ASIGNATURA : MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS

PROFESOR : OSVALDO TORRES M.

PRÁCTICO N 2

M I C R O S C O P I A Y TINCIÓN DE MICROORGANISMOS

I. OBJETIVOS.-

 Explicar el uso y manejo del microscopio.

 Identificar y describir las funciones de cada uno de los sistemas, partes y accesorios que
componen un microscopio.
 Realizar diversas observaciones utilizando adecuadamente el microscopio.

II. INTRODUCCIÓN

II.1. MICROSCOPIO

El ojo humano puede captar imágenes hasta el límite de 0,1 mm, de modo que si se desea
observar microorganismos, células y estructuras celulares, se debe recurrir al uso de lupas o
microscopios.

El microscopio puede definirse como un instrumento diseñado para amplificar las

imágenes visuales de objetos, que por su tamaño, son invisibles o confusos. Puede ser de tipo
simple, de una lente (lupas) o compuesto, de varias lentes.

Debido a que existen muchos tipos de microscopios, no se puede elegir un solo

microscopio que pueda representar a los diversos tipos existentes. Por tanto, lo que se describe a
continuación es una relación de los principios básicos de microscopía aplicados al microscopio de
luz, una descripción simple del microscopio compuesto y algunas definiciones y principios básicos
sobre variaciones del microscopio.
ASPECTOS ÓPTICOS

Refracción de la luz

Cuando los rayos luminosos pasan oblicuamente de un medio a otro, estos rayos se desvían
dependiendo del ángulo de entrada y de la diferencia de densidad óptica de los medios. A la
densidad óptica (DO) se le llama más apropiadamente índice de refracción, IR o n. Fig.1.

Fig.1. Refracción básica de la luz.

El paso perpendicular de rayos luminosos no produce desviación, pero al incidir en forma

oblicua, los rayos serán refractados hacia una línea imaginaria X---Y, la cual representa la
trayectoria que seguirían los rayos si entraran en forma perpendicular al cristal (normal). Al salir
del cristal, los rayos se refractan alejándose de la normal.

Este principio se emplea cuando se aplica aceite de inmersión a una muestra en el

portaobjeto. Fig.1.

Se produce refracción entre aire vidrio y vidrio aire (IR aire = 1; IR vidrio = 1,5),
pero si el aceite queda entre el objeto y la lente del objetivo, la trayectoria de los rayos luminosos
será corregida para obtener una mejor resolución.
Resolución.

Es la capacidad de una lente para revelar dos puntos muy cercanos entre sí como si
estuviesen separados y distintos, o bien, la capacidad para revelar detalles. También se le llama
poder de resolución. La mínima separación entre dos puntos pesquisables se llama límite de
resolución (LR) y es el inverso del poder de resolución (PR). La resolución depende de la longitud
de onda de la luz y de la abertura numérica de la lente.

Abertura numérica.

Es una constante óptica para toda lente y se refiere a la capacidad de ésta para juntar los
rayos de luz proyectados hacia ella. Se calcula como el producto del IR del medio fuera de la
lente (n) y el seno de la mitad del ángulo del cono de luz absorbido por el objetivo (u), por tanto,
aumenta con el diámetro de la lente:

AN = n x seno u

Cuando se reduce la profundidad de foco (distancia entre la lente y el objeto) la AN

aumenta. De allí que el objetivo de inmersión en aceite tiene una mayor abertura numérica y queda
muy cerca del objeto (una lente con mayor AN revela más detalles del objeto).

En el caso de usar objetivos de inmersión, n = 1,51 y si u = 58 se tiene que:

AN = 1,51 x seno 56
= 1,51 x 0,85
= 1,28

La resolución se calcula como:

longitud de onda
r = --------------------------------
AN objetivo + AN condensador

Si se utiliza un filtro verde con longitud de onda de 0,55 um, con AN objetivo de 1,25
(inmersión) y AN condensador de 0,9:

0,55
Resolución = ------------ = 0,255 um
1,25 + 0,9

Lo que implica que la mayor resolución obtenible en un microscopio de luz es no mayor

que 0,2 um, siendo éste el límite de resolución.
Foco.

