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SEMANA 01: TECNICAS DE DIAGNÓSTICO PARASITOLOGICO

Recobrar, identificar y demostrar el parásito, para poder determinar la etiología del


proceso de infección o enfermedad.
a. Métodos directos: Identificar parásitos o sus productos de reproducción
- Baermann - extrae larvas.
- Flotación de Sheather - concentra ooquistes de algunos apicomplexa
- Raspado de úlcera cutánea - evidencia amastigotes de Leishmania
- Lavado bronquial - demuestra estadios de Pneumocystis carinii en algunas situaciones
de inmunocompromiso

b. Métodos indirectos: Obtener con pruebas serológicas y de otro tipo resultados


que, unido a la clínica y a otras consideraciones, dan un diagnóstico problable
- Inmunológicos - hemaglutinación indirecta para tripanosomiasis americana
- Inmunohistoquímicos - microsporidiosis
- Rayos X de abdomen para visualizar cambios en diagnóstico de angiostrongilosis
abdominal
- "Tomografia axial computarizada - neurocisticercosis
- Resonancia magnética - absceso hepático amebiano - Péptidos sintéticos, otra
tecnología biomolecular-diferenciar Trypanosoma cruzi de T. rangeli

Solicitud de exámenes (situación clínica) dependerá:


- Tipo de población
- Personal técnico disponible
- Metodología disponible
- Costos
- Relevancia clínica de los resultados

Base indispensable de conocimiento para solicitud de exámenes:


- Ciclo de vida de los parásitos locales
- Habitat en el hospedero, usual y ectópica
- Manifestaciones clínicas más específicas o probables
- Maneras de transmisión

1. EXAMEN DIRECTO
Se busca en muestras frescas, la presencia de formas evolutivas de parásitos de tamaño
microscópico sean estos trofozoítos, quistes de protozoos: Entamoeba histolytica,
Giardia intestinalis, Balantidium coli, etc.; así como larvas (Strongyloides stercoralis), o
huevos de helmintos: Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Hymenolepis nana,
Taenia sp., Fasciola hepatica, etc.).
Elementos normales: En un examen microscópico suelen encontrarse como elementos
normales estructuras reconocibles y otras no, fruto de la ingestión de alimentos. Las
más frecuentes son: Fibras vegetales, Cristales de oxalato de calcio,Granos de almidón,
esporas de hongos, fosfato amónico–magnesio, granos de polen, fibras musculares lisas,
fibras musculares estriadas, cristales de ácidos grasos, grasa neutra, abundantes
bacteria.

A) en solución salina fisiológica Reconocer trofozoítos de protozoos y otros estadios de


diagnóstico de helmintos y protozoos y elementos que aparecen en situaciones
anormales. Es el mejor método para detectar trofozoítos en una amebiasis invasora por
Entamoeba histolityca. Para ejecutar cuenta de huevos de algunos helmintos para
estimar intensidad de la infección.
b) en solución de Lugol Colorear en forma temporal trofozoítos y quistes de protozoos.
Inmovilizar larvas

MATERIALES
 Muestras de heces frescas/fijadas en formol 10%
 Lámina portaobjeto y laminilla cubreobjeto.
 Mondadientes
 Guantes y mascarillas
 Suero fisiológico (SF) 0.85%
 Lugol
 Papel lente
 Frasco con desinfectante para descartar material (clorox, fenol)
 Microscopio

PROCEDIMIENTO

1. Recolecte la muestra de heces en un envase limpio y tápela. Asegúrese de no


mezclar papel higiénico u orina con la muestra.
2. Transporte la muestra hasta el laboratorio a temperatura ambiente.
3. Coloque una gota de salina en una lámina portaobjeto.
4. Añada una cantidad pequeña de muestra de heces utilizando un aplicador de
madera y mézclela con la solución salina. Proceda igual agregando lugol.
5. Sitúe un cubreobjetos sobre la muestra y examine bajo el microscopio (10X ó
40X).
6. Evalué la muestra y determine si hay parásitos presentes. El diagnóstico
definitivo se logra demostrando la presencia de parásitos. En algunas ocasiones
es necesario hacer exámenes repetidos en días consecutivos antes de establecer
que la muestra está negativa.
Observar con atención las formas, recordando que los quistes y trofozoítos de los
protozoarios se observan en forma natural en el lado sin colorear (solución salina o de
cloruro de sodio).
Las estructuras internas (núcleos, vacuolas, etc.) se observan en las tinciones con
solución yodurada de lugol.

