Microscopía Óptica y electrónica.

Técnicas de coloración.

Blga. María Leticia Amésquita Cárdenas

DEPARTAMENTO DE MORFOLOGÍA HUMANA

BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
 MICROSCOPÍA
conjunto

Métodos y técnicas
Observar objetos
aumenta

Imagen
Tres

elementos
Objeto
Sistema óptico
Fuente iluminación
Morfológicos Importante papel para Permite ver objetos
Bioquímicos evidenciar y distinguir a invisibles a simple
Fisiológicos mayor aumento detalles vista, la lente
Genéticos del objeto en estudio magnifica el objeto
 MICROSCOPIO
En siglo XVII, Leeuwenhoek, uso
microscopios simples: dos lupas
combinadas con 260 aumentos,
visualizó: protozoos, bacterias,
espermatozoides y glóbulos rojos
Mikrós=pequeño
Skopéoo=observar
1877 Abbe publica la teoría Calr Zeiss mejora la microscopía
del microscopio donde da de inmersión sustituyendo el agua
mejoras importantes a la por aceite de cedro lo que permite
óptica. obtener 2000 X.

SIMPLE COMPUESTO

Aumenta la imagen de
muestra de 10 a 15
veces. Para ello utiliza
una sola lente ocular
biconvexa montada en Se dice “compuesto” porque
un soporte que se compone la luz haciendo que
conecta con una atraviese dos o más lentes
columna afirmada a que aumentan la imagen.
una base o pie. Entre 100 y 1500 veces

Útil:
Disección, insectos, hongos, estructuras vegetales
 TIPOS DE MICROSCOPIOS
ÓPTICO ELECTRÓNICO
Luz clara, Campo oscuro, Contraste de Transmisión
fases, Luz polarizada , Fluorescencia Barrido
 MICROSCOPIO ÓPTICO LUZ CLARA
Consiste:
Hacer pasar luz visible de una fuente
(reflejada o refractada en sujeto de estudio) a través
de lentes ópticos múltiples, para lograr una vista
ampliada de la muestra

reflejada refractada
 COMPONENTE ÓPTICO
OBJETIVOS
Forma imagen real invertida
Lentes establece calidad de imagen en cuanto:
nitidez y capacidad para captar los detalles de
la misma (poder de resolución).
Caracteriza por:
Lentes convergente= convexas y divergente=
cóncava,
Elimina aberraciones afecta calidad imágenes.
.

Lentes dispuestos en soporte o

camiseta metal tiene inscrita serie
numéricas que indican
 CLASIFICACIÓN DE OBJETIVOS:
De acuerdo a:

1. Medio existente entre objeto examinado y lente frontal del objetivo.

Secos: entre objeto y objetivo = aire 10X, 20X y 40X

inmersión: entre objeto y lente frontal objetivo= aceite de inmersión 100X

2. Corrección a que se somete las lentes

(a) Acromático: corrigen rayos luminosos

azules y rojos hace coincidir un solo
plano focal.
(b) Semiapocromático o fluorita,
imágenes bordes nítidos. Corrige
esfericidad verde y azul, alta capacidad
trasmitir rayos onda corta en M.
fluorescencia.
(c) Apocromático: rayos azules, rojos y
verdes, en solo plano, obtiene imagen
de borde nítidos.
 Factores que aumentan la capacidad de los
objetivos para formar imágenes
Índice de refracción:
Angulo de apertura:
Capacidad de objetivo de captar los rayos luminosos refractados
cuando atraviesan medio transparente. A mayor ángulo, la lente
frontal del objetivo aceptará una mayor cantidad rayos

Velocidad de la luz en el aire

IR=
Velocidad de la luz en el medio

IR de: Agua = 1.3300

-Esquema muestra un objeto (1) que es atravesado por un
Aceite de inmersión = 1.5150
haz de rayos luminosos (2) los cuales son captados por el
Fluorita = 1.4340
objetivo (3) Al formarse el cono de luz proveniente del objeto
Vidrio (crown) = 1.5200
se determina un ángulo, también llamado de apertura, donde
α representa la mitad del mismo
Apertura numérica (AN):
Cifra a considerar para determinar el rendimiento lente
objetivo:
AN = n x sen a

Donde a = la mitad del ángulo de apertura del objetivo.

n = el índice de refracción del medio entre objeto
y objetivo.