Las lentes convexas o positivas concentran los rayos luminosos en un punto focal. Las
lentes cóncavas o negativas dispersan los rayos luminosos y su foco es infinito. Cuando se emplea
una lente convexa se generan dos puntos focales o planos focales, A y B, uno a cada lado de la
lente. Un objeto colocado en un plano, A o B, producirá una imagen clara en el otro plano, y sólo
allí. Es decir, un objeto colocado en A sólo estará en foco en B. Además, la imagen ha quedado
invertida

Amplificación.

Es el poder de aumento, que es la razón entre la imagen que el microscopio produce y el

tamaño del objeto observado.

Corresponde básicamente al producto del poder de amplificación del objetivo y del ocular.
Además, depende de la distancia focal del objetivo, de la longitud del tubo óptico y del prisma.
Cuando se emplea una cabeza binocular la amplificación se multiplica por 1,5.

Claridad de la imagen.

Aparte de ser necesaria la amplificación y resolución también se debe lograr claridad de la

imagen, la cuál está dada por la calidad de las lentes. Ocurren aberraciones con los lentes baratos.
Dos de estas aberraciones tienen mayor importancia, la aberración esférica y la cromática.

Cuando los rayos de luz llegan a la lente entran y salen por puntos diferentes y serán
refractados en diferente grado. De ahí que los rayos no converjan en un mismo punto. Este defecto
se conoce como aberración esférica y provoca el aspecto borroso de los bordes del campo visual.

Por otro lado, el defecto de la lente para hacer converger la luz blanca en un punto focal
central se denomina aberración cromática y se observa como una franja de color que rodea al
objeto en estudio.
COMPONENTES DEL MICROSCOPIO

El microscopio consta de los siguientes componentes (Fig.2 y 3)

Sistema mecánico

Pié, base o herradura: es la base de sustentación y debe colocarse sobre una superficie plana,
horizontal y sin vibraciones. Si hay que mover manualmente el instrumento, póngase una mano
sobre el brazo del instrumento y sopórtese con la otra la base.

Columna: articulación al pié y que sostiene al espejo, condensador, platina y tubo con el sistema
óptico de amplificación.

Platina: plataforma horizontal con un orificio central por donde pasan los rayos luminosos. En
ella se coloca la preparación que se afirma con las pinzas de la platina.

Tubo: es metálico, lleva en su extremo superior los oculares y en el inferior los objetivos. La
pared interior es negra para evitar la reflexión de los rayos luminosos. De su longitud depende el
aumento. Convencionalmente mide 160 mm.

Revólver o portaobjetivos: mecanismo situado en el extremo inferior del tubo. Por simple
rotación permite el cambio de los lentes objetivos.

Tornillos de enfoque: el desplazamiento perpendicular del tubo con respecto a la platina

(alejamiento o acercamiento) se realiza mediante dos tornillos: Macrométrico y Micrométrico;
mientras el primero permite el enfoque aproximado, el segundo sirve para el ajuste fino de la
imagen. Se mueven con ambas manos con intensidad de fuerza pareja.

Sistema de iluminación

Espejo: generalmente es doble, es decir presenta dos caras, una cóncava y una plana. Sirve para
reflejar la luz que proviene de la fuente luminosa lateral y así enfocarla a la preparación. En varios
microscopios el espejo no existe pues la fuente de luz está ubicada directamente bajo la platina.

Condensador: dispositivo formado por un sistema de lentes que concentra la luz que proviene de
la fuente luminosa. Condensa y enfoca la luz hacia la preparación. Normalmente se coloca cerca
del objeto, pero para preparaciones no teñidas conviene bajarlo para mejorar el contraste. El
condensador debe estar en línea con la fuente de luz y con los objetivos.

Diafragma iris: dispositivo bajo el condensador que guía y regula la cantidad de luz que llega a
éste.

Anillo portafiltros: sistema anexado también al condensador que permite interponer entre la
fuente de luz y el condensador, un filtro de color para obtener luz monocromática que mejora la
resolución.
Sistema óptico.-

Lentes objetivos: son varios lentes ubicados en el extremo inferior del tubo en el sistema de
revólver parafocal. Esto significa que cuando uno de los objetivos está enfocado todos los demás
también lo están. Producen el primer aumento de la imagen. Los objetivos están marcados con
números que indican características esenciales. El primer número, de mayor tamaño, corresponde
al poder de aumento de la lente; el número a continuación, fraccionario, indica la abertura
numérica respectiva.

