HPLC

High Pressure Liquid Chromatography High Performance Liquid Chromatography Cromatografa Liquida de alta resolucin Cromatografa Liquida de alta eficiencia
Adsorcin Reparto o particin Intercambio inico Permeacin o Filtracin en Gel

Mecanismos de separacin en cromatografa lquida:

C. C. C. C. Lquido- Slido Lquido-Lquido (C. Fase ligada) Intercambio inico Exclusin

Presin

Presin = Fuerza Area

1000 psi 70 bar, 100 bar = 1450 psi En unidades SI: 1 Mpa = 145 psi
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FASE MVIL
Funcin: Disuelve y transporta a los analitos desde el inyector hacia la columna y el detector. Caractersticas: Alta Pureza (solvente grado HPLC) Filtrada (libre de partculas) Desgasificada Libre de Cloruros (en caso de tener contacto con acero inoxidable) Baja reactividad Alto poder disolvente de la muestra Baja viscosidad menor cada de presin Compatible con el detector Composicin: Depender de la naturaleza de los analitos a separar, de la fase estacionaria y del mecanismo de separacin a usar.

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Bombas para HPLC

Funcin: Impulsar la Fase Mvil hacia la columna y detector Caractersticas Generales: Generan altas presiones Flujo con bajas pulsaciones Amplio intervalo de caudales Buena reproducibilidad en el control del flujo No corroerse Precaucin: Evitar depsito de sales, partculas y microorganismos en vlvulas y sellos de bombas Esquema general de una bomba
Amortiguador de pulso

Flujo
1mL/min

Presin
1200 psi

Al inyector

Filtro

Purga

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Bombas segn principio de funcionamiento: o Alternantes o De Jeringa o Neumticas De 1 pistn De 2 pistones En serie Paralelos

Bomba Alternante de 1 Pistn

Pistn Vlvulas flujo unidireccional

Vlvula flujo unidireccional

ABIERTA CERRADA

Flujo Fase mvil

Flujo Fase mvil

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Sistema de Gradiente de Fase Mvil (opcional)

Funcin:
Variar la composicin de la Fase Mvil durante la Separacin Cromatogrfica. Permite variar factor de retencin durante la Cromatografa Contrarresta ensanchamiento de peak

Vlvula Al inyector Mezclador Bomba

Al inyector Mezclador Bombas

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Vlvula de inyeccin
Funcin: Introducir la muestra a una corriente de un lquido a alta presin Caractersticas: Posee dos posiciones: carga inyeccin Posee un bucle o loop para depositar la muestra Soporta alta presin La jeringa con la cual se introduce la muestra a la vlvula debe ser de punta roma

Fase mvil

Fase mvil

Columna

Columna

Muestra

Carga

Inyeccin
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COLUMNAS PARA HPLC

Caractersticas generales: Contienen la fase estacionaria, a la cual se unen reversiblemente los analitos. Materiales: acero inoxidable, vidrio o PEEK Columnas Analticas: Largo:5-30 cm Dimetro interno: 1- 4,6 mm Tamao de partculas: 3-10 m Como cuidar una columna ? Almacenarla en un solvente apropiado y tapadas Que en su almacenamiento no precipiten sales ni crezcan microorganismos No exceder su lmite de presin (ver especificaciones del fabricante) Utilizar agua y solventes puros (grado HPLC) Incrementar gradualmente el flujo (evitar cambios de presiones) Usar pre-columnas como proteccin de columna

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Cmo son las partculas dentro de la columna? Material irregular

Material esfrico

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Efecto de la forma y tamao de partcula sobre eficiencia

HEPT= A +B/ +C*

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CROMATOGRAFA EN FASE NORMAL F. Mvil F. Estacionaria O Si-OH CH3-C-CH3 > polaridad > poder eluyente NH2-R >polaridad >retencin Muestra

Mecanismo: Adsorcin Nombre: cromatografa en fase NORMAL Fases estacionarias: Gel de slice Almina Fases enlazadas: Amino: -NH2 Ciano: -CN Diol: -OH

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CROMATOGRAFA EN FASE INVERSA

F. Estacionaria F. Mvil Muestra

Si-O-R H2O/CH3-OH < polaridad > poder eluyente <polaridad >retencin

Mecanismo: Reparto o particin Nombre: cromatografa en fase INVERSA

Fases enlazadas apolares: Dimetilsilil (C2, RP-2) Octilsilil (C8, RP-8) Octadecilsilil (C18, RP-18, ODS) Si O-CH3 O-CH3 O-(CH2)7-CH3

Si

Si

O-(CH2)17-CH3

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SERIE ELUTROPICA DE SOLVENTES USADOS COMO COMPONENTES DE FASES MOVILES EN HPLC

Solvente Polaridad Viscosidad Indice refracc. Corte UV Pto. ebull Dipolo Acidez Basicidad

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Comparacin de las caractersticas de retencin en funcin del largo de la cadena aliftica

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Uracilo Fenol Acetofenona Nitrobenceno Metilbenzoato Tolueno

Fase Mvil: MeOH/H2O 50: 50 a 1 ml/min Dim. Partc: 5m

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Efecto del cambio Fase Mvil en Cromatografa en Fase Inversa Columna: C-18 a) Cambio de proporcin de componentes Efecto sobre k : Factor de Retencin

