CROMATOGRAFÍA DE LIQUIDOS

DE ALTA RESOLUCIÓN (CLAR)

HIGH PERFORMANCE LIQUID
RESOLUTION (HPLC)
¿QUÉ ES Y PARA QUÉ SIRVE?

• Técnica cromatográfica que nos sirve para la

separación, identificación y cuantificación de
compuestos en una mezcla.

• Es uno de los métodos de separación por

cromatografía más utilizado en el área analítica
por su sencillez, robustez, y eficiencia.
FUNDAMENTOS
Cuando una mezcla es colocada sobre un material
sobre el que se pueda adsorber pero sin llegar a
absorberse, va a eluir sobre esta si se le añade una
fase movil y se va a separar dependiendo su
polaridad.
FUNDAMENTOS
• Fase estacionaria: material que tiene la
Columna más común es C18
capacidad de adsorber y “retener” a (Octadesilsilano) en Fase Reversa
sustancias en su superficie, para que
puedan ser separadas. Se debe elegir
para que no interactúe con la muestra.
• Fase móvil: fluido que puede ser liquido,
gas o fluido supercrítico y que se usa
como portador de la mezcla para hacer
pasar la muestra a través de la fase
estacionaria.
Solventes ultrapuros HPLCmás comunes
Metanol, Acetonitrino y agua.
FUNDAMENTOS
FASE NORMAL FASE REVERSA
Fase estacionaria Polar Fase estacionaria No polar
Fase movil No polar Fase movil Polar
Poco usada en general Muy usada

Fases estacionarias Fases móviles

Polares: Silicagel, celulosa, alumina. Polares: Agua, metanol, acetonitrilo.
No polares: Octadesilsilano (C18), C12, etc. No polares: Hexano
 FUNDAMENTOS
Bomba Inyector
Muestra

Precolumna y
Automuestreador
Columna

Desgasificador

Fase móvil
Isocrático: Un solo solvente
Gradiente: Varios solventes

Línea al
Reservorio de detector Detector Computadora con software para
solvente Desechos Espectro UV recolección y análisis de datos
PARTES DE UN HPLC

Desechos

Computadora
MANEJO HPLC

• Preparar Fase Movil

• Filtrar fase movil (con vacío y membrana)
• Desgasificar por sonicación (no pueden
quedar burbujas, media hora por cada
litro)
• Conectar al HPLC (filtro siempre
remojado, para evitar burbujas)
MANEJO HPLC
• Encender todos los componentes del
equipo (detector, bomba, desgasificador,
muestreador, computadora)
• Colocar en la bomba, la línea que se va a
ocupar (A, B, C o mezclas en porcentaje,
p. ej. 50% y 50%)
• Purgar bomba (Entrar en modo purgado,
colocar a altos flujos y mantener ahí
hasta sacar todas las burbujas). En
automáticos es con un botón, en
manuales se saca con jeringa un
volumen para acelerar proceso.
MANEJO HPLC
• Conectar la columna y poner a flujo
normal (1mL/min, monitorear
presión, la columna puede
despresurizarse o el equipo dañarse y
es muerte total). Subir de 0.2 en 0.2
• Acondicionar hasta obtener una línea
recta. (Puede durar una hora o más)
• Colocar muestras en el
automuestreador.
 MANEJO HPLC
• Programar el equipo para leer las
muestras en el orden que quieran.
(Individual o por corridas) Colocar tiempo
de corrida después de hacer una prueba
con la muestra de media hora.
• Leer y obtener datos (integrar)
• Lavar el equipo y la columna con tres
fases distintas por lo menos media hora
cada fase. Agua:Metanol 90:10, 50:50,
0:100. O el protocolo que ustedes
decidan o el equipo indique.
CROMATOGRAMA

Factor de capacidad K’

K’: (Tr-Tm)/Tm

Importante que sea alto en

muestras biológicas por el ruido