Lentes oculares: Se ubican el la parte superior del tubo. Amplifican la imagen proyectada por
el objetivo a fin que pueda llegar aumentada al ojo del observador. El poder de aumento total del
micros copio es distinto para todas las combinaciones de objetivo y ocular.

TIPOS DE MICROSCOPIOS

Microscopio de campo luminoso (el observado en el esquema).

Microscopio de campo oscuro (ultramicroscopio).- En este tipo, la luz que habitualmente no

entraría en el objetivo es refractada por el objeto, el cual aparece iluminado contra un fondo
oscuro. Se utiliza en el examen de microorganismos en suspensión sin tinción.

Microscopio de luz ultravioleta.- La longitud de onda de la luz ultravioleta hace aumentar la

resolución, con aumentos dobles al del microscopio de campo claro. Se basa en que las sustancias
en muestras de células absorben de diferente manera la luz UV. La imagen es fotografiada en una
película sensible a la luz UV o es mostrada en un monitor.

Microscopio de contraste de fase.- Las células vivas se caracterizan porque las estructuras sólo
presentan ligeras diferencias en sus índices de refracción. El microscopio de luz es incapaz de
distinguir estas diferencias. Los rayos de luz, además de ser refractados son desacelerados, o sea,
la fase de la onda de luz sufre un cambio. En el m. de contraste, las mínimas diferencias de
refracción son convertidas en cambios de amplitud. En el actual m. de contraste, las variaciones de
los cambios de fase se convierten en cambios visibles de intensidad de luz por medio de un
sistema óptico especial.

Microscopio de fluorescencia.- En este tipo de m. el principio utilizado es el siguiente: ciertos

compuestos absorben energía luminosa de una cierta longitud de onda, por ej. En el ultravioleta, y
emiten luz de otra longitud, por ej. amarilla, denominándose fluorescencia a este fenómeno. Los
compuestos que interaccionan de esta forma con la luz se denominan fluorocromos o
fluorescentes, tales como la riboflavina. Algunas tinturas fluorescentes pueden usarse para teñir
bacterias, las que al ser iluminadas con luz UV, aparecen como objetos luminosos.

Microscopio electrónico.- El m. electrónico (M.E.) emplea electrones como fuente de radiación.

El haz de luz viaja principalmente a través del aire pero los electrones se desplazan el vacío. El
condensador del M.E. tiene dos electromagnetos que estrechan y concentran el campo
electromagnético. Se utilizan cortes ultradelgados del objeto los que se montan sobre rejillas
especiales. La imagen se forma porque el objeto dispersa el haz de electrones. Esta dispersión
provoca varios grados de excitación en una serie de proyectores, amplificadores, bobinas, etc.
hasta que finalmente se forma una imagen nítida en una pantalla fluorescente, pudiéndose insertar
una placa fotosensible para obtener una fotografía.

REGLAS PARA EL CUIDADO Y MANEJO CORRECTO DEL MICROSCOPIO

a) Se debe verificar que el microscopio esté asentado en una base sólida, horizontal y sin
vibraciones, y con sus elementos bien limpios, especialmente sus lentes, las cuales deben
ser humedecidas con xilol y secadas con papel de microscopía.

b) Colocar el espejo cóncavo frente a la fuente de luz y centrar el haz de luz; para ello
utilizar el objetivo de aumento mediano. Observar a través del ocular y mover el espejo
hasta obtener una iluminación nítida y uniforme. Graduar la iluminación con el diafragma.
Si el microscopio posee iluminación directa ajustar la intensidad con el potenciómetro,
pero nunca a su nivel máximo. Si el microscopio posee condensador, acercarlo a la platina.
En este momento está en condiciones de observar.

c) Colocar el portaobjetos con la muestra en la platina limpia; centrar en posición y separar

totalmente el objetivo menor de la preparación. Luego, moviendo los tornillos
macrométricos con ambas manos, mirar por el lado y acercar el lente de este objetivo a una
distancia mínima de la preparación. En este momento, mirando por el ocular, volver
lentamente el macrométrico hasta que aparezca la imagen en foco aproximado. Enseguida,
afinar la imagen con el micrométrico.