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Efecto del cambio Fase Mvil en Cromatografa en Fase Inversa Columna: C-18 b) Cambio de composicin Efecto sobre : Factor de Separacin

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Efecto del cambio de composicin y proporcin de fase mvil sobre la retencin y separacin
Columna: Fase inversa C-18
Metanol:7.5% Tetrahidrofurano:42.5% Agua:50%

Metanol:31.8% Tetrahidrofurano:21.2% Agua:47%

Metanol:0% Tetrahidrofurano:35% Agua:65%

Metanol:10% Tetrahidrofurano:25% Agua:65%

Metanol:4.5% Tetrahidrofurano:25.5% Agua:70%

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EFECTO DEL CAMBIO DE COMPOSICIN DE FASE MVIL DURANTE LA SEPARACIN CROMATOGRFICA (GRADIENTE DE FASE MVIL)

Isocrtica: 90 % Metanol

Gradiente de FM: Cambi de 70 % a 100 % de metanol duran

Cambio brusco de composicin de FM: 70 % metanol a 100 %

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TUBERIAS Y UNIONES EN HPLC

Deben minimizarse los volmenes muertos en todo el trayecto de los analitos en el sistema cromatogrfico. Para ello se debe: Usar tubos con dimetro interno pequeo, no ms largos de lo necesario (V = r2 . l) Usar uniones de volumen interno pequeo Emplear en cada caso distancia apropiada entre el . inicio del tubo y el cono

Tubo

Tuerca

Cabeza de Columna o Unin

Cono Distancia Crtica

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DETECTORES DE HPLC
Caractersticas deseables:
Alta sensibilidad Bajo ruido de fondo y deriva Estabilidad y reproducibilidad Amplio intervalo de respuesta lineal Corto tiempo de respuesta Volumen pequeo de la celda de flujo Insensible a cambios de Temperatura, flujo y presin Fcil operacin

Efecto del volumen de la celda de flujo

Control 8 L Celda 8 L (en serie)

Celda 100 L (en serie)

400 L
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Detectores ms utilizados en HPLC:

Absorciomtrico UV-VIS: + usado Fluorimtrico: + sensible Refractomtrico Diferencial: + universal Conductimtrico: slo para iones Electroqumico: slo para comp. oxidables Espectrmetro de masa: > poder confirmatorio
de identidad

Para mejorar detectabilidad de analitos:

Derivatizacin Pre-concentracin

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DETECTORES ABSORCIOMETRICOS UV-VIS PARA HPLC TIPOS: Fotomtrico ( fija) Espectrofotomtrico ( variable) Espectrofotomtrico de fila de dodos ( simultnea) REQUISITOS: Volumen interno pequeo (Microlitros) (para no producir ensanchamiento de peak) Espesor de paso ptico grande (alta sensibilidad)

Cubeta de Flujo

Ley de Lamber Beer (LLB)

A= abc
Concentracin Absorbancia Constante Espesor de paso ptico

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DETECTOR FOTOMETRICO UV VIS DE LONGITUD DE ONDA FIJA

Celda de medida Lente Entrada eluato Filtro

Lmpara

Fotodiodo

Ranura Celda de referencia

Ventanilla

CARACTERISTICAS : Permite medir slo a para las que hay filtros Generalmente viene con lmpara de Hg, la cual emite espectro de lneas a 254 y 366 nm Detector econmico de rutina, preferentemente a 254 nm Mayora compuestos orgnicos que absorben UV, lo hacen a 254 nm, pero no presentan mxima absorbancia a esa sensibilidad moderada
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DETECTOR ESPECTROFOTOMETRICO UV VIS DE LONGITUD DE ONDA VARIABLE

De la columna

Incidencia de la del Detector sobre la Selectividad

Al desecho
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Detector Espectrofotomtrico de Fila de Fotododos

Lmpara deuterio Obturador Fila de Diodos Filtro Ox. Holmio Lente

Celda de Flujo

Red Difraccin

CARACTERISTICAS :
Permite medir en todo un rango de SIMULTANEAMENTE. Permite obtener ESPECTROS de cada peak sin detener flujo de fase mvil. Permite verificar pureza de peak (si en un peak eluye un slo compuesto y si coincide con el espectro del patrn) Permite cuantificar CADA componente a su ptima
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Espectrocromatogramas con Detector de Fila de Diodos

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DETECTOR FLUORIMETRICO

Fotodiodo

Filtro Emisin

Filtro Excitacin Lmpara

Celda

CARACTERISTICAS : Muy alta sensibilidad, si los analitos o sus derivados son fluorescentes Selectivo para compuestos fluorescentes Componentes fases mviles deben ser especialmente puros Seleccionadores pueden ser filtros y/o monocromadores Debe optimizarse de Excitacin y de Emisin
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Qu cromatografa, lquida o gaseosa? Debemos considerar: Naturaleza de la muestra Equipamiento disponible Costo de operacin Nivel de concentracin*
Cromatografa de gas Aplicable a Muestras o sus derivados volatiles y que sean termicamente estables (bajo PM) Costo de operacin ms bajo Mas sensible Mayor resolucin (columnas capilares)* Cromatografa lquida Aplicacin ms amplia Gran variabilidad en fases mviles Poca variabilidad en fases estacionarias Menos sensibilidad Mayor costo de operacin (solventes)
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