Poder de resolución:
Calculado mediante la fórmula

Donde: delta= resolución expresada en micrómetros.

lambda = longitud de onda de la luz empleada.
Como la ANobj y la ANcond son iguales, resume
2AN.
Distancia focal: relación existente entre
longitud del tubo microscopio y
amplificación usada

Distancia de trabajo: espacio existente entre

el punto más bajo del objetivo y la muestra
 Nomenclatura de los objetivos
Posible identificar las propiedades de los objetivos

PROPIEDADES ESPECIALES
DIC = Interferencia de contraste diferencial
H = que puede emplearse en microscopios con platina caliente (heating stage)
 OCULARES
• Forma 2° imagen a partir de la imagen 1° del objetivo.
• Imagen es de mayor tamaño, virtual y derecha.
• Lente solo amplía número veces (5X,8X,10X,12X,15X) la imagen objetivo.

Clasificación:
Según disposición de lentes y diafragma, dentro del tubo
a) Oculares negativos de Hüygens:
Dos lentes plano convexos, superficie convexa hacia abajo. Entre ambos esta
diafragma anular, localizado plano focal de lentes. Al diafragma se puede
diafragma adherir puntero que suele ser elaborado por pestaña o pelo.

b) Oculares positivos o de Ramsden.

Dos lentes plano convexas, superficies curvas dirigidas hacia
adentro. El diafragma situado por debajo de lente; en el plano diafragma
donde se forma la imagen formada por objetivo.
 COMPONENTE MECANICO
Sistema de soporte Sistema de ajuste
Pinza

Tubo

Brazo
Platina
Escala

Sistema de enfoque

Píe
MACROMETRICO

MICROMETRICO
COMPONENTE DE ILUMINACIÓN:
Suele ser una lámpara
Fuente de luz halógena de
intensidad graduable
Condensador:
concentra la luz de la
lámpara en un punto
de la preparación

Filtro

Diafragma o iris
(está dentro del
condensador):si se
Interruptor y graduación
de la luz
cierra mejora el
Lámpara contraste, pero empeora
la resolución
 TIPOS DE MICROSCOPIA TRAYECTO
DE LA LUZ

b) Campo oscuro: usa condensador

especial con disco opaco que elimina
a) Campo claro: Trayecto de la luz
todo la luz en centro de haz. La única luz
iluminación producida por que llega a muestra incide en ángulo, así,
microscopio común. solo luz reflejada por muestra llega al
La iluminación brillante muestra las objetivo. Con microscopia de campo
estructuras internas y contorno de oscuro los bordes de célula son
brillantes, algunas estructuras internas
cubierta externa
brillan y cubierta externa es visible
Observar microorganimos vivos
MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA
Utiliza fuente de luz ultravioleta excitadora de los
fluorocromos con los que se tiñe la muestra a observar y
posee un filtro especial que permite el paso de luz
emitida por fluorocormo.
Detectar microbios en muestras de tejidos
Detecta sustancias autofluorescencia (vit.A)
Células teñidas con colorantes fluorescentes.

Evaluación del efecto de cloroquina en linfocitos

humanos, mediante el ensayo cometa

linfocitos cometizados
 MICROSCOPÍA DE LUZ POLARIZADA
Haz de luz en todas
direcciones ángulo
Ondas tienen el mismo
diferentes
ángulo y plano
Fotones en forma
Fotones igual dirección
aleatorea
Microscopios a los que se les añadido
dos polarizadores. 1 entre
condensador y muestra otro entre
muestra y observador
Polarizador es de cristal de cuarzo y
cristal de nicol entonces luz vibra en
un único plano = luz polarizada
Usa para identificar:
Sustancias cristalinas y fibrosas=
citoesqueleto
Sustancia amiloide, colágeno,
queratina .
 El microscopio electrónico de transmisión
(MET)