d) Cuando se usa objetivo de inmersión, agregar una gota discreta de aceite de inmersión
sobre la preparación. Una vez instalada la preparación la preparación en la platina, poner
en posición de observación el objetivo de inmersión y, mirando por fuera, mover el
macrométrico hasta que entre en contacto aceite y objetivo; observar por el ocular y ajustar
la imagen con el micrométrico.
RECOMENDACIONES

Si no se puede observar o no se obtiene nitidez, verificar los siguientes aspectos:

 Limpieza del ocular, objetivo, condensador y preparación.

 Iluminación suficiente.
 Objetivo bien centrado (debe sonar "clic" de ajuste).
 Preparación dentro del campo visual.
 Preparación con objeto hacia arriba.
 Preparación bien realizada (frotis adecuado, buena fijación, teñido suficiente, etc.).
 Condensador muy cerca de la preparación, especialmente si está muy tenue.

Una vez realizadas las observaciones se debe dejar limpio el microscopio, especialmente
lentes, platina, condensador y espejo.

II.2 TINCIONES

Observación de los microorganismos.

La mayoría de las células son demasiado pequeñas y translúcidas para ser detectadas por
el ojo humano, por lo que es esencial el uso del microscopio para la observación de la forma y
estructura de estas.

Factores de gran importancia:

- Para que el objeto sea percibido a través del microscopio, este debe de poseer cierto
grado de contraste con el medio circundante.
- El microscopio debe poseer un poder de resolución suficiente para permitir la
percepción, como objetos separados, de dos puntos adyacentes muy próximos en la
imagen.

Definición de colorante: sustancia química orgánica de naturaleza variable. Los colorantes

aumentan el contraste. El colorante consta de dos partes en su molécula:

- grupo cromóforo (confiere el color)

- grupo auxocromo (confiere su capacidad a comunicar el color a la estructura)

Clasificación de los colorantes:

a) En función del grado de ionización:

- ácidos: parte cargada negativamente o aniónica, tiñendo estructuras básicas. Son poco
utilizados en bacteriología (superficie cargada negativamente).

- básicos: parte cargada positivamente o catiónicos, tiñendo los ácidos.

 -neutros: generalmente sales de un colorante ácido y otro básico. Algunos son
liposolubles, por lo cual tienen inclusiones citoplasmáticas lipídicas (p. ej.:
Sudán III).
b) En función del origen:

- naturales.
- artificiales.

Definición de mordiente: sustancia química sin poder colorante, pero que actúa como sustancia
puente entre el colorante y la estructura a teñir, permitiendo su coloración. En otros, altera su
estructura celular, permitiendo su tinción (carga, estructura, permeabilidad, etc.). Los más
utilizados son: ácido fénico, ácido tánico y lugol (este último es una solución de yodo -
insoluble- con yoduro potásico -soluble-).
Preparación de un colorante: generalmente vienen preparados (en forma de polvo o cristales
a pulverizar), a los cuales solo hay que añadir agua, alcohol o ambos. Una vez disuelto se filtra
para quedar un líquido libre de precipitado y se guarda en un frasco ámbar (para que no se
altere).
Mecanismos de tinción:

a) Teorías químicas: complejo entre colorante y sustancia bacterianas.

b) Teorías físicas: procesos osmóticos, etc.

Lo más probable es que se deba al intercambio de iones entre el colorante y la estructura. P. ej.:
CB-Na+ + AM+Cl- -> CBAM + NaCl

(AM: colorante básico neutralizado por el Cl).

