INMUNOHISTOQUÍMICA

Métodos inmunoenzimáticos

Bioq. Gerardo Pisani

 Métodos inmunoenzimáticos

 Permite localizar moléculas en los tejidos

mediante el empleo de anticuerpos.

 Utilizan reacciones enzima-sustrato.

 Fundamento: localizar el producto de reacción

incoloro de la enzima asociándolo con una
reacción que permita su visualización al
microscopio.
 Técnicas de inmunoperoxidasas

Son un conjunto de métodos de inmunomarcación que

tienen en común la enzima peroxidasa.
Cada molécula de peroxidasa es capaz de desdoblar
múltiples moléculas de sustrato.
La peroxidasa es de origen vegetal , es estable y activa a pH
cercano a la neutralidad.

Importancia:
 Altamente sensible.
 Pueden ser aplicadas a cortes incluidos en parafina.
 Costo final bajo.
PEROXIDASA+ AGUA OXIGENADA COMPLEJO PRIMARIO
(Enz. Reducida) (Sustrato) (Oxidación del grupo hemo)

DAB
(Dador de elect.)

COMPLEJO SECUNDARIO

Se disocia

Enz. Reducida DAB oxidado

Precipitado marrón
insoluble

Solubles en solventes orgánicos: 4-Cl-1-Naftol (Azul) y el

9 etil-3 aminocarbazol (Rojo)
INMUNOFLUORESCENCIA INMUNOPEROXIDASA

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Menor sensibilidad Mayor sensibilidad
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Cortes frescos o congelados Cortes congelados
Cortes incluidos en parafina Cortes flotantes
Cortes incluidos en parafina
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Pobre conservación de la morfología Excelente conservación de la
morfología
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Breve conservación de la marcación Conservación indefinida de la
por pérdida paulatina de la fluorescencia marcación
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Se utiliza microscopio de fluorescencia Se utiliza microscopio de campo
claro
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Buena marcación de antígenos Buena marcación de antígenos
extracelulares y ligandos de membrana citoplasmáticos y nucleares
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Métodos de coloración

Método Directo

Método Indirecto
 Métodos de coloración

Método con anticuerpo antiperoxidasa

 Métodos de coloración

Complejo peroxidasa-
antiperoxidasa

Reacción de PAP
 Métodos de coloración

Técnicas que utilizan la proteína A

 Métodos de coloración

Métodos que utilizan biotina-(strept)avidina

Tecnología LAB o LSAB
 Métodos de coloración

Métodos que utilizan biotina-(strept)avidina

Tecnología ABC
 Métodos de coloración

FORMAS DE AMPLIFICAR LAS INMUNOMARCACIONES

 Repitiendo una o dos veces el 2do o 3er paso.

 Amplificación catalizada de la señal:
 Se realiza la primer reacción con LSAB o ABC.
 Se agrega un sustrato fenólico biotinilado
(Biotiniltiramida).
 Se depositan fenoles biotinilados insolubles.
 Se realiza la segunda reacción con LSAB o ABC.
 Se revela con DAB.
 Métodos de coloración

