Purificación de compuestos

fenólicos, flavonoides
Mg. Víctor Peralta Lázaro
 Flavonoides

Estructura
Los compuestos
fenólicos contienen al
menos un anillo
aromático (bencénico)
 Estructura tipo C6-C3-C6 .
con 1 a > grupos
hidroxilos  Dos anillos fenólicos (A y B), unidos por
una cadena de 3 carbonos ciclada a
través de un oxígeno – anillo pirano (C).
 Se dividen en 6 grupos, de acuerdo a las
 Más de 10 000 estructuras en el diferencias en el anillo pirano y patrones
reino vegetal. de –CH3 o –OH en los anillos fenólicos.
 Capacidad antioxidante Se clasifican
 Propiedades biológicas
No Flavonoides
 Están presentes como polifenoles,
ésteres o glucósidos  Ácidos fenólicos.
 Ligninas
 Estilbenos
Propiedades físicas y químicas
Naturaleza ácida del grupo fenólico
• Son considerados ácidos débiles.
• Las sustituciones que se hagan afectan la acidez.
• Característica ácido fuerte  soluciones alcalinas
para la extracción.
• Características ácido débil  solventes orgánicos
para la extracción
Puentes de hidrógeno
• Pueden formar puentes de hidrógeno de tipo
intra e intermolecular.
• Influyen en el punto de ebullición.
• Los enlaces intra reducen la solubilidad
• Los enlaces inter dificultan la purificación.
Complejos con metales
• Formar complejos con aluminio, fierro, otros.
• Aumenta la capacidad antioxidante y ayuda en su
cuantificación.
Formación de enlaces éster y glucósidos
• Forma enlaces éster a través de la unión de un
grupo -COOH y un grupo –OH.
• Forma enlaces glucósidos a través de la unión del
grupo –OH con un azúcar.
• Enlaces glucósidos aumentan la solubilidad en
agua.
Oxidación
• Capacidad antioxidante  Secuestro de radicales
libres.
• Busca asociarse y formar estructuras más
complejas.
Absorción de luz
• La absorción máxima de luz se da entre 275 a 280
nm.
• Mayores rangos de absorción de luz está asociado
a cambios en el anillo fenólico B (alrededor de
350 nm); mientras que rangos menores están
asociados a cambios en el anillo A.
• La co-pigmentación o quelaciones con metales
también aumentan el rango de absorción de luz.
 Método de extracción modernos

Extracción y purificación
Extracción

 Estructura contienen > número

de grupos –OH o azúcares son
compuestos polares 
solventes como etanol, metanol,
butanol, acetona, agua
 Compuestos menos polares
solventes como éteres y
cloroformo

Método de extracción tradicional

 Purificación
 CP, usan mezclas de solventes
(cloroformo, ácido acético, agua), la
lectura se realiza en UV a una longitud de
onda cercano a 366 nm.
 CCF, como FE se puede utilizar celulosa,
silica gel o poliamida, la lectura en UV
cercano a 366 nm.
 CC, FE se puede utilizar silica gel,
poliamida, celulosa, sephadex.
 HPLC, FE se utilizan columnas de C18, se
utilizan de forma continua mezclas de
solventes de agua con metanol, ácido
acético o acetonitrilo, la lectura se realiza
por UV cercano a 280 nm. De preferencia
utilizar un Detector de arreglo de diodo
(DAD).
 HSCCC, utiliza como FM solventes TFA o
mezcla de cloroformo, metanol y agua a
800 - 600 rpm, la lectura se realiza en
UV.
Análisis artículos científicos 1
 Materiales y Métodos Resultados

 Buganvilla Glabra.  Cuantificaron 9 compuestos fenólicos de 22 estándares.

 Extracción se realizó por maceración sucesiva por 72h

con metanol y diclorometano, concentrada por
rotavapor.
 Cuantificó la composición de los compuestos fenólicos
por HPLC-PDA, la detección se realizó por UV (calibrado
entre 200-500 nm), FS se utilizó columna C18, FM se
utilizó mezcla de agua con acetonitrilo (93:7 v/v). La FM
se agrego por fases en las siguientes diluciones: 25, 50,
75, 100 y 200 µg/ml.
Discusión
 Extracto de flores con metanol contenía una mayor cantidad de compuestos fenólicos:
 Ácido gálico (2.39 µg/g)  Tanino hidrolizable
 Catequina (6.31 µg/g)  Flavanol
 Rutina (1.26 µg/g)  Flavonol
Análisis artículos científicos 2
 Tiempo de separación
muy alto  desperdicio
de solvente un modo de
Materiales y Métodos Resultados extrusión

 Extracto de Shan Zha (espino

chino).

 I) Separación por HSCCC-DAD, FE columna

C18, se aplicaron tres series de solventes que
incluían: n-hexano, etilo acetato, metanol, 98% de
pureza
agua/n-hexano, etanol, agua/cloroformo,
agua.
 Cuantificó la constante de disociación (KD
value), medición a 254 nm.
 II) Purificación por HPLC, FE columna C18, FM
solvente agua y acetonitrilo 19:81 v/v (0-3
min 13%, 3-15 min 14%, 15-15.1 min 17% y
15.1-20 min 135), medición se realizó a 254
nm.
 Discusión Resultados

 Se eligió el solvente
cloroformo/metanol/agua/n-
butanol (4:3:2:2, v/v).
 Tiempo de separación de 7 h y la
FE tuvo una retención de 62.8%,
se obtuvieron cinco picos con un
98% de pureza.
 Los picos I-V se analizaron por
HPLC, obteniendo 3 compuestos
purificados al 98%:
 Vitexina (4.6 mg)  Flavona
 Hiperósido (11.7 mg) 
Flavonol
 Isoquercitrina (9.2 mg) 
Flavonol
Análisis artículos científicos 3
 Materiales y Métodos Resultados

 Hojas de Mulberry, secado y molido,

extracción por solvente (etanol) con
asistencia de ultrasonido, filtración y
concentración por rotavapor.

 I) Separación por HSCCC-detector UV,

solventes: etilo acetato, n-butanol, agua y
etilo acetato, etanol, agua.
 Se cuantificó el coeficiente de partición
(KD) y se utilizó Rutin como estándar.
 II) Purificación por HPLC, FM se utilizó
metanol y ácido fosfórico 50:50 v/v, la
medición se realizó a 257 nm.
 Discusión Resultados

 Se eligió las mezclas de solventes 2,

5, 6 y 8 basándose en los criterios de
tiempo de separación, coeficiente de
partición, polaridad.
 Se seleccionó la mezcla de solvente
5, la cual tuvo una retención de la FE
de 50.8% con un tiempo pico de 98
min.
 Se realizaron pruebas a distintos
flujos de solvente, obteniendo los
mejores parámetros para el HSCCC,
con un 93.8% de pureza del
producto.
 Se analizó la pureza de los
flavonoides por HPLC.
Conclusiones
• Los efectos de la estructura molecular y la polaridad de los
compuestos fenólicos, flavonoides en la elección del solvente deben
ser analizados.
• Los Flavonoides tiene una cierta polaridad debido a su estructura
(Anillos fenólicos A y B), esta polaridad se da principalmente por la
acción de los grupos carbonilos. La presencia de grupos hidroxilos
también brinda características hidrofílicas.
• Para la separación y purificación de los flavonoides se incluye una
gran variedad de métodos por cromatografía, observando una
tendencia al uso del HPLC y una alternativa reciente el uso de HSCCC.
Bibliografía
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