CAUSAS DE ERROR O RESULTADOS POCO SATISFACTORIOS:

CONTROL DE CALIDAD:

2. METODOS DE CONCENTRACIÓN
Este método permite concentrar quistes de protozoarios, larvas y huevos de helmintos
contenidos en las heces, para obtener una mayor cantidad de parasitos mediante
centrifugación, sedimentación o flotación.

El método de concentración hace posible que se detecten parásitos que están presentes
en escaso número. ♦ Este método se basa en el peso específico de los quistes o huevos.
♦ En este método de concentración de parásitos no se encuentran formas móviles de
protozoarios.

A. METODOS DE FLOTACIÓN
Técnica de Willis
Este método se basa en la propiedad que tiene algunos quistes de protozoarios y huevos
de helmintos de flotar en la superficie de una solución saturada de cloruro de sodio
debido a su menor densidad.
Material
1. Muestra de heces fresca.
2. Tubo de ensayo y gradillas
3. Lámina portaobjeto y cubreobjeto.
4. Guantes y mascarillas
5. Solución saturada de Cloruro de sodio (NaCl)
6. Frasco con desinfectante para descartar material (clorox, fenol, lugol)
7. Lugol.
8. Microscopio de luz.

PROCEDIMIENTO
Colocar en un tubo de prueba uno o dos gramos de heces. Añadir 4 ml de solución
saturada de NaCl. Emulsionar con una bagueta y completar con la misma solución el
tubo hasta que en el borde se forme un menisco, déjelo reposar durante 20 minutos.
Se toma la muestra cubriendo el tubo con un cubreobjeto, en él se adhieren los
protozoarios. Hacer una observación microscópica de la muestra en una lámina con
lugol.
VENTAJAS Y DESVENTAJAS

B. MÉTODO DE CENTRIFUGACIÓN Y FLOTACIÓN


Técnica de Faust modificada
Se basa en que los quistes y/o huevos de los parásitos flotan en la superficie por ser de
menor densidad que el sulfato de zinc a 33,3%, cuya densidad es 1180. Es útil para la
búsqueda de quistes y/o huevos de parásitos y excepcionalmente se observan larvas. Se
recomienda controlar la densidad del sulfato de zinc y usar agua filtrada para el lavado
previo de la muestra.
Materiales
 Tubo de ensayo 13 x 100 mm
 Gradillas
 Sulfato de Zinc USP 33,3 g
 Agua destilada tibia 100 ml
 Muestra de heces frescas
 Guantes y mascarillas
 Frasco con desinfectante para descartar material (clorox, fenol, lugol)
 Lugol
 Microscopio de luz

Procedimiento
1. Preparar una suspensión fecal en un tubo de prueba, completar el volumen a 10
ml con agua destilada.
2. Centrifugar a 2500 RPM durante un minuto y decantar el sobrenadante; repetir
el procedimiento anterior tres veces (hasta que el sobrenadante este claro).
3. Agregar la solución de sulfato de zinc 2 ml, mezclar bien y completar con la
misma solución.
4. Centrifugar a 2500 RPM.
5. Luego con un asa de platino tomar una o dos asadas del material flotante
(superficie) y colocarlo una lámina portaobjeto.
….. Colocar el tubo centrifugado en una gradilla, llenándolo con el sulfato de
zinc hasta el borde del tubo y colocar encima un cubreobjetos, dejar en reposo
por 15 minutos.
6. Agregar una gota de lugol y cubrir la preparación con una laminilla cubreobjeto
7. Observar al microscopio.

