Resultados de las pruebas de la Familia Gómez

SUPUESTO PRÁCTICO
Dos amigos que estaban jugando al fútbol en un partido entre familias se empiezan a
encontrar mal con síntomas aparentes de infarto, incluyendo dolor en el pecho, uno de
ellos comienza incluso a tener dificultades respiratorias, y en vista de esto sus familiares
directos deciden llevarlos a urgencias.

Nada más llegar a su hospital de referencia a los distintos sujetos se les administra una
inyección intramuscular de Metamizol magnésico (genérico del medicamento Nolotil)
para aliviar el dolor.

El Dr. Gordo, debido a la sintomatología que presentan ambos pacientes decide

realizarles una serie de preguntas sobre sus antecedentes médicos y los de sus familiares
para determinar qué pruebas deberían llevarse a cabo para obtener el mejor diagnóstico.

Datos clínicos:
Familia Aguirre (A):
- Antecedentes cardiacos graves.
- Algunos miembros de la familia, tanto hombres como mujeres, han sufrido
muerte súbita del deportista.
- Los infartos, cuando se dan, son siempre muy severos y casi siempre letales.
- Tanto hombres como mujeres son buenos deportistas.

Familia Gómez (G):

- Sin antecedentes de problemas cardiacos graves.
- Algún infarto, no demasiado severo, casi siempre en varones y casi nunca en
mujeres.
- Las mujeres de esta familia son buenas deportistas.
- Los hombres suelen practicar deportes, pero, hasta ahora, ninguno ha
destacado nunca (especialmente en el fútbol).

En base a los datos clínicos recopilados, el Dr. Gordo decide realizar un estudio
completo, dado que sospecha que los pacientes podrían tener un trastorno de origen
genético. Para ello, decide llevar a cabo un diagnóstico preventivo solicitando a los
pacientes (A1, G1), y a un grupo de familiares directos (que serán analizados como
individuos control: A2, A3, A4, G2, G3, G4): sangre y una biopsia muscular para una
batería de pruebas diagnósticas. Los familiares incluidos en el estudio no han
presentado síntoma alguno y por tanto no se les ha aplicado ningún tipo de tratamiento.

Solicitud de las pruebas a realizar para completar el diagnóstico:

1.- Diagnóstico de Infarto Agudo de Miocardio: Medida de actividades enzimáticas en
suero.
2.- Medida de la actividad enzimática de la cadena respiratoria en músculo.
3.- Identificación de una deleción en el gen NDUFV2 mediante PCR genómica.
4.- Determinación de expresión específica de tejido de NDFUV2 y Tn-T cardiaca
mediante RT-PCR.
5.- Determinación de expresión especifica de tejido de NDFUV2 y Tn-T cardiaca
mediante Western Blot.
6.- Identificación de una mutación puntual en el gen de la Tn-T cardiaca mediante
RFLP.

María Valbuena Castillo

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1.- Diagnóstico de Infarto Agudo de Miocardio: Medida de actividades enzimáticas

en suero.
A partir de una de las muestras de sangre extraídas de los pacientes se realiza un análisis de la
actividad enzimática en suero de las enzimas CK, CK-MB, LDH y GOT. Se obtuvieron los
siguientes resultados:

Actividad Paciente *G2 *G3 *G4 Limite valor

enzimática (G1) normal
CK total 621 92 71 88 100 UI/l**
CK-MB 0 0 0 0 10 UI/l
LDH 343 478 332 388 400 UI/l
GOT 121 11 11 10 40 UI/l
* Individuo control
**UI/l (moles de producto / min de reacción y litro de suero)
Coeficiente de extinción NADPH: 6,22 mM-1 cm-1

1.- Calcula la actividad enzimática del isoenzima CK-MB en el suero analizado en UI / litro de
suero (moles de producto / min de reacción y litro de suero) según la siguiente fórmula.

