CROMATOGRAFÍA

LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA

(HPLC)
Cromatografía líquida de alta eficiencia
La fase móvil es líquida

Partición o reparto
Adsorción
Intercambio iónico
Exclusión molecular
 Cromatografía líquida de alta eficiencia
Características y ventajas
 Trabaja con partículas muy pequeñas (< 10 m)
 Presiones de 1000 - 6000 psi (pounds square inch
= libras por pulgada cuadrada, 1 atm = psi/14.7)
 Rápida
 Picos angostos (alta eficiencia)
 Separa compuestos no-volátiles o térmicamente
inestables
Esquema del equipo de HPLC

INYECTOR
PRE-COLUMNA

BOMBA

CÁMARA DE
MEZCLA

COLUMNA

DETECTOR
Partículas pequeñas aseguran mayor eficacia pero
requieren mayor presión
 H vs  para partículas de diferentes diámetros

H 10 m

5 m

3 m

 (cm/min)
 Sistemas de bombeo

Requerimientos
 Generación de altas presiones (1000 - 6000 psi)
 Flujo libre de pulsaciones
 Caudales 0.1 – 10 mL/min
 Componentes resistentes a la corrosión (acero
inoxidable, teflón)
 Bomba recíproca o de movimiento alternado
etapa de aspiración etapa de descarga
hacia la columna

pistón

fase móvil

Ventajas: pequeño volumen interno, resiste presiones > a

10.000 psi, permite elución con gradiente, caudales
constantes e independientes de la contrapresión de la
columna y la viscosidad del solvente
Desventaja: produce flujo pulsado (amortiguar)
 Sistemas de inyección de muestra

Llenado del bucle Inyección de

muestra muestra en columna

eluyente eluyente

columna columna
Sistemas de inyección de muestra
Sistemas de inyección de muestra
 Precolumna

 Composición similar a la columna cromatográfica

 Elimina materia en suspensión y componentes de
la muestra que se unen irreversiblemente a la FE
 Se usa para mejorar la vida de la columna. Se
reemplaza cuando se contamina.
 Columna

 Tubos de acero inoxidable. Ocasionalmente

de vidrio resistente

 Rectas (10 - 30 cm de longitud) y 4-10 mm d.i.

 Tamaño partículas de relleno: 5–10 m

 Columnas termostatizadas: en general se

trabaja a T ambiente. La T constante mejora el
cromatograma
Columna
 Columna

Rellenos
Relleno pelicular. Esferas de vidrio o polímero
no porosas de 30 – 40 m de diámetro. En la
superficie de las esferas se deposita una capa
delgada y porosa de sílica, alúmina, polímero.
Relleno de partículas. Micropartículas porosas
de sílica, alúmina o polímero de 3 – 10 m de
diámetro. Se recubren con películas orgánicas
que unen químicamente o físicamente a la
superficie.
Sílice como material de relleno
Cromatografía de reparto L-L
 El proceso de elución
Características
 La elución es la capacidad que tiene un disolvente de
desplazar un soluto a través de la fase estacionaria.
 La fuerza eluyente es una medida de la energía de
adsorción del disovente. Cuanto mayor sea la fuerza
eluyente del disolvente, más rápidamente eluirán.
 En cromatografía de fase normal (F.E polar), la fuerza
eluyente aumenta al aumentar la polaridad. Mientras que en
cromatografía de fase inversa (F.E no polar), la fuerza
eluyente disminuye al aumentar la polaridad.
 Elución isocrática vs elución con gradiente
Elución isocrática: solvente de composición constante.
Elución con gradiente: solventes de distinta polaridad. Se
varía la composición de la FM en forma continua o
escalonada.
Elución con
Elución gradiente
isocrática
Solventes utilizados como FM

 Solventes orgánicos, agua/solventes miscibles,

agua/soluciones reguladoras
 Alta pureza
Tratamiento con He
Sistema de desgasificación al vacío
 Desgasificados
Filtración
 Detectores
 Basados en la medida de una propiedad del
disolvente (índice de refracción, constante
dieléctrica, densidad)
 Basados en la medida de una propiedad del soluto
(absorbancia, fluorescencia, corriente límite)

Requisitos
 Sensibilidad adecuada
 Respuesta lineal amplia
 Respuesta rápida y reproducible
 Manejo sencillo
Celda del detector UV-visible en HPLC
De la columna

Ventanas
de cuarzo

Fuente UV Detector

Al desecho
 Eficiencia de la columna

Tamaño Ensanchamiento
partículas
Tamaño de extracolumna
de empaque muestra
 Tamaño de muestra

H adsorción
L-L (k = 2.3)
De acuerdo al
tipo de FE el fase ligada (k = 4.3)
efecto es más
o menos fase ligada (k = 1.2)
pronunciado
g muestra/ g empaque
 Ensanchamiento extracolumna

Se origina en los tubos que conectan los

componentes del sistema cromatográfico (puerto de
inyección y columna, columna y detector, etc.)

radio del tubo [cm]

velocidad lineal de
FM [cm/s]
r2
Hex =
24 DM

coeficiente de difusión del

soluto en fase móvil [cm2/s]
 Análisis cuantitativo en CL y CG

Uso de patrón externo Uso de patrones

externo e interno

S S P

Área S Área S
Área P

Área Sx Área Sx
Área P

Sx [S] Sx [S]/[P]
P