CAUSAS DE ERROR O RESULTADOS POCO SATISFACTORIOS:


C) MÉTODO DE CONCENTRACIÓN: RITCHIE
Se basa en la concentración de quistes y huevos por sedimentación mediante la
centrifugación, con ayuda de formol (fijador) y éter (disuelve las grasas de las heces)
para separar y visualizar los elementos parasitarios.
Procedimiento:
1. Se mezcla 1 g de heces con 8 ml. de solución salina en un tubo. Homogenizar.
Centrifugar a 2000 RPM (revoluciones por minuto) por 2-3 minutos y decantar (repetir
2 veces, hasta que el sobrenadante este claro).
2. Decantar el sobrenadante y agregar al sedimento 6 ml. de formol al 10%.
Homogenizar. Reposar 5 minutos.
3. Luego se agrega 3 ml. de éter sulfúrico y se agita con cuidado (usar un tapón).
4. Centrifugar 3 min. a 3000 RPM.
5. Se rompe la capa de detritus y se decanta.
6. Se toma una gota del sedimento y se prepara el examen directo con lugol.

3. TÉCNICA DE GRAHAM
Se usa para la búsqueda de huevos de Enterobius vermicularis y consiste en aplicar el
lado adhesivo de un pedazo de cinta sobre el área peri anal, despegar el mismo y volver
a pegarlo sobre la lámina portaobjeto.
En el laboratorio, se desprende la cinta engomada del frotis peri anal por un extremo,
se agrega solución de tolueno, hidróxido de sodio 2% o solución salina, aplicando 1 ó 2
gotas de la sustancia elegida que clarificará la muestra y que permitirá una mejor
observación de los huevos y/o adultos de E. vermicularis.

4) COLORACIÓN PERMANENTE CON HEMATOXILINA FÉRRICA DE HEIDENHAIN


PROPÓSITO: Método clásico para colorear e identificar estadios de protozoos comunes
en heces del humano, sobretodo cuando sólo hay trofozoítos y las infecciones son
mixtas. Las descripciones en los libros sobre la morfología y características de cada
estadio y de cada especie están basadas en organismos coloreados por este método.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS:

5. METODOS DIAGNOSTICOS DE HEMO E HISTOPARASITOS

Después de las heces, la sangre es la muestra más estudiada. La presencia de parásitos


puede no ser constante. Los métodos “estándar” más empleados son: Extensión fina y
preparación de gota gruesa. Otras posibilidades: Extensión en fresco, Movilidad
(Trypanosomas). Familiarizar al estudiante con las diferentes técnicas de detección
directa para el diagnóstico de hemo e histoparásitos.
MÉTODOS DE EXAMENES PARA INVESTIGACIÓN DE PARÁSITOS HEMÁTICOS
Para estos exámenes se utiliza sangre extraída del pulpejo del dedo o de la vena en
este caso se debe utilizar con anticoagulante y las preparaciones pueden ser hechas en
extensión o frotis en gota gruesa.
Frotis
 Se prepara de modo que las células sanguíneas se dispongan planas sobre la
superficie del vidrio.
 Se pretende que las células no se amontonen, que su espesor no supere una célula.
 Todos los elementos quedan un poco aplanados (tamaño).
 Las proteínas séricas (incluyendo la hemoglobina) deben fijarse previamente
 Estas preparaciones son muy útiles para estudiar detalles de hematíes y parásitos
sanguíneos.
 Principal limitación: Escasa cantidad de sangre estudiada.

Gota gruesa
 Contiene entre 6-20 veces más cantidad de sangre que la extensión.
 Se extiende sobre un área de aproximadamente 15 x 12 mm.
 No se fija antes de la tinción.
 Se somete a un tratamiento de deshemoglobinización.
 La rotura de los hematíes y la pérdida de su hemoglobina permite la observación
microscópica de otras estructuras, incluyendo parásitos.
 Resulta útil para diagnóstico rápido de parasitemias leves.
 No es muy adecuado para estudios morfológicos finos.

Importante:
 Portaobjetos limpios y bien desengrasados.
 Sangre fresca.
 Punción dedo.
 Punción lóbulo de la oreja.
 Punción venosa: Realización inmediata.
 Realización extensión.
 Secado al aire Eventualmente estufa 37º C.
 Fijación (previa a tinción) o no.
SEMANA 02: PROTOZOOS INTESTINALES