6,22

A=  x L x C

Ag1= 0 min-1

Ag2= 0 min-1

Ag3= 0 min-1

Ag4= 0 min-1

La actividad CK MB= 0 VI/litro

2.- Teniendo en cuenta los valores normales de actividad CK-MB sérica, ¿podría provenir
alguna de las muestras analizadas de un paciente con IAM?

No, ya que en los 4 individuos se dan valores de la actividad de la CK-MB dentro de los
límites normales

María Valbuena Castillo

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3.- En un sistema enzimático acoplado, para que la determinación de actividad enzimática del
primer enzima sea correcta, ¿qué condiciones se han de cumplir respecto a los sustratos
auxiliares?

Los sustratos auxiliares deben encontrarse en condiciones saturantes y

así se va a poder analizar correctamente la actividad enzimática de la
creatin kinasa

4.- ¿Y respecto a los enzimas auxiliares?

Las enzimas auxiliares tienen que cumplir:

- Deben ser irreversibles

- No producir el producto que estamos analizando

- No consumir el producto que estamos analizando

- Saturación para que su actividad sea óptima

María Valbuena Castillo

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2.- Medida de la actividad enzimática de la cadena respiratoria en músculo.

A partir de una biopsia muscular se purificaron mitocondrias y se midió la actividad enzimática
de los cuatro complejos de la cadena respiratoria mitocondrial. Se obtuvieron los siguientes
resultados:

Actividad Paciente *G2 *G3 *G4 Limite valor

enzimática (G1) normal
CI + Inespecífica 32-58 UI/mg #
CI 53,69 12,86 40 12,32 27-53 UI/mg
CII 44 51 49 56 42-60 UI/mg
CIII 261 198 237 212 165-279 UI/mg
CIV 181 192 154 133 130-195 UI/mg
*Individuo control
C: Complejo
#UI/mg (nanomoles de producto / min de reacción y miligramo de proteína)
Concentración de proteína en el extracto: ___mg/ml
Coeficiente de extinción NADH: 6,22 mM-1 cm-1

1.- Calcula la actividad enzimática del CI de la CR en la muestra analizada en nanomoles de

producto / min de reacción y miligramo de proteína) según la siguiente fórmula.

nanomol /
mmol

nanomol 6

6,22

2.- Teniendo en cuenta los valores normales de actividad de los 4 Complejos, ¿presenta alguna
de las muestras en estudio un déficit en la actividad de alguno de los complejos de la CR?

Si, los individuos que presentan un deficit en la actividad del complejo I son G2 y G4

3.- ¿Qué es la rotenona? ¿Para qué se utiliza en la medición de la actividad del CI de la CR?

La rotenona es un inhibidor del CI de la cadena respiratoria. Se utiliza para medir la

actividad inespecífica de oxidación del NADH+. Calculando la diferencia entre la
actividad sin rotenona y con rotenona sabemos la actividad del complejo I

3.- Identificación de una deleción en el gen NDUFV2 mediante PCR genómica.

María Valbuena Castillo

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A partir de DNA genómico extraído de sangre de los individuos se realizó un ensayo de PCR
genómica para analizar la posible presencia de una pequeña deleción, aproximadamente 50 pb,
en en una región reguladora de la transcripción en posición 5’ del gen NDUFV2. A
continuación se muestra el resultado de la visualización mediante electroforesis en agarosa del
producto amplificado para los diferentes sujetos.

G1 G2 G3 G4

400 pb -

300 pb -
200 pb -
100 pb -

4.- Determinación de expresión específica de tejido de NDFUV2 y Tn-T cardiaca

mediante RT-PCR.

A partir de RNA extraído de sangre de los individuos se realizó un ensayo de RT-PCR para
poder analizar la expresión en sangre de los dos genes en los sujetos en estudio. A continuación
se muestra el resultado de la visualización mediante electroforesis en agarosa de los productos
amplificados para los diferentes individuos. El ensayo y la posición de los cebadores se
describen en el cuaderno de protocolos.