Amplificación catalizada de la señal

 Métodos de coloración

Tecnología de polímeros conjugados. Método Indirecto

Polímeros polivalente
 LOCALIZACIÓN SIMULTÁNEA DE DOS ANTÍGENOS
 Realizar un único desenmascaramiento.
1-Emplear del mismo sistema enzimático en ambos antígenos y
revelado con un cromógeno distinto
 Primera determinación:
 El antígeno que está en mayor proporción.
 El antígeno nuclear.
 El anticuerpo primario preferiblemente policlonal.
 Revelado con DAB.
 Elución ácida (Si se utiliza anticuerpos primarios de la misma
especie).
 Segunda determinación:
 Revelado con 4-Cl-1-Naftol (Azul) o el 9 etil-3 aminocarbazol
(Rojo).
 Montaje en medio acuoso.
2- Emplear un sistema enzimático diferente con su
correspondiente cromógeno para cada antígeno.
 INMUNOHISTOQUÍMICA LSAB con recuperación antigénica
-Desparafinación:
3 cambios de xilol 5’ c/u.
2 cambios de alcohol 100 % 10’ c/u.
2 cambios de alcohol 96 % 10’ c/u.
Agua desionizada 1’ agitando.
-Desenmascaramiento:
Calentar 5’ a 95ºC en buffer citrato de sodio 10 mM (pH: 6,0). Descartar el
buffer.
Calentar 5’ a 95ºC en buffer citrato de sodio 10 mM (pH: 6,0). Dejar enfriar
durante 20’.
Lavar 3 veces con agua desionizada 2’ c/u agitando.
Aspirar el exceso de líquido.
-Bloqueo de la peroxidasa endógena:
Incubar los especímenes con agua oxigenada al 1 o 3 % en PBS durante 10’ a
15’.
Enjuagar con PBS.
Lavar 2 veces con PBS 2’ c/u agitando.
Aspirar el exceso de líquido.
-Bloqueo de sitios inespecíficos (hidrofóbicos):
Suero bloqueante: albúmina de suero bovino al 1,5 o 3 % en PBS. Se
recomienda prepararlo en los primeros pasos del protocolo.
Incubar los especímenes 30’ con suero bloqueante.
Aspirar el exceso de líquido.
-Anticuerpo primario:
Incubar los especímenes con anticuerpo primario toda la noche en heladera, o
bien 2 horas a temperatura ambiente. El anticuerpo debe ser diluido en suero
bloqueante.
Enjuagar con PBS
Lavar con PBS 2 veces agitando 2’ c/u.
Aspirar el exceso de líquido.
-Sistema de detección:
-a)Anticuerpo secundario biotinilado:
Incubar los especímenes 10 a 30’ con Anticuerpo secundario biotinilado.
Enjuagar con PBS
Lavar con PBS 2 veces agitando 2’ c/u.
Aspirar el exceso de líquido.
-b)Complejo Streptavidina-peroxidasa (Strep-HRP):
Incubar los especímenes 10 a 30’ con Streptavidina-peroxidasa.
Enjuagar con PBS
Lavar con PBS 2 veces agitando 2’ c/u.
Aspirar el exceso de líquido.
Durante este paso preparar el sustrato de HRP:
5 mg de diaminobencidina (DAB) en 10 ml de PBS. En el momento de usar
agregar 20 μl de agua oxigenada.
-Revelado:
Incubar con el sustrato HRP 30’’ a 20’ hasta que la coloración del espécimen
sea marrón clara (paso crítico). Cortar con agua desionizada.
Enjuagar con agua desionizada.
Lavar con agua desionizada 2 veces agitando 2’ c/u.
-Contracoloración:
Contracolorear con hematoxilina 15 a 30’’ (si es nueva) o 60’’ (si es usada)
Lavar con varios cambios de agua desionizada.
-Decoloración:
Decolorar 10’’ con alcohol ácido (49,5 ml alcohol 70% + 0,5 ml HCl 1N).
Lavar varias veces con agua corriente. Dejar con agua corriente hasta virar el
colorante aproximadamente 5’.
-Deshidratación:
2 cambios de alcohol 96 % 10’’ c/u.
2 cambios de alcohol 100 % 10’’ c/u.
3 cambios de xilol 10’’ c/u.
-Montar con bálsamo de Canadá natural

Recordar: Si se trabaja con anticuerpos monoclonales utilizar PB en

lugar de PBS.
ERRORES Y PROBLEMAS EN LAS TECNICAS DE INMUNOMARCACION

I) Sobremarcación. El problema del background (Coloración de fondo

inespecífica).

a) Errores de la fijación.
 Posible difusión de antígenos solubles.
 Fenómenos de autólisis.
 Algunos tejidos mal fijados.
 Excesiva fijación con formalina.

b) Errores en los procesos posteriores.