INTRODUCCIÓN
Los parásitos intestinales se identifican por sus características morfológicas en los
análisis de laboratorio de la materia fecal, mediante observación microscópica en
montajes húmedos con solución salina o con solución de lugol como colorante.
También se pueden hacer extendidos para realizar posteriormente coloraciones
permanentes, como la coloración de hematoxilina férrica o la coloración tricrómica de
Gomori, los cuales facilitan la identificación al revelar detalles estructurales no
detectable en los montajes húmedos.
En algunos casos se pueden tomar biopsias intestinales para identificar la patológica
producida por el parásito y observarlo en el tejido, en este caso se puede utilizar la
coloración de hematoxilina-eosina, que, aunque no es una coloración específica para
parásitos permite detectar algunos detalles del parásito buscado.
Los protozoos intestinales se presentan generalmente bajo tres formas de vida:
1. El trofozoito o forma vegetativa, que generalmente es el que produce la patología.
2. El quiste o forma de resistencia que desarrolla el parásito para poder sobrevivir en
condiciones adversas.
3. El prequiste que es una forma intermedia.

En el intestino humano se pueden encontrar protozoos patógenos y protozoos


comensales, su aparición puede deberse a factores como las condiciones de salubridad
e higiene y factores inmunológicos; su aparición, aunque no amerita tratamientos para
su erradicación, puede dar una idea de estas condiciones en los pacientes, por lo tanto,
en los análisis de laboratorio generalmente se informa su presencia.

MATERIAL
 Heces frescas/fijadas en formol 10%
 Láminas coloreadas con hematoxilina férrica, tricromica de Gomori de frotis de
heces
 Pipetas, baguetas, guantes, mascarilla
 Suero fisiológico 0.85% y lugol
 Aceite de inmersión, láminas portaobjeto y laminillas cubreobjeto
 Frasco con desinfectante para descartar material (clorox, fenol, lugol)
 Microscopio de luz
 Papel lente
CARACTERÍSTICAS DE ALGUNOS PARÁSITOS INTESTINALES
Entamoeba coli:
Se ubica en el ciego y colon y su incidencia es muy alta. Trofozoíto de 15-50 μm. Rango
usual 20-25 μm. Coloreado con hematoxilina férrica: citoplasma granular indiferenciado.
Bacterias en las vacuolas alimenticias.
Diagnóstico: núcleo con aglomeraciones irregulares de cromatina periférica, con
cariosoma grande y de posición excéntrica. Quiste: De 10-35 μm. Rango usual de 12-15
μm. Redondeados u ovales con doble envoltura. Ocho núcleos como máximo, visibles
fácilmente.
En los quistes inmaduros se observan los cuerpos cromidiales en forma de aguja y haces
de extremos irregulares. Vacuolas de glicógeno e color caoba al teñirse con lugol.

Entamoeba histolytica
Trofozoíto: viven en el intestino grueso del ser humano pudiendo invadir y atravesar la
mucosa intestinal. Mide de 15 a 30 μm. El trofozoíto ameboideo con membrana
citoplasmática, un citoplasma dividido en una parte externa hialina y transparente casi
sin granulaciones (ectoplasma) y otra interna muy granulada con orgánulos celulares
(endoplasma). El núcleo es esférico y con cromatina muy pequeña en el centro
(puntiforme), llamado cariosoma. Además presenta cromatina adherida a la cara interna
de la membrana nuclear, distribuida en forma más o menos homogénea.

Quiste: forma de resistencia, se eliminan al exterior con las heces. El quiste maduro
tetranucleado es la forma infectante y mide de 10 a 20 μm de diámetro. Los estadios de
prequiste con 1-2 núcleos con las características nucleares descritas en la forma
vegetativa y cuerpos cromidiales con extremos romos.

Giardia intestinalis
Se localiza en el duodeno.
Trofozoíto mide 10-20 μm. Es periforme de simetría bilateral con dos núcleos ovales y
cuatro pares de flagelos, dos axóstilos y dos cuerpos parabasales y un disco suctorio.
Quiste mide 8-19 μm (promedio 10-14 μm). Son ovoides que contienen 4 núcleos
pequeños, restos de flagelos y cuerpo parabasal, el citoplasma está claramente
separado de la pared quística.

Blastocystis hominis
Mide alrededor de 8-10 μm. Presenta gran vacuola central que ocupa el 50 a 95% de las
células y restringe el citoplasma a un espacio periférico que contiene los núcleos en
número de 2 a 5.