que exista proporción entre lo visto y lo
esquematizado.

3.2.7. Observación tridimensional en el estereoscopio.

 Colocar sobre la base de una placa petri, un insecto y observar sus
estructuras.
 Graficar lo observado.

3.3. Manejo de Residuos.

El material de vidrio con las muestras procesadas deberá lavarse con
abundante agua y detergente, enjuagándolos luego con agua destilada.
Los residuos líquidos no tóxicos se eliminarán directamente hacia el
alcantarillado, inclusive la muestra de orina.
Los insectos pueden desecharse directamente en el recipiente de residuos del
laboratorio.

IV. RESULTADOS.

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V. FUNDAMENTACIÓN.

5.1. Metodología.

PARTES DEL MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO.36

Un microscopio óptico consta de una parte mecánica, una parte óptica y un sistema
de iluminación:

A. PARTE MECÁNICA.
Consta del pie, la columna o brazo, la platina, el tubo y los tornillos (perillas)
macrométrico y micrométrico.
1. Base o pie: se encuentra en la base, suele tener forma de herradura y en él
descansa el resto del microscopio.
2. Columna o brazo: ubicada sobre el pie, sirve de soporte a los demás
accesorios. Esta parte se coge cuando se desea trasladar el microscopio.
3. Tubo: sostiene al sistema óptico. En su parte superior se ubican las lentes
oculares que pueden ser una (en los microscopios monoculares) o dos (en los
microscopios binoculares). En su extremo inferior se ubica el revólver, que
es una placa giratoria que sostiene las lentes objetivos de distintos aumentos
que pueden cambiarse al girar el revólver.

Revólver

4. Platina: ubicada en la parte media, de forma cuadrada o rectangular, soporta

la preparación y presenta un orificio en el centro que permite el paso de la luz.
Anexa a la platina se encuentra una pinza de sujeción para el preparado,
que permite mover la preparación a voluntad en dos direcciones (Norte-Sur y
Este-Oeste), mediante el movimiento de tornillos ortogonales ubicados
debajo de ella. Estos tornillos pueden funcionar independientemente o ser de
comando coaxial (estar sobre el mismo eje). La mayor parte de las platinas
presentan una escala y un nonio que facilitan la señalización de posiciones
determinadas en la preparación. La escala presenta líneas marcadas a un
milímetro de distancia. El nonio es una escala corta que presenta 10 líneas
divisorias que se corresponden con 9 divisiones de la escala principal.

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5. Tornillo macrométrico: mueve la platina o el tubo hacia arriba o hacia

abajo, acercando o alejando rápidamente el objetivo a la distancia de trabajo
aproximada con respecto a la muestra.
6. Tornillo micrométrico: permite mover lentamente y con precisión el tubo
hacia la platina o viceversa.

B. PARTE ÓPTICA
Consta de las lentes oculares, los objetivos y el condensador.
1. Oculares: Es un sistema de lentes que aumenta la imagen producida en el
objetivo, aumento que está grabado en la parte superior (4X, 5X, 6X, 8X, 10X,
15X y 20X, siendo los más comúnmente usados los de 6X y 10X). Compuestos
por lentes que multiplican el aumento del objetivo, un buen ocular (10x) puede
permitir un aumento total de 1000x.

2. Objetivos: Cada objetivo consiste en un conjunto de lentes que en realidad

cumplen la función de una sola. Este sistema sirve para corregir errores de
observación que derivarían del uso de una sola lente.
En los microscopios modernos es común que los objetivos sean parafocales, es
decir, que si se encuentra enfocado uno de ellos, al girar el revólver y cambiar
por otro objetivo, éste resulta prácticamente enfocado, siendo suficiente sólo
una ligera corrección con el micrométrico para lograr el enfoque perfecto.
En cada objetivo se pueden observar una serie de numeraciones grabadas que
indican:

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a) Aumento: puede ser variable (4X, 16X, 20X, 25X, 40X, 45X, 60X, 95X,
100X, éstos dos últimos se utilizan como objetivos de inmersión). Respecto
del aumento hay que diferenciar:
 Aumento primario: es el dado por el objetivo en sí.
 Aumento total: es el que se obtiene multiplicando el aumento del
ocular por el del objetivo. Nos dice cuántas veces está amplificada la
imagen que obtenemos del material examinado.
 Aumento útil: es el aumento total del microscopio cuando no excede
de cierta cantidad condicionada por la abertura numérica del objetivo.
Significa que si el aumento total supera el aumento útil la imagen
obtenida es muy grande, pero borrosa, sin definición. En los objetivos
de tipo acromático el mayor aumento útil posible es de mil veces la
abertura numérica (A. N. * 1.000), mientras que en losobjetivos más
perfeccionados, como los apocromáticos o los de fluorita, el límite de
aumento útil es de 1. 500 veces la abertura numérica (A. N. * 1.500).
b) Abertura Numérica (AN): cada objetivo tiene un determinado poder de
resolución que se mide en términos de abertura numérica del objetivo.
Cuando un objeto es iluminado, la luz emerge de él formando un cono que
penetra en la lente frontal de un objetivo. Se lo denomina ángulo de
abertura; y a la mitad de este ángulo de abertura se lo llama ángulo x. El
medio en el que el objetivo trabaja (aire, aceite o agua) tiene un índice de
refracción determinado al que designamos como N. La abertura numérica
se determina entonces del siguiente modo:

