M. Sc. Soriuska Mayora.

Bioanalista.
Universidad Central de Venezuela.
Inmunólogo Básico
Instituto de Inmunología Dr. “Nicolás E. Bianco C”
Universidad Central de Venezuela.

Ebook
Es tiempo de: Citometría de flujo.
Primera Edición, septiembre 2023.
Caracas. Venezuela
Diseño: Lumiere Light.
 Contenido:
Prólogo.
1. Citometría de flujo. 4
2. Partes de un citómetro de flujo. 5
2.1 Sistema fluídico: una a una todas en fila. 5
2.2 Sistema óptico Hágase la luz láser. 5
2.3 Sistema electrónico: el traductor 6
3. Tipos de citómetro de flujo 7
3.1 Citometría convencional. 7
3.2 Sorter. 7
3.3 Citometría espectral. 7
3.4 Citometría de masa. 7
3.5 Citometría de imagen. 8
4. Antígenos: ¿Qué estoy buscando? 9
4.1 Clusters de diferenciación. 10
5. Anticuerpos monoclonales: ¿con que lo voy a buscar? 11
5.1 Titulación. 11
6. Fluorocromos: Un mundo de colores. 13
6.1 Espectro de absorción. 13
6.2 Espectro de emisión. 13
6.3 Algunos fluorocromos o compuestos
fluorescentes pueden ser: 13
6.3.1 Colorantes de unión al ácido nucleico. (ADN). 13
6.3.2 Unión covalente (tándem dyes). 14
6.3.3 Quatum dots (QD). 14
7. Muestras: ¿Dónde lo voy a buscar? 15
7.1 Tejido. 15
8. Aplicaciones de la citometría de flujo. 16
9. Flujograma de trabajo en citometría de flujo. 17
 Prólogo:
La citometría de flujo es una técnica biofísica que permite evaluar la
expresión de moléculas en superficie, intracelulares, nucleares y
cambios metabólicos en cada célula por lo que su uso como
herramienta en diagnóstico e investigación es invaluable. Dada su
importancia, nuevos y más versátiles equipos y software se han
desarrollado para hacer más económica y útil ésta herramienta. Es
recomendable que los estudiantes y el personal profesional entienda la
importancia de la técnica y la interpretación de sus resultados por ello
ésta iniciativa de la M.Sc Soriuska Mayora tiene mi apoyo.

Dr. Juan B. De Sanctis.

Senior Researcher.and Professor.
Institute of Molecular and Translational Medicine.
The Czech Advanced Technology and Research Institute (CATRIN).
Faculty of Medicine and Dentistry.
Palacky University Olomouc.
Czech Republic.

Professor
Institute of Immunology. FOCIS Center of Excellence.
Faculty of Medicine.
Universidad Central de Venezuela.
Caracas. Venezuela
 1.Citometría de flujo:
La citometría de flujo es una técnica de laboratorio inventada en
1960 (1), que, aunque se piense que está reservada a los laboratorios de
investigación, cada día gana más terreno en los laboratorios clínicos y
de diagnóstico a nivel mundial debido a su gran versatilidad y otros
múltiples atributos.
Pero; ¿en qué consiste la citometría? Consiste en hacer pasar las
células de una en una frente a un haz de luz láser. Gracias a la
dispersión de esta luz es que se pueden obtener dos tipos de
información.

1- Información proveniente de las características propias de la célula,

como su tamaño (dispersión con dirección frontal) y su complejidad
(dispersión lateral) (figura 1).
2- Información proveniente del uso de anticuerpos monoclonales que
están marcados con fluorocromos y que se unen de manera específica
a su antígeno.

Mediante esta técnica podemos seleccionar, identificar y cuantificar

poblaciones especificas dentro de una mezcla heterogénea de células.
El único requisito es que estas células se encuentren en una matriz en
forma de suspensión.

Figura 1. Ilustración del fenómeno de dispersión de luz frontal y lateral en un citómetro

de flujo convencional. La dispersión lateral es captada por un detector y traducida
para brindar información sobre la complejidad de la partícula analizada, mientras que
la dispersión frontal indica su tamaño.

Es tiempo de: citometría de flujo 4

 2.Partes de un citómetro de flujo.
Tres sistemas, un objetivo.

Un citómetro de flujo convencional requiere del funcionamiento armónico

de 3 sistemas: El sistema fluídico, el sistema óptico y el sistema electrónico.
Cada uno con una función específica que cumplir.

2.1 Sistema fluídico: una a una todas en fila.

El sistema fluídico se encarga de mover o empujar las células para que
pasen de una en una a la zona de reconocimiento, de manera que sobre
cada célula incida la misma cantidad de luz (2)

2.2 Sistema óptico: hágase la luz láser.

La palabra "láser" es un acrónimo de "amplificación de la luz por emisión
estimulada de radiación"(3). Aunque la estrella sea él o los laser, el sistema
óptico está compuesto por varios elementos de igual importancia. Se
encuentran: los lentes que se encargan de recolectar la luz emitida por las
células, los filtros ópticos, o filtros de paso de banda, los cuales transmiten
la luz que se encuentra en un rango espectral definido.

