AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y

PRESERVACIÓN DE CEPAS
LEVADURIFORMES DEGRADADORES
DEL BAGAZO DE CAÑA DE AZÚCAR

Integrantes: Arboleda Marcelo

Cóndor Belén
Cueva Nathaly
Góngora Estefania
INTRODUCCION
El bagazo de caña de azúcar es un material
lignocelulósico constituido principalmente por celulosa,
hemicelulosa ligadas fuertemente a la lignina.
Tradicionalmente en los centrales azucareros este
desecho se quema como una forma de limitar la
disposición final de este desecho, desperdiciando un
elemento de tan valiosa importancia para diversas
industrias como la fabricación de papel, producción de
alimentos balanceados para animales y elaboración de
aglomerados para la construcción, industrias donde se
usa actualmente el bagazo de caña, pero no en todo su
potencial
El bagazo de caña representa aproximadamente entre el 25
y 40 % del total de la materia procesada, dependiendo del
contenido de fibra de la caña y la eficiencia en la extracción
del jugo. En el Ecuador existen cultivadas 79.913 Has. de
caña de azúcar, y una producción bruta de 5 618 045 TM,
con un rendimiento promedio de 70,30 TM/ha. El bagazo
uno de los residuos agrícolas más abundantes con una
producción anual estimada de 158 000 toneladas, obtenidas
de los 6 ingenios azucareros existentes en el Ecuador y de
otros productores pequeños.
Por lo que este proyecto va orientado al aprovechamiento
de los residuos de la extracción del jugo de la caña de
azúcar, al degradar la lignina en celulosa y hemicelulosa
mediante organismos levaduriformes degradadores de este
compuesto.
Los objetivos del proyecto fueron:
• Aislar levaduras con capacidad de degradar
lignina a partir del bagazo de caña de azúcar..
• Seleccionar las mejores cepas, de acuerdo a las
condiciones de pH, temperatura y otras en las
que ellas van a degradar el bagazo de caña.
• Identificar macro y microscópicamente las
levaduras seleccionadas, y adaptarlas a un
medio estable.
• Evaluar la capacidad de degradación de lignina
de las levaduras aisladas del bagazo de caña.
• Preservar las levaduras seleccionadas mediante
críocongelación.
MARCO TEORICO
 Bagazo de caña de azúcar

La caña de azúcar crece en climas tropicales y

subtropicales. El bagazo es el residuo fibroso que
queda de la caña después de ser exprimida y de
pasar por el proceso de extracción. Por lo general
el bagazo se utiliza en los ingenios azucareros
como combustible, sin embargo para la industria
papelera representa una de las materias primas
más importantes.
 Propiedades físicas y químicas del bagazo

El bagazo completo esta integrado por tres componentes

principales:
• El recubrimiento, en el que se incluye la epidermis, la
corteza y el periciclo.
• Los mazos de fibra vascular, entre los que figuran las
células conductoras de pared delgada asociadas con
fibras de pared relativamente con estrecho lumen.
• El tejido básico (parénquima) o medula, con mazos de
fibra distribuidos irregularmente.
• La composición química de las diferentes fracciones de
bagazo, incluyendo el bagazo entero, la fibra separada y
la medula se indican en la Tabla 1.
Propiedades químicas de las fracciones del
bagazo

S
 CARACTERISTICAS DE LOS COMPONENTES
PRINCIPALES DEL BAGAZO DE CAÑA
Celulosa:Esta compuesto por un polímero de residuos de
D-glucosa unidos por enlaces. Debido a su estructura, las
cadenas de celulosa se unen por Puentes de hidrogeno
intermoleculares formando agregados (microfibrillas).. La
celulosa es una molécula que da estructura y soporte a la
planta. Es impermeable al agua. Consecuentemente el
polímero celulosa es insoluble y resistente a la hidrólisis.
Hemicelulosa.- forman cadenas cortas y son
polímeros heterogéneos que contienen tanto
hexosas como pentosas. Dependiendo de la
especies de la planta, estos azucares se asocian
con ácidos urónicos formando estructuras
poliméricas diversas, qué pueden est6ar
relacionados cercanamente tanto con celulosa
como lignina. Los tres polímeros principales son
los xilanos, los mananos y los arabinogalactanos
Lignina.- Es un polímero
complejo, tridimensional,
globular, irregular, insoluble
y de alto peso molecular
(>10,000), formado por
unidades de fenilpropano
cuyos enlaces son fáciles
de hidrolizar por vía
química o enzimática.
• En las plantas, la lignina se encuentra
químicamente unida a la hemicelulosa y
rodeado a las fibras compuestas por
celulosa.
• Es responsable de la rigidez de las
plantas y des sus mecanismos de
resistencia al estrés y a ataques
microbianos. Es especialmente abundante
(20-30% del peso de la pared) en células
conductoras (vasos xilemáticos) y
estructuras (fibras) con engrosamiento
secundario.
Empleo de substrato orgánico por los
microorganismos

O2 O2

α(1 − 4)α(1 − 6)

β(1 − 4)

β(1 − 4)
β(1 − 3)
β(1 − 4)

β(1 − 4)

Substrato
 Organismos degradadores de lignina y
mecanismo de biodegradación

• Lignina, una substancia difícil de degradar y que los

hongos descomponen debido a que poseen enzimas que
rompen dicha molécula y dependiendo de cómo los hongos
lo ataquen, se clasifican en: hongos de pudrición blanca y
hongos de pudrición parda (o de color café)

• Estos hongos realizan la ligninólisis la función primaria de

esta es exponer a la muestra al ataque del hongo con
ayuda de diferentes tipos de enzimas.