A. N. (abertura numérica) = seno de x * N

La abertura numérica determina las siguientes características ópticas:

1. Resolución: es la capacidad que posee un objetivo para permitir
visualizar dos puntos muy próximos entre sí.
2. Límite de resolución: es la mínima distancia en que dos puntos
próximos se ven como separados.
Por lo tanto:
a menor límite de resolución, mayor poder resolutivo
El límite de resolución se calcula del siguiente modo:

0.61 = constante
λ = longitud de onda de la luz incidente
A. N. = abertura numérica
Si se pretende observar estructuras muy pequeñas se requiere el menor
límite de resolución posible. Deduciendo de la fórmula, esto se consigue
con mayor abertura numérica y menor longitud de onda de la luz
incidente.

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El poder de resolución de los instrumentos nos permite detectar objetos cada

vez más pequeños.

Aumento del Apertura numérica

objetivo
3,2x 0,07
4x 0,10
10x 0,22
10x 0,25
25x 0,45
40x 0,65
63x 0,80
100x 1,25 oil

Una manera sencilla de calcular el aumento útil (ampliación de la imagen

del objeto por un juego de objetivo + ocular) es multiplicando la AN
del objetivo por 1000. La cifra obtenida es el aumento total que debe
tener la imagen cuando se multiplica el aumento del objetivo por el
aumento del ocular. Por ejemplo, si se tiene un objetivo de 100x que
posee una AN=1,25, el aumento máximo que debe presentar la imagen
para ofrecernos la mayor cantidad de detalles,es aquel que resultaría de
multiplicar 1,25 x 1000 = 1 250 aumentos, por lo tanto si el objetivo es
de 100 ampliaciones, debemos usar un ocularde por lo menos 12x.

C. SISTEMA DE ILUMINACIÓN

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1. Fuente de luz: puede utilizarse luz artificial de una lámpara externa o una
que se inserta en la base del microscopio. Cuando se utiliza la lámpara externa
se requiere de un espejo.
2. Espejo: lo requieren los microscopios que trabajan con lámparas externas y
permite reflejar hacia arriba la luz que debe pasar a través del diafragma, la
platina, la preparación y el sistema óptico. El espejo plano se utiliza cuando
hay bastante luz y el cóncavo cuando hay poca luz.
3. Condensador: constituido por una lente que concentra los rayos de luz
iluminando la preparación en la parte enfocada por el objetivo, de modo que
el campo visual presente una iluminación uniforme. Además proporciona al
objetivo un cono de luz adecuado en tamaño y naturaleza, para obtener
óptimos resultados en la observación.

4. Diafragma: semejante al de una cámara fotográfica que deja penetrar sólo

los rayos útiles y elimina los laterales que generalmente molestan. Regula la
cantidad de luz que pasará a través de la preparación. Antes de enfocar, el
diafragma debe estar completamente abierto, graduándose a continuación su
abertura según los aumentos del objetivo. Con altos aumentos el diafragma
debe estar más abierto que con los bajos aumentos.

PODER DE PENETRACIÓN O DE PROFUNDIDAD DE CAMPO.37

La imagen que se forma a través del microscopio proviene de un objeto sumamente
delgado (5μm a 10μm de grosor), que genera varios planos de imágenes: profundos,
intermedios y superficiales. Cuando se examina un tejido con objetivos de bajos
aumentos (4x ó 10x) la imagen que se observa puede enfocarse con facilidad con el
tornillo macrométrico, sin que se diferencien los planos de enfoque antes
mencionados; pero cuando la imagen se forma al emplear objetivos de 40x y 100x, es
necesario utilizar el enfoque fino a través del tornillo micrométrico, pues es mucho
más evidente que si enfocamos el plano superficial, es probable que al ascender
levemente la platina por acción del micrométrico logremos enfocar y visualizar con
nitidez el plano focal medio o el profundo.
Por lo tanto, el poder de penetración o de profundidad de los objetivos es
inversamente proporcional al aumento propio de los mismos.

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Distancia libre de trabajo. Se denomina así a la distancia que existe entre la

superficie de la laminilla cubreobjetos y la lente frontal del objetivo. Esta distancia
será mayor cuanto menor sea el aumento propio del objetivo y viceversa.

