Cromatografía

1
Fase estacionaria

2 Fase móvil
º

º
• Descubierto por el botánico ruso Mikhail
Tswett (1872-1919)
 INTRODUCCIÓN A LA CROMATOGRAFÍA
Definición
Principios básicos
Flujo de fase móvil
Definición
to
“Técnica que permite separar
los componentes de una
A B
muestra debido a su diferente t1
afinidad entre dos fases
inmiscibles entre sí, una
A B
estacionaria (líquida o sólida) y t2
otra móvil (gas o líquida)”
La muestra se introduce en la fase móvil y es transportada a
lo largo de la columna que contiene una fase estacionaria
distribuida.
Las especies de la muestra experimentan interacciones
repetidas (repartos) entre la fase móvil y la fase estacionaria.
Cuando ambas fases se han escogido de forma adecuada, los
componentes de la muestra se separan gradualmente en
bandas en la fase móvil.
Los componentes abandonan la columna en orden creciente
de interacción con la fase estacionaria.
La amplia gama de selección de materiales para la fase
móvil y la estacionaria permite separar moléculas que difieren
muy poco en sus propiedades físicas y químicas.
 TIPOS DE CROMATOGRAFIA

 Según el soporte utilizado

En capa fina: el soporte es una placa de vidrio, aluminio o

plástico.

En columna: utiliza como soporte una columna.

En papel: Utiliza papel (celulosa) como fase estacionaria

no soportada.
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA
CROMATOGRAFIA EN COLUMNA
 • Clasificación de los métodos cromatográficos

Cromatografía

Cromatografía de gases Cromatografía de líquidos

Gas –Líquido Gas –Sólido Líquido –Líquido Líquido –Sólido Intercambio Exclusión
iónico
GLC GSC LLC LSC EC
IEC
CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN
• Cromatografía de reparto

El soluto se disuelve en la
fase líquida con que está CROMATOGRAFIA DE
recubierta el soporte REPARTO O PARTICIÓN
sólido
Fase estacionaria:
Líquido sostenido o
adsorbido en un sólido inerte.

Fase móvil:
Líquido (CLL)
Gas (CLG)

Nota: Los líquidos de las 2 fases

deben ser inmiscibles entre sí.

12
• Cromatografía de intercambio iónico

Los aniones móviles

permanecen cerca de los
cationes que están
covalentemente unidos a la
fase estacionaria

Resina catiónica, que solo

fija aniones.
CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN
CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
El CROMATOGRAMA
Flujo de fase móvil Señal

to to

A B
t1 t1

A B
t2
t2

A B
tB tB

A
tA tA
tiempo
16
 ASPECTOS FÍSICOS DE LA
CROMATOGRAFÍA

 Constante de Reparto
 ASPECTOS FÍSICOS DE LA
CROMATOGRAFÍA

Tiempo de retención
 Velocidad promedio de migración

De la fase móvil

Del analito
 ASPECTOS FÍSICOS DE LA
CROMATOGRAFÍA
Señal

to
k´ : Factor de capacidad
(índice de retención)
tr – tm Vr – V m
k´= tm = Vm

Donde tm es el tiempo de retención de

un compuesto que no interaccionara con
la fase estacionaria y tr es el tiempo de
retención del compuesto de interés. Lo tB
mismo se puede expresar en relación con
Los volúmenes de retención.
tA 20
tiempo
 Velocidad promedio de migración
 Factor de Capacidad o Índice de Retención
 Factor de Selectividad (Retención Relativa)

k′B es el factor de capacidad del

compuesto B, que es el mas retenido
y k′A es el factor de capacidad del
compuesto A, que es el menos
retenido
Ej:
Eficacia de la separación
Diferencia de tiempos de elución de los respectivos picos,
cuanto más distantes sean mejor.
Anchura de los picos, cuanto más anchos sean los picos,
peor la separación.

25
Medición de la anchura de una banda o
señal

26
 Resolución de picos gaussianos de igual
área y amplitud.
Resolución = 0.75
Resolución = 0.50

Señal
Señal

tiempo
tiempo
Resolución = 1.00 Resolución = 1.50
Señal

Señal

tiempo tiempo
27
 Coeficiente de Difusión
Mide la velocidad a que se mueve al azar una sustancia
desde una región de mayor concentración a otra de menor
concentración.

Altura de Plato
Es la constante de propocionalidad entre la varianza(de
la banda y la distancia que ha recorrido (x).Cuanto más
pequeña es la altura de un plato, más estrecha es la banda y
mayor eficacia se obtiene.

28
 Eficiencia de columna

29
Resolución de Columna

30
Ecuación de Altura de Plato
(Ecuación de van Deemter)

31
32
 APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFIA

•Análisis Cualitativo: puede dar una amplia

información si se escoge el sistema de detección
adecuado para determinar y evaluar los analitos
separados (IR, RMN, SM).
 APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFIA

•Análisis Cuantitativo: se basa en la comparación

de la altura, o del área, del pico del analito con la de
uno o más patrones inyectados bajo las mismas
condiciones cromatográficas.

•Métodos: Calibración Absoluta, Estándar Interno y

Normalización de Área.
• Calibración absoluta
Se inyecta masas exactas del componente puro
y se determina el área del pico. Se realiza un
gráfico relacionando el área de pico con la
masa.
• Las desventajas son que la inyección de la
muestra debe ser exacta.

• Las condiciones del sistema no deben

cambiar de una inyección a la otra.

• Las inyecciones exactas se logran mas con

un sistema automatizado de inyección o con
el uso de válvulas.
• Método del estándar interno
Este método es conocido como calibración relativa o
indirecta. Relación de masas conocidas de un patrón de la
muestra y de un estándar deber ser preparadas e
inyectadas.
• La ventaja de este método es que es
independiente del volumen de inyección de
muestra, lo que es importante para aquellas
técnicas cromatográficas que utilizan un método
de introducción de muestra no automatizado como
por ejemplo el uso de jeringas de inyección en CG
Requerimientos para un buen estándar
interno:
• Debe ser resuelto de los otros picos
• Debe eluir cercano al pico de interés
• Debe usarse una concentración similar al
pico de interés.
• Debe ser de las mismas características
estructurales.
• Normalización de área
Es un medio para establecer el porcentaje de
cada componente en la muestra.