Es sobre todo una herramienta de investigación

Complicada para el uso rutinario de laboratorio.
Utiliza haz de electrones y lentes electromagnéticas
Crear imágenes de gran resolución y detalle como ultraestructura interna de las células
Resuelve estructuras menores de 0.2 um
Produce imágenes bidimensionales
 Partes principales de MET
Cañón de electrones: emite electrones
que atraviesan espécimen

Lentes magnéticas : crean

campos que dirigen y enfocan haz
de electrones

Bomba de alto vacío: electrones pueden ser

desviados por moléculas de aire, por lo que
se debe hacer vacío total en interior de
microscopio

Placa fotográfica o pantalla

fluorescente: registra imagen aumentada

Sistema de registro: muestra

imagen que producen los electrones
puede ser ordenador
 MICROSCOPIO ELECTRONICO DE BARRIDO

Utiliza haz de electrones para barrer el espécimen y producir la salida de electrones

secundarios, que son los que crean la imagen.
Usa para estudiar características superficie de célula
Resuelve estructuras menores de 0.2 um
Produce imágenes tridimensionales
PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA MICROSCOPIA
DE LUZ DE CAMPO CLARO

Muestra observar MO

Dividen en

Montura de Corte:
Montura completa:
de tejidos de plantas y
objeto intacto, vivo o muerto =
animales demasiado opacos
microorganismo, protozoario.
para examinarlos

Fiijación:
Más usados:
inmoviliza material macromolecular,
Químicos y Físicos
estructura celular mantiene estado vivo

Tinción:
colorantes ácidos y /o básicos
 FIJADORES
PROPIEDADES
MECANISMO DE ACCIÓN
1. Mata célula, evita autólisis
1. Coagulación de
proteínas (alcohol, ácido 2. Preserva morfología
pícrico, yodo, formol, etc.) celular, tisular y
2. Combinación química
con sustancias composición química
orgánicas de células o 3. Penetran a tejidos con
tejidos, (Ácido crómico,
bicromato de potasio de amonio) relativa rapidez
3. Forma precipitado fino
4. Facilita coloración
al contacto con
sustancias orgánicas 5. Evita putrefacción inhibe
(ácido ósmico, bicloruro de
mercurio) crecimiento microbiano
4. Por oxidación, (bicromato 6. Algunos de ellos colorean
de potasio)
sustancias de los tejidos
 TEORÍA DE LA COLORACIÓN
Coloración: técnica
para mejorar el contraste en la imagen vista al MO.

TEORIA FISICA TEORIA QUÍMICA

Penetración del colorante
es fenómeno osmótico y su
fijación a tejidos es
absorción
Combinación grupos cromógenos
colorante: (ácidos y básicos) con
moléculas ácidas o básicas de
componentes celulares.
De acuerdo

Colorantes unen a tejidos por enlace iónicos:

Colorante y la sustancia a teñir, desarrollan
diferentes cargas eléctricas y entonces se atraen.
Ejm.
Citoplasma: posee proteínas que tiene carga
eléctrica (+) y colorante tienen carga eléctrica (-)
 FACTORES EN LA COLORACIÓN

Tiempo: depende de pH: pH ácido favorece CC colorante: CC entre

espécimen y Temperatura: T° altas acción colorante ácido 0.2 y 2%. Se diluyen en
colorante, va de ↓ tiempo tinción por y pH básico la del H2O, alcohol a T°
segundos a 24 h. penetrar mas rápido colorante básico ambiente
 METODOS DE COLORACIÓN
VITALES SUPRAVITALES: material fijado

Colorante no provoca muerte Directa: aplicación directa a tejido a colorear

celular.
Tiñe estructuras vivas
Colorante empleado: azul de
metileno, rojo neutro, azul de
tripano.
Método se aplica in vivo o in vitro
Indirecta: previa a coloración se aplica mordiente
Progresiva: procesan varios cortes del mismo tipo con
tiempos diferentes
Regresiva: colorante se deja actuar hasta que sobretiña
para después decolorar con agua o alcohol acidulando
hasta obtener tinción adecuada
Pancromaticas: cuando en un solo colorante se obtienen
diferentes tonos en los diferentes componentes
celulares
Panóptica: realizada con colorantes neutros