 Los alcoholes en general no alteran la marcación.
 No utilizar el acetato de butilo como aclarante pues produce un background
importante.
 No renovar los solventes.

c) Errores en la inclusión.
Utilizar parafina de bajo punto de fusión. No es recomendable usar celoidina
En general el background está en relación directa con el tiempo y la
temperatura de inclusión.
d) Errores en el corte.
-Corte de tejido demasiados gruesos.
-La porción cortada contiene efectos de aplastamiento.

e) Errores en el colado.
 Se recomienda trabajar con portas nuevos y lavados con solución alcohol-
ácida.
 No utilizar albúmina de huevo (Albúmina de Meyer).
 No utilizar adhesivo en exceso o aplicado irregularmente sobre los portas.
 Se recomienda derretir la parafina colocando los cortes montados en estufa
de 56ºC durante 24 hs.
 Precaución si el tejido se despegó parcialmente.

f) Errores en la eliminación de la parafina.

La remoción incompleta del medio de inclusión provoca una tinción de fondo
limitada a áreas del tejido.
g) Errores en las incubaciones.
 Coloración de fondo debido a interacciones hidrofóbicas
 Coloración de fondo producida por interacciones iónicas
 Un mal bloqueo de la peroxidasa endógena
 Actividad endógena ligadora de (Strept)avidina
 Incubación con el Ac 1rio
 Receptores Fc.
 Reactividad cruzada.

h) Errores en los lavados.

i) Errores del revelado.

Tiempo excesivo de revelado.

j) Errores en el contraste.
Tiempo excesivo en el contraste.

k) Fuentes misceláneas.
La coloración difusa de todos o de la mayoría de los elementos del tejido
dentro de un área, puede ser causada por lesión física al tejido o porque tejido
se secó antes de la fijación o durante el proceso de IHQ.
II) Submarcación.
a) Errores en la fijación e inclusión.
Esto es debido fundamentalmente a la destrucción o enmascaramiento del
antígeno por un tratamiento indebido o el uso de un reactivo inadecuado.

b) Cortes demasiados finos.

c) Errores en las incubaciones.

 Se recomienda la no reutilización de los buffer.
 Utilización de buffer salinos con Anticuerpos monoclonales.
 Bloqueo excesivo de la peroxidasa endógena.
 En algunos casos utilizar Tritón X 100 al 0,1-0,4 %.
 Mala conservación de los anticuerpos.
 Errores en las incubación con los anticuerpos.
 Exceso de reactivo que queda en el corte de tejido.

d) Errores en los lavados.

e)Errores del revelado.

Esto es debido a tiempos cortos de revelado o la mala composición de la
solución reveladora.

f)Fuentes misceláneas.
Se debe evitar el uso de azida sódica en diluyentes y buffer.
Inmunohistoquímica aplicada a extendidos citológicos y cultivos
celulares
Recomendaciones:
•Fijación inmediata. No dejar secar.
•Usar portas silanizados o con carga positiva.
•Los extendidos finos en monocapa.
•Presencia de células necróticas, estiradas, aplastadas dan falsos positivos.
•Aplicar técnica de rehidratación (si son muestras hemáticas)
•Fijadores: alcohol 96º (extendidos), metanol frío o acetona fría (cultivos
celulares)
•No realizar digestión enzimática como método de recuperación antigénica
•Recuperación con calor a menor temperatura y menor tiempo. Se puede agregar
una pequeña cantidad de detergente a la solución recuperadora
•Tratamiento con cloroformo para ciertos antígenos de membrana
•Mayor bloqueo de peroxidasa endógena
•Bloqueo de biotina (si se utiliza biotina-avidina)
•Menor tiempo de incubación con el anticuerpo 1rio.
•El contraste nuclear se hará con mayor tiempo de coloración y virado