Figura 2: filtros de paso de banda. Solo dejan pasar la luz que se encuentra en un rango
definido. Por ejemplo, un filtro de 620/20 /solo dejará pasar la luz que se encuentre
entre 650 y 670 nm, y toda la luz restante pasará a un filtro diferente.

Es tiempo de: citometría de flujo 5

Partes de un citómetro de flujo

2.3 Sistema Electrónico. El traductor.

La función principal de este sistema es detectar las señales analógicas

provenientes de fotones y electrones para amplificarlas, filtrarlas y
traducirlas a señales digitales que se observaran en forma de datos
específicos en un software de computadora,

Figura 3: sistemas que conforman un citómetro de flujo.

Es tiempo de: citometría de flujo 6

 3.Tipos de citómetro de flujo
3.1 Citometría convencional:
La citometría de flujo convencional se basa en el principio de un
detector para cada fluorocromo (un detector, un color). Utiliza espejos
dicroicos y filtros de paso de banda para seleccionar bandas específicas
del espectro óptico para su captura mediante detectores puntuales, como
los fotomultiplicadores (4).

3.2 Sorter:
Un tipo específico de citómetro de flujo tradicional es el clasificador
celular, que puede purificar y recoger muestras para su posterior análisis.
Un clasificador celular permite al usuario seleccionar (gate) a una
población de células o partículas que sea positiva (o negativa) para los
parámetros deseados y luego dirigir esas células a un recipiente de
recogida.

3.3 Citometría espectral:

La citometría de flujo espectral difiere de la citometría de flujo
convencional en el hecho de que esta utiliza prismas para captar toda la
luz emitida por los fluoróforos excitados por el láser a través de un
conjunto de detectores, o una matriz de canales, en lugar de detectar los
fotones emitidos que se recogen en detectores individuales. Esto significa
que, mientras que la citometría de flujo convencional detecta eficazmente
las señales de fluoróforos específicos en longitudes de onda definidas, la
citometría de flujo espectral recoge todo el perfil espectral (también
denominado firma espectral) de los fluoróforos procedentes de múltiples
láseres. (4,5)

3.4 Citometría de masa:

La citometría de masa, también denominada citometría por tiempo de
vuelo (CyTOF®), es una potente herramienta para ensayos unicelulares de
alto rendimiento y alta dimensionalidad. Introducida por primera vez en
2009 por Bandura et al., Los citómetros de masas combinan la
espectrometría de masas de tiempo de vuelo y la citometría de flujo. Las
células se marcan con anticuerpos marcados con iones de metales pesados
en lugar de anticuerpos marcados con fluorescencia y se detectan
mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo. (6,7)

Es tiempo de: citometría de flujo 7

 Tipos de citometría de flujo

3.5 Citometría de imagen:

En contraste con las mediciones puramente cuantitativas que

proporciona la citometría de flujo convencional, la técnica inventada
en el siglo XVII -la microscopía- permite capturar imágenes celulares
que contienen una gran cantidad de información sobre una célula.
Mientras que la citometría de flujo convencional mide la luz dispersa
hacia delante para estimar el tamaño relativo de la célula, la
microscopía proporciona el tamaño exacto de la célula mediante su
imagen (8).

Figura 4: Algunos tipos de citometría de flujo Convencional: cytoflex, Imagen: Image stream
Mk II Sorter: BD FACS ARIA II Masa: Macs quant analyzer Espectral: Sony ID 7000

Es tiempo de: citometría de flujo 8

 4.Antígenos:
¿qué estoy buscando?
En citometría de flujo cuando usamos el termino antígenos (Ags), nos
referimos a las moléculas que serán reconocidas por los anticuerpos
monoclonales y que nos servirán para identificar las células de interés o en
otras palabras ponerle nombre y apellido.
Según la densidad de su expresión los antígenos se dividen en tres
categorías:
·Los antígenos primarios son de alta densidad con expresión on/off
(aparecen y desaparecen).
·Los antígenos secundarios también tienen una alta expresión, pero con una
expresión continua.
·Los antígenos terciarios son de baja densidad o tienen niveles de expresión
desconocidos.

También se necesita tener una idea de cuántas moléculas de antígeno

hay en las células que se desea medir. La densidad del antígeno, así como
la ubicación de este dentro o fuera de la célula, es una consideración
importante a la hora de elegir el fluorocromo a utilizar para su detección
(9).

Figura 5. Clasificación de las moléculas antigénicas según su densidad de expresión.