Los tamaños de los fragmentos de DNA amplificados para

los diferentes genes son: NDFUV2 350 pb, Tn-T cardiaca
400 pb y -actina 200 pb.

1.- Interpreta los resultados del estudio de los

genes NDUFV2 y Tn-T cardiaca en la familia
Goméz. Clasifica genéticamente a los individuos
según la presencia o no de alteraciones
genómicas.

NDUFV2 Tn-T

G1 +/+ +/+ Sin alteraciones

G2 -/- +/m Homocigoto para deleción gen Ndufv2

TnT-T (AD) ha sufrido infarto en el pasado

G3 +/- +/+ Portador delección Ndufv2

G4 -/- +/+ Homocigoto para deleción Ndufv2

2.- ¿Para detectar deleciones únicamente se puede emplear como material de partida el DNA?
Razona la respuesta.

María Valbuena Castillo

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Si las deleciones se encuentran en los exones se emplea mRNA y RT-PCR pero si las
delecciones afectan al tamaño de la proteína se utiliza Western Blot

3.- Para el análisis de la expresión los genes NDUFV2 y Tn-T cardiaca hemos utilizado RNA
extraído de la sangre de los individuos. ¿Habríamos obtenido el mismo resultado si el material
de partida hubiera sido el RNA de la biopsia de músculo? ¿Y de una biopsia cardiaca? Razona
la respuesta.

Ndufc2 es un un gen que se expresa en todos los tipos celulares por lo que sí que
hubiéramos tenido los mismos resultados en una biopsia de músculo que en una cardiaca.
En cambio, Tn-T es específico de músculo miocárdico por lo que no se encuentra en la
sangre ni en el músculo esquelético, entonces, los resultados sí que hubieran variado

4.- ¿Para qué sirve la amplificación de beta-actina?

La B-actina es una proteína que se utiliza para normalizar los niveles y eliminar los
errores de pipeteo, extracción… Es un control de calidad de la muestra utilizada

5.- En el supuesto de que algunos de los individuos tuvieran una mutación puntual, ¿qué se
observaría en el gel de la electroforesis del ensayo de PCR genómica? ¿Por qué?

No se observaría nada diferente en el caso en el que hubiera una mutación puntual

ya que no varía el tamaño del DNA y por eso no podríamos diferenciarla en la
electroforesis.

María Valbuena Castillo

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5.- Determinación de expresión especifica de tejido de NDFUV2 y Tn-T cardiaca

mediante Western Blot.

Para determinar si hay alteraciones en la expresión debidas a la posible presencia de mutaciones

en los genes de NDUFV2 y de la Tn-T cardiaca, se analizó la expresión de ambas proteínas y de
-tubulina, como control de carga, por Western Blot a partir de extractos de proteínas
procedentes de biopsias musculares. A continuación se muestra el resultado para los diferentes
individuos.

- Expresión de NDUFV2.

G1 G2 G3 G4

- Expresión de Tn-T cardiaca y -tubulina.

Paciente Controles
G1 G2 G3 G4

TnT

α-Tubulina

María Valbuena Castillo

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6.- Identificación de una mutación puntual en el gen de la Tn-T cardiaca mediante

RFLP.
Para analizar la presencia de la mutación T340A en el gen de la Tn-T cardiaca mediante RFLP
se llevó a cabo una PCR genómica seguida de una digestión con el enzima de restricción BdaI.
La presencia de la mutación T340A, que produce el cambio de Fenilalanina por Isoleucina,
causa la aparición de un nuevo sitio de restricción para este enzima. El alelo normal no es
digerido por el enzima y el producto de PCR mantiene su tamaño de 217 pb (Figura 1). El alelo
mutante, que sí es digerido, da lugar a tres fragmentos, 177 + 36 + 4 pb. Los fragmentos de 36 y
4 pb no se visualizan en el gel de agarosa de debido a su pequeño tamaño.

Figura 1.