• La ligninólisis ocurre durante el metabolismo secundario,

es decir bajo limitación de nutrientes, lo que permite que el
hongo solo sintetice y secrete agentes ligninoliticos que
comiencen a fragmentar el polímero.
• Por otra parte se sabe que dos de las mas conocidas
peroxidasas (enzimas que atacan a la lignina) son
secretadas por diversos hongos entre ellos Pleurotus
eryngii. Una de ellas es la enzima de manganeso
peroxidasa y la otra es la enzima lignina peroxidada.
Este hongo ha sido muy estudiado debido a su
capacidad de degradar lignina selectivamente cuando
crece en substratos naturales y por lo tanto es un
organismo considerado como modelo para estudios de
biodegradación de lignina y con aplicaciones
biotecnológicas.
• En términos generales la degradación de lignina es
catalizada por un complejo enzimático extracelular que
poseen algunos hongos. Los mayores componentes de
este sistema incluye a la enzima peroxidada (LiP),
manganeso peroxidasa (MnP) y al enzima generadora
de peroxido glioxal oxidasa (GLOX). Bajo condiciones de
limitación de nutrientes en el medio de cultivo, diversos
hongos son capaces de secretarlas
 Levaduras degradadoras de lignina
Recientemente, se ha descritoque algunas especies de levaduras
como Candida ingeniosa, Rhodotorula graminis y Rhodotorula
mucilaginosa son organismos que degradan productos derivados de
lignina.

Lignina    → Célulosa + Hemicelulosa

Levadura

D
MARCO METODOLOGICO
 METODOS GENERALES DE ANALISIS
• Muestreo
Las muestras se tomaran del residuo de la
elaboración de jugo de caña de azúcar, del
sector de Tambillo, esta será representativa y
recogida a diferentes tiempos, durante un día
de producción.
• Preparación de la muestra
Se molerá perfectamente la muestra y se
pesara 10 g de la misma, posteriormente se
colocaran en un matraz con 90 ml de agua
destilada estéril, se agitará y se hará
diluciones que van desde 10-2 hasta 10-7.
METODOS ESPECIFICOS DE ANALISIS
Diseño del medio de cultivo

Medio minimal + agar

 Medio minimal líquido

*Se utiliza como fuente de carbono presentes en el

bagazo de caña de azúcar.
ªPara inhibir bacterias.
 AISLAMIENTO DE LEVADURAS
DEGRADADORAS DE LIGNINA
• Las muestras obtenidas se sembrarán por el método de
extensión (asa de digrasky) en el medio minimal, tres cajas
petri por dilución, y se dejarán a temperatura ambiente
durante cinco días en aerobiosis.
• El pH del medio minimal mas agar debe ser de 5 debido a
que las levaduras que se van a aislar crecen mejor a ese
pH y los otros microorganismos que no son de nuestro
interés no.
• De las cepas levaduriformes que se reproducirán en el
medio al cabo de cinco días, las enriquecemos nuevamente
en un medio de cultivo líquido (medio base), las llevamos al
shaker durante 24 horas a 37º C y 150 rpm.
 PURIFICACIÓN
• Para evitar el crecimiento de bacterias y
hongos filamentosos se sembrarán las
diluciones enriquecidas en medios
Saburoud y otras en medio papa
dextrosa adicionadas con tetraciclina para
inhibir el crecimiento de los organismos
mencionados anteriormente.
 IDENTIFICACION
• Análisis de la morfología micro y
macroscópica
• A cada una de las cepas aisladas se les
realizará tinción Gram para observarlas al
microscopio. Y se observará como crecen
en el medio de cultivo.
 SELECCIÓN DE LOS MICROORGANISMOS
LEVADURIFORMES

• Parámetros de selección:

• Se utilizará un pH de 5 y una temperatura de 37ºC,

para las levaduras de nuestro interés
• Concentración de nutrientes
• La lignina es el principal compuesto para el
crecimiento de este tipo de levaduras, el bagazo de
caña de azúcar tiene alrededor del 20%.
• Para la selección de las cepas con mayor poder
degradador elaboraremos medios con las siguientes
concentraciones de lignina 0.2, 0.4, 0.6 y 0.8%
respectivamente. Por lo tanto la selección se
efectuará en el medio de cultivo con estas
concentraciones.
• Los microorganismos seleccionados serán puestos
nuevamente en un medio minimal líquido y sólido, con
la diferencia de que esta vez el medio base contendrá
como fuente de carbono el bagazo de caña de azúcar
que van a ser degradados. Después de sembrar los
microorganismos seleccionados estos deberán
permanecer por lo menos cuatro o cinco días a
temperatura ambiente para su crecimiento
Para verificar tanto el crecimiento de los organismos aislados como su
capacidad de degradar lignina se emplea en medio minimal adicionado
con lignina al 0,2% en forma de medio liquido en matraces de 250 ml, se
sembraran las diferentes levaduras bajo las siguientes condiciones de
crecimiento: pH = 5 , temperatura ambiente y agitación a 150 rpm.

• Curva de crecimiento
Para evaluar el crecimiento de las cepas se tomaran diariamente 1ml de
medio de cultivo de cada uno de los matraces donde se sembraron las
levaduras, se colocaran en tubos de ensayo que contengan 9 ml de agua
estéril, se mezclaran y a partir de estos, se realizaran diluciones hasta 10-
7. Posteriormente cada dilución se sembrara en caja petri con medio
solido YEPD. Cada caja se incubara a 37°C y una vez obtenido el
crecimiento se contaran las levaduras.

• Degradación de lignina
Para analizar la degradación se observaran diariamente los matraces con
el fin de verificar el cambio de coloración del medio de cultivo.
 • PRESERVACIÓN

Para la preservación de las cepas puras

que
son de utilidad biotecnológica se usara la
técnica de criocongelación (crioviales con
glicerol al 20%).