Es tiempo de: citometría de flujo 9

 Antigenos: ¿Qué estoy buscando?

4.1 Clusters de diferenciación:

Los Ags CD (cluster of differentiation) son moléculas de superficie

que se expresan en los leucocitos y otras células del sistema
inmunitario. La nomenclatura CD ha sido adoptada universalmente
por la comunidad científica y está oficialmente aprobada por la Unión
Internacional de Sociedades de Inmunología y sancionada por la
Organización Mundial de la Salud. Proporciona un sistema de
designación unificado para los anticuerpos monoclonales (mAbs), así
como para las moléculas de superficie celular que reconocen. Las
moléculas CD se utilizan habitualmente como marcadores celulares,
lo que permite identificar y aislar poblaciones, subconjuntos y estadios
de diferenciación de los leucocitos. Los mAbs contra estas moléculas
han demostrado ser esenciales para la investigación biomédica y el
diagnóstico, así como en biotecnología (10).

Tabla 1: cluster de diferenciación (CD) de las principales poblaciones linfocitarias.

Linfocitos T Linfocitos B Células NK

CD3 CD19 CD16-CD56

CD4
CD20
(Colaboradores)

CD8 (Citotóxicos)

Es tiempo de: citometría de flujo 10

 5.Anticuerpos monoclonales:
¿con que lo voy a buscar?
Un anticuerpo monoclonal se considera un anticuerpo de especificidad
única, generado a partir de la inmortalización de una célula B plasmática
in vitro. Es decir, es un anticuerpo que reconoce de manera específica
solo a una molécula o a una parte de ella y que además al ser combinado
con un fluorocromo, enzima u otro compuesto permite revelar la presencia
de algún analito de interés. Existen muchos tipos de anticuerpos
monoclonales, y cada anticuerpo monoclonal se produce para unirse a un
antígeno específico único. (11)
En el caso de los anticuerpos para citometría de flujo estos están
conjugados con fluorocromos. Comercialmente existe una gran variedad
combinaciones de anticuerpos y moléculas fluorescentes, lo que permite
diseñar una infinidad de paneles tomando en cuenta la fuente de
excitación y la densidad del antígeno.

5.1 Titulación.
Cada anticuerpo acoplado con fluorocromo debe titularse para
determinar la concentración que maximizará la separación de células
positivas y negativas, utilizando las mismas células y las mismas
condiciones de fijación y tinción. La determinación de la concentración
correcta de anticuerpos es necesaria para cada diseño experimental y
cada lote de anticuerpos. La titulación debe realizarse antes de utilizar el
anticuerpo en un experimento multicolor (9).
La concentración óptima de anticuerpo para maximizar la sensibilidad,
es especialmente importante en el caso de poblaciones poco teñidas.
Poco anticuerpo y la población positiva no será visible; demasiado
anticuerpo y el fondo (señal inespecífica) será alto o estará disperso. Las
condiciones de preparación de las células fijadas o fijadas y
permeabilizadas- afectarán a la unión del anticuerpo y al fondo, por lo
tanto, las valoraciones deben realizarse en las mismas condiciones.

Es tiempo de: citometría de flujo 11

 Anticuerpos: ¿con qué lo voy a buscar?

Para determinar el título óptimo del anticuerpo de tinción se

recomienda realizar una dilución en serie del anticuerpo. Si no se sabe
de dónde comenzar, un volumen genérico de partida es el de 10
μg/mL, que luego se diluye en serie 1:2 para 6-8 pasos de dilución
(Figura 6) (2)

Figura 6: Titulación de anticuerpos monoclonales para citometría de flujo. La

concentración óptima es aquella que permite separar la población negativa de la
positiva.

Es tiempo de: citometría de flujo 12

 6.Fluorocromos:
Un mundo de colores.
Los fluorocromos son moléculas que pueden absorber energía luminosa a
longitudes de onda específicas y reemitirla en forma de luz a longitudes
de onda superiores (9). Algunos fluorocromos son reactivos en sí mismos,
es decir, reaccionan específicamente con determinados componentes
celulares. Algunos ejemplos son los colorantes para ácidos nucleicos,
proteínas y lípidos.

6.1 Espectro de absorción:

El espectro de absorción y el coeficiente de extinción determinan cuánta
luz absorbe un colorante a la longitud de onda de excitación (dada por la
fuente de luz del instrumento de fluorescencia) (12).

6.2 Espectro de emisión:

El espectro de emisión determina dónde se emite la luz de fluorescencia
(longitud de onda) y qué detector (combinación de filtros) la medirá (12).

6.3 Algunos fluorocromos o compuestos fluorescentes pueden ser:

6.3.1 Colorantes de unión al ácido nucleico. (ADN):

El principio de la identificación de células muertas mediante colorantes

de unión al ADN se basa en el concepto de que estos colorantes son
impermeables a la membrana plasmática, por lo que no pueden penetrar
en células viables con membranas intactas. Las células viables excluirán
estos colorantes y por lo tanto mostrarán poca o ninguna fluorescencia
(2).