Esquema de la secuencia amplificada en la PCR genómica. Se muestran las secuencias con y sin mutación
correspondientes a la región amplificada del gen de la Tn-T cardiaca. Subrayado y en negrita se destaca el sitio de
reconocimiento del enzima Bda I (TGANNNNNNTCA). La punta de flecha vertical indica la mutación T340A que
causa la aparición de esta diana de restricción en el mutante. Nota: Para que aparezca el sitio de restricción del
enzima BdaI, el cebador introduce tres cambios de nucleótido/base, destacados en negrita. BdaI corta a 12 pb por
delante y por detrás del sitio de restricción lo que produce un fragmento de 36 pb.

A continuación se muestra el resultado de la visualización mediante electroforesis en agarosa

del producto amplificado del gen de la Tn-T cardiaca tras la digestión enzimática.

Paciente Controles

M G1 G2 G3 G4
TnT

TnTD

M: Marcadores de DNA

1.- Interpreta los resultados del estudio de la expresión de las proteínas NDUVF2 y Tn-T
cardiaca mediante Western Blot en la familia Gómez. ¿Cómo encajan estos datos de la
identificación de una mutación puntual en el gen de la Tn-T cardiaca mediante RFLP?

En la RFLP aparece una mutación en G2 pero en el Western Blot no aparecen diferencias

entre individuos.

2.- ¿Cómo explicarías el que se detecte por Western Blot la Tn-T cardiaca en una extracto de
proteína obtenido a partir de una biopsia muscular?

Las isoformas de TnT muscular y cardiaca son muy similares y los anticuerpos primarios
sufren reactividad cruzada al tener baja especificidad. Los epítopos reconocidos por los
anticuerpos son comunes

María Valbuena Castillo

Resultados de las pruebas de la Familia Gómez

3.- ¿La técnica de RFLP se puede utilizar para el análisis de deleciones/amplificaciones?

Razona la respuesta.

Se pueden utilizar solo sí existen cambios en dianas de restricción, las inserciones o

delecciones afectan a los sitios de restricción. Sí las delecciones son detectables por
electroforesis es más fácil la PCR genómica.

4.- ¿Se podrían utilizar los cebadores usados en el ensayo de RFLP para detectar la presencia
del mensajero de NDUVF2 por RT-PCR? Razona la respuesta.

No, los primers se utilizan en el análisis de Tn-T no de Nduvf2. Si tuviéramos primers

para Ndufv2 sí se podrían utilizar en RT-PCR primers que hibriden con el mRNA

María Valbuena Castillo

Resultados de las pruebas de la Familia Gómez
A1 A2 A3 A4 G1 G2 G3 G4 Diagnóstico

CK-MB (suero) Elevada Normal Normal Normal Normal Normal Normal Normal Infarto agudo
miocardio

CK total (suero) Elevada Normal Normal Normal Elevada Normal Normal Normal

GOT (suero) Elevada Normal Normal Normal Elevada Normal Normal Normal

LDH (suero) Normal Normal Normal Normal Normal Elevada Normal Normal

CI (músculo) Normal Normal Disminuida Normal Normal Disminuida Normal Disminuida Poca actividad CI

CII, CIII, CIV (músculo) Normal Normal Normal Normal Normal Normal Normal Normal

Ndufv2 DNA (deleción 50 bp) ++ ++ - - +- ++ - - +- - -

Ndufv2 mRNA (sangre) Normal Normal Normal Normal Normal Normal Normal Normal Detección no
afecta a
transcripción en
sangre
Ndufv2 proteína (músculo) Normal Normal Disminuida Normal Normal Disminuida Normal Disminuida Detección afecta a
traducción en
músculo
Tn-T DNA (T340A) +/m ++ ++ +/m ++ +/m ++ ++ Mutación
autosómica
dominante
Tn-T mRNA (sangre) - - - - - - - - En sangre –
Solo está en ms.

Tn-T proteína (músculo) Normal Normal Normal Normal Normal Normal