5.2. Importancia biológica.

Rutinariamente se utilizan diferentes tipos de microscopía óptica para estudiar varios

aspectos de la estructura celular38:

El más simple es el microscopio de campo luminoso en el que la luz pasa

directamente a través de la célula y en el que la habilidad para distinguir las diferentes
partes de a célula, depende del contraste que se obtiene de la absorción de la luz visible
por los componentes celulares. En muchos casos las células se tiñen concolorantes que
reaccionan con las proteínas y ácidos nucleicos para resaltar el contraste entre las
diferentes partes de esta. El examen de los tejidos fijados y teñidos por microscopía
de campo luminoso es la práctica estándar para analizar muestras de tejidos. Los
procedimientos de tinción generalmente matan a las células. Sin embargo, existen
dos métodos para observar células vivas: La microscopía de contraste de fases y
la microscopía de interferencia – contraste diferencial. Los dos tipos de
microscopía utilizan sistemas ópticos que convierten las variaciones de densidad o
grosor entre las diferentes partes de la célula en diferencias de contraste que se
pueden apreciar en la imagen final. En la microscopía de campo luminoso, las
estructuras transparentes (como el núcleo) presentan poco contraste porque absorben
pobremente la luz. Sin embargo, la luz disminuye cuando pasa a través de estas
estructuras, por lo que su fase se altera en comparación a la luz que ha pasado a través
del citoplasma que las rodea. La microscopía de contraste de fases y de interferencia-
contraste diferencial convierten estas diferencias de fase en diferencias de contraste,
mejorando de ese modo las imágenes de las células vivas sin teñir.

La microscopia óptica se ha llevado al nivel del análisis molecular mediante métodos

que marcan moléculas específicas y que pueden ser visualizadas dentro de las células.
Genes específicos o transcritos de ARN se pueden detectar mediante hibridación con
sondas de ácidos nucleicos de secuencia complementaria, y las proteínas pueden
detectarse usando anticuerpos apropiados. Tanto las sondas de ácidos nucleicos como
los anticuerpos se pueden señalar con variedad de marcadores que permitan su
visualización en el microscopio óptico, permitiendo determinar la localización de
moléculas específicas en células individuales.

La microscopia de fluorescencia se utiliza extensamente y es un método muy

sensible para el estudio de la distribución intracelular de las moléculas. Se utiliza
una tinción fluorescente para marcar las moléculas que interesan tanto en células
fijadas o vivas. Mediante la tinción fluorescente una molécula absorbe la luz a una
longitud de onda y emite luz a una segunda longitud de onda. Esta fluorescencia se
detecta mediante la iluminación de la muestra con una luz de una longitud de onda
que excita al tinte fluorescente, usándose más tarde filtros apropiados para detectar la
longitud de onda específica que emite el tinte. La microscopia fluorescente se puede
utilizar para estudiar una gran variedad de moléculas dentro de las células. Una de las
aplicaciones más frecuentes es la señalización de anticuerpos con tintes fluorescentes
dirigidos contra una proteína específica, de manera se pueda determinar la
distribución intracelular de la proteína.
Las imágenes obtenidas por microscopía de fluorescencia convencional son borrosas
como consecuencia de la fluorescencia no enfocada. Estas imágenes pueden ser
mejoradas mediante un tratamiento informático denominado desconvolución de
imágenes, en el que una computadora analiza las imágenes obtenidas de diferentes
profundidades de foco y genera una imagen más nítida como cabría esperar a partir

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de un único punto focal. Alternativamente, la microscopía confocal permite la

obtención de imágenes de contraste y detalle incrementados, mediante el análisis de
la fluorescente de un solo punto de la muestra. Un pequeño punto de luz,
normalmente producido por un láser, se enfoca en la muestra a una profundidad
determinada. La luz fluorescente emitida se recoge utilizando un detector, como una
videocámara. Antes de que la luz emitida alcance el detector, ésta debe atravesar el
agujero de una aguja (llamado apertura focal) situada precisamente en el punto donde
la luz emitida desde la profundidad elegida de la muestra es enfocada. Por tanto,
solamente la luz emitida desde el plano de enfoque es capaz de alcanzar el detector. El
barrido a lo largo de la muestra genera una imagen del plano de enfoque en dos
dimensiones, una imagen mucho más detallada que la obtenida con la microscopía
fluorescente habitual. Además, es posible fundir una serie de imágenes teñidas a
distintas profundidades para reconstruir una imagen tridimensional de la muestra.

La microscopía de excitación multifotónica es una alternativa a la microscopía

tridimensional que también puede aplicarse a las células vivas. La muestra se ilumina
con una luz de una longitud de onda tal que la excitación del tinte fluorescente
requiera la absorción simultánea de dos o más fotones. La probabilidad de que los dos
fotones exciten simultáneamente al tinte fluorescente solamente es importante en el
punto de la muestra en el que el láser está enfocado, de tal manera que la fluorescencia
solo se emite desde el plano de enfoque de la luz. Esta potente excitación proporciona
automáticamente una solución tridimensional, sin necesidad de que la luz emitida
atraviese la apertura de una aguja, como en la microscopía confocal. Además, la
localización de la excitación reduce el daño de la muestra, permitiendo imágenes
tridimensionales de células vivas.

Asalde R, Arce Z, Llontop J, López E 61