Preparado de tinción: los pasos a seguir son:
- Extensión o frotis:
a) Extensión de la preparación: consiste en hacer una fina capa de microorganismos. Con una
gota en el porta hacemos una extensión (pasando los microorganismos para que se "suspendan"
sobre el portaobjetos).

b) Frotis: se utiliza este término para tejidos (p. ej.: sangre) o esputos.
- Fijación: La fijación se utiliza para la desnaturalización de las proteínas del microorganismo,
y para que este queda adherido al cristal y mueran.
- Tinción: Una vez fijada la extensión, teñimos. Existen varios tipos de tinción, cada una de las
cuales tiene un "protocolo" a seguir.
Tipos de tinción: existen dos tipos, sirviéndonos del número de colorantes a emplear. Estos
son:
 - Tinciones sencillas o simples: interviene un solo colorante.
- Tinciones combinadas o complejas: intervienen dos o más colorantes. Entre los de este
tipo, los más normales son los dobles.
También podemos distinguir otros tipos de tinción, dependiendo del resultado obtenido (visión
de la muestra). Así distinguimos:
1. Tinción directa: consiste en una tinción por simple inmersión en el colorante.

2. Tinción indirecta: aquella en la que es necesario el uso de un mordiente.

3. Tinción diferencial: se denomina así porque es un procedimiento mediante el
cual no se tiñen del mismo modo todas las clases de células.
4. Tinción negativa: los microorganismos se quedan sin teñir, mientras que el
fondo aparece coloreado.
5. Tinción metacromática: al combinarse el colorante con la estructura a distinguir,
se produce un cambio en la molécula del colorante, apareciendo otro color.
6. Tinción por impregnación: precipita sales orgánicas sobre los microorganismos,
dándole contraste a la célula.
7. Tinción vital: se aplica colorante, pero sin fijación (para la observación de
células vivas).

Tinción de Gram.

La tinción Gram es una de las tinciones diferenciales más útiles en bacteriología,

incluyendo la bacteriología clínica. El efecto de la tinción diferencial se relaciona con
diferencias en la estructura de la pared celular de las bacterias. Para obtener resultados
confiables es importante considerar las siguientes precauciones:

 Los cultivos a teñir deben ser frescos – incubados en caldo o medio sólido hasta que el
crecimiento sea justo visible (no más de 12 a 18 horas de incubación en lo posible). Los
cultivos viejos de bacterias Gram positivas aparecen Gram negativos. Esto es bien cierto
para bacterias formadoras de esporas, como algunas especies del género Bacillus.

 Si es posible, los cultivos los cultivos a teñir deben haber crecido en un medio sin
azúcares. Varios organismos producen cantidades significativas de material capsular o
viscoso en presencia de ciertos carbohidratos. Esto puede interferir con la
descoloración, y ciertos organiosmos Gram negativos tales como Klebsiella pueden
aparecer como una mezcla de células rosadas y violetas.
III. ACTIVIDADES

III.1 Observación de colonias crecidas en placas de agar

Observar las colonias obtenidas y describirlas teniendo en cuenta las siguientes características:

1. Forma : puntiforme, circular, rizoide, irregular, filamentosa.

2. Tamaño : grande (más de 3 mm),mediana (2-3 mm), pequeña (1-2 mm)
3. Color :
4. Borde : entero, ondulado, lobulado, filamentoso, ondeado
5. Elevación : plano, elevado, convexo, pulvinado, umbonado  
6. Superficie : suave, brillante, rugosa, plegada, seca, polvorienta

Comparar con las siguientes figuras:

III.2 Uso del microscopio

1. Identificar en el microscopio las partes que componen el sistema óptico y de iluminación.

2. Señalar la función de las partes identificadas y de las piezas mecánicas.

3. Indicar en un esquema las partes identificadas.

4. Observar cuidadosamente los diferentes objetivos dispuestos en el portaobjetivos. Explicar

el significado de las numeraciones anotadas.

5. Observar el ocular. Sólo por esta vez se puede desprender cuidadosamente del tubo y
observar sus lentes. Anotar el poder de aumento anotado en él.

6. Calcular el poder de aumento total para todas las combinaciones objetivo y ocular.

7. Observar las preparaciones proporcionadas. Dibujar, indicando siempre el aumento

empleado, el tipo de preparación y si es a fresco o teñida.

III.3 Preparación de un frotis

La preparación de un frotis es imprescindible en muchos procedimientos

microbiológicos, incluyendo la tinción de Gram. El propósito de preparar un frotis es fijar la
bacteria sobre una lámina de vidrio, o portaobjeto y evitar que la muestra se desprenda durante
el proceso de tinción. Esto también mata a la bacteria, aumentando la seguridad. El frotis se
puede preparar a partir de un medio sólido o líquido. Las siguientes son alguna s indicaciones
para preparar un frotis para tinción de Gram, pero se puede aplicar para otras tinciones.