Es tiempo de: citometría de flujo 13

 Fluorocromos: un mundo de colores

6.3.2 Unión covalente (tándem dyes):

Los conjugados en tándem para citometría de flujo se introdujeron

por primera vez hace más de 20 años Los tándems constan de dos
fluorocromos: un donante y un receptor. Es importante no exponer los
tándems a la luz u otras condiciones que puedan romper el
acoplamiento entre los dos colorantes, ya que un componente donante
desacoplado emitirá en su rango de longitud de onda habitual en lugar
de las longitudes de onda esperadas para el tándem (13).

6.3.3 Quatum dots (QD):

Los QD se derivan de materiales semiconductores (cadmio, selenio y
telurio) que se ensamblan en cristales a escala nanométrica como
resultado de un complejo proceso de producción. Variando una etapa
de incubación a alta temperatura (>300 °C), o alterando la mezcla de
materiales precursores, se pueden obtener cristales a escala
nanométrica. Esto tiene importantes consecuencias, ya que el tamaño
del nanocristal dicta la longitud de onda de la fluorescencia emitida.
(14).

Figura 7: Compuestos fluorescentes utilizados en citometría de flujo.

Es tiempo de: citometría de flujo 14

 7.Muestras:
¿Dónde lo voy a buscar?
Un punto muy importante al realizar ensayos de citometría de flujo se
trata de seleccionar y conocer la muestra a utilizar. Saber cómo está
compuesta, si es una muestra homogénea (células purificadas) o una
muestra heterogénea que contenga varias poblaciones celulares
adicionales a la población de interés. La muestra más utilizada
frecuentemente para los ensayos de identificación celular, es la muestra
de sangre venosa periférica anticoagulada con ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA), mientras que para los ensayos
funcionales el anticoagulante de preferencia es la heparina sódica, ya que
la actividad quelante del calcio del EDTA podría interferir con los procesos
a evaluar provocando falsos negativos.
Otras muestras a evaluar pueden ser: medula ósea, células monoculares
de sangre periférica, líneas celulares o células provenientes de tejido
(figura 8)

7.1 Tejido
La preparación de células individuales es una parte crucial de cualquier
experimento de citometría de flujo de tejidos sólidos. El objetivo de la
preparación de una suspensión de células individuales es aislar
rápidamente las células de los tejidos y teñirlas o etiquetarlas para su
adquisición mediante citometría de flujo, evitando al mismo tiempo la
muerte celular y la agregación. Este procedimiento debe producir una
población celular con alta viabilidad, mínimos restos o agregados
celulares y antígenos de superficie celular preservados para que el
inmunofenotipaje por citometría de flujo sea eficaz (15).

Figura 8: muestras biológicas utilizadas en citometría de flujo.

Es tiempo de: citometría de flujo 15

 8. Aplicaciones de la
citometría de flujo.
Las aplicaciones de la citometría de flujo son amplias y variadas. El
único requisito es que la muestra consista en células o partículas
individuales y que éstas tengan un tamaño o una fluorescencia
adecuada para ser detectadas dentro de los límites de la
instrumentación (16).
La mayoría de las aplicaciones de citometría de flujo se basan en el
monitoreo de la fluorescencia, y los parámetros medibles pueden ser
intra o extracelulares, para ello se emplean marcadores fluorescentes y
se requiere que previamente al análisis las células sean teñidas. Es de
esta manera que se pueden evaluar un sin número de características
celulares, no solo de forma fenotípica, sino también funcional, lo cual
representa una gran ventaja de esta técnica sobre otras, y lo cual
genera como resultado que sea una herramienta que ha ganado un gran
terreno en el campo de la evaluación y optimización de los procesos
biotecnológicos (17).

Uno de los principales usos de la citometría hoy en día es el

inmunofenotipaje, el cual es el estudio de las proteínas que se
encuentran en la superficie celular mediante el uso de anticuerpos. El
fenotipo es definido por los patrones y niveles de expresión de las
moléculas (18).
Otras de las aplicaciones incluyen ensayos que permiten evaluar la
funcionalidad de la población celular seleccionada o los cambios de
esta frente a diferentes estímulos (Figura 9).

Es tiempo de: citometría de flujo 16

 Figura 9 : aplicaciones más comunes de la citometría de flujo.

9.Flujograma de trabajo en citometría de flujo.

Figura 10: paso a paso de un protocolo simple para citometría de flujo.

Es tiempo de: citometría de flujo 17

 Contactos
@CYTOSORI
soriuskamayora@gmail.com

Es tiempo de: citometría de flujo 18

 Referencias

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