Simple: colorean algunos elementos del preparado (núcleo, fibras elásticas, etc.).
Combinada: tiñen los elementos nucleares y citoplasmáticos recurriéndose, generalmente, al empleo sucesivo de
colores básicos y ácidos que contrastan por sus colores
 Sustancias confieren color a otros cuerpos.
Colorantes
Si es igual color que ellos (colorantes ortocromáticos), o color distinto (colorantes metacromáticos)

Características de los colorantes

Penetración: Entrada del colorante a la célula y a través del tejido
Inocuo: No debe producir alteraciones en las células ni en los componentes
del tejido a colorear.
Especificidad: Debe colorear ciertas estructuras celulares a través de uniones
fuertes.
1. Cromógeno: generador de color, sustancia matriz de donde se
deriva el colorante
Grupos químicas: 2. Cromóforo: portador de color, esta contenido en cromógeno
Color= -C=C- -NO2 -C=O -N=N - -N=O por dobles enlaces alternados.
3. Auxocrómo: ayuda al color, capaz de formar una sal con:
Ácido:-COOH, -OH, -SO3H
Base: -NHR, -NR2, -NH2
Tamaño (PM): Molécula colorante y su capacidad de rotación, de esto dependerá lo
fácil y rápido a penetrar a un tejido y por tanto a que componentes
celulares se unirá.
 Tipos de colorantes
COLORANTES NATURALES
Origen animal Origen vegetal
Carmín: o cochinilla: insecto coccus Hematoxilina: Extraído del árbol del
cacti, transforma en carmín por Campeche, sin poder colorante por si misma,
acción de sales metálicas (alumbre) se oxida fácilmente a hemateína. Es colorante
débilmente ácido

Orceína: (líquenes) incolora que al tratamiento

con amonio y aire se torna azul o violeta,
conocido como orcina compuesto fenólico:, la
formula es:
Usa para teñir fibras
elástica y cromosomas.
 COLORANTES ARTIFICIALES
modificación anillo bencénico por reemplazo
de 2 C por 1 H u otro átomo con doble
valencia = compuesto coloreado

Acidos: Básicos: Neutros: C. Indiferentes:

Sales con base incolora, Sales con base coloreada Sales con parte Compuestos no iónicos
ácida coloreada carga ácida incolora carga básica y ácida incapaces de disociación
negativa positiva electrónica son insolubles en
tiñe citoplasma y
colorante catiónico tiñe agua peso solubles en
Colorante aniónico, tiñe núcleo
núcleo solventes orgánicos
citoplasma wright, giemsa,
Azul de metileno, Sudan negro, sudan III,
Eosina, amarillo de leischman
hematoxilina, azul de sudan IV.
metilato, fucsina ácida,
naranja G, safranina toluidina, fucsina básica
 COLORACIÓN DE GRAM

BACILOS GRAM BACILOS GRAM

POSITIVOS NEGATIVOS

¿ Porque que algunas bacterias se tiñen de azul y otras de rosa o rojo?

TINCIONES DE USO FRECUENTE EN
MICROSCOPIA ÓPTICA
A. Tinción H:E Uréter ratón
núcleos color morado por
hematoxilina y tejido conjuntivo
color rosa por eosina

B. Tinción tricrómica de
Masson. Esófago de rata
epidermis en rojo, tejido
conjuntivo en azul y musculo
liso en pardo
C. Tinción técnica de PAS
demostrar hidratos de carbono
glicocalix y células
caliciformes aparecen teñidas

D. Método de Feulgen.
Demuestra ADN, solo núcleos
aparecen teñidos

E. Técnica rojo grasa.

Demuestra lípidos

F-H. técnica inmuhistoquímica.

Detecta actividad enzimática
fosfatasa ácida, ATP y NADPH
REFERENCIAS
Alberts, La célula
Paniagua, Biología celular
Ross, Histología
Cooper, La Célula
Pelczar, Microbiologia