1. Depositar con un asa una muestra de crecimiento en sólido sobre una gota discreta de
agua en el centro de un portaobjetos limpio y desengrasado

2. Con el asa dispersar y esparcir la mezcla completamente sobre la mitad del área total del
portaobjetos

3. Secar el portaobjetos con el frotis hacia arriba, sobre la llama suave de un mechero
mediante movimientos circulares, sin estacionar sobre la llama.
 4. Enfriar al aire. El frotis estará listo, entonces para el procedimiento de tinción

III.4 Procedimiento para tinción de Gram

1. Rotular convenientemente cada uno de los portaobjetos

.
2. Preparar extendidos de los microorganismos indicados por el docente.

3. Tomar material de la colonia elegida, con un asa previamente esterilizada a la llama y

suspender este material en una gota de agua colocada en la mitad del portaobjetos.
Extender el material sobre toda la superficie del portaobjeto.

4. Dejar secar al aire junto a la llama del mechero.

5. Fijar con calor pasando el preparado por sobre la llama SIN QUEMARLO.

6. Cubrir el extendido con una solución del colorante cristal violeta. Dejar en contacto 2
minutos.

7. Eliminar el colorante. Cubrir con solución de lugol. Dejar en contacto durante 30

segundos.

8. Decolorar con alcohol-acetona 1 o 2 veces. Lavar con agua.

9. Cubrir con safranina (colorante de contraste). Dejar en contacto 1 minuto. Lavar con
agua.

10. Secar a la llama suave de un mechero y enfriar.

11. Observar al microscopio óptico con objetivo de inmersión.

 

Se deberán reconocer las características morfológicas y tintoriales de las distintas

bacterias. El alumno deberá informar forma, agrupamiento y afinidad tintorial.
 

III.5 Procedimiento de coloración de ácido resistencia

 
1. Preparar extendidos de los microorganismos a estudiar.

2. Fijar con calor.

3. Cubrir todo el porta con fucsina básica fenolada (carbolfucsina)

4. Calentar hasta emisión de vapores y seguir dicho calentamiento durante 3 minutos más.
Si se seca alguna parte del porta, agregar colorante sobre el preexistente y no sobre la
parte seca, hasta cubrirlo nuevamente.
 5. Lavar con agua.

6. Decolorar con alcohol-ácido hasta que no se desprenda más colorante.

7. Lavar con agua.

8. Cubrir el extendido con azul de metileno. Dejar en contacto durante 30 segundos.

9. Lavar con agua. Secar.

10. Observar con objetivo de inmersión.

 

III.6 Tinción de esporas.

 
1. Preparar un extendido del microorganismo.

2. Fijar por calor y cubrir todo el portaobjeto con una solución de verde de Malaquita.

3. Calentar hasta emisión de vapores y seguir dicho calentamiento durante 3 minutos (no
permitir que se seque el colorante. Si esto ocurriera, agregar colorante, sobre el
preexistente y no sobre la parte seca, hasta cubrirlo nuevamente.)

4. Lavar con agua y cubrir con solución de Safranina. Dejar actuar 30 segundos. Lavar
con agua, secar y observar con objetivo de inmersión.

5. Informar: morfología, color y tipo de espora.

 
 
III.7 Tinción negativa para cápsula
 
1. Colocar una pequeña gota de tinta china en la parte central del portaobjetos.

2. Utilizando el asa, colocar una gota de la suspensión de microorganismos sobre la tinta

china.

3. Colocar sobre el preparado un cubreobjeto para que se forme un film (tinta-cultivo).

4. Fijar a la llama suave del mechero.

5. Enfriar totalmente

6. Cubrir totalmente la preparación con safranina o fucsina durante 1 minuto.

7. Eliminar cuidadosamente el colorante para no desprender la tinta china y lavar con

chorro muy fino de agua.

8. Secar a la llama y enfriar

9. Observar al microscopio con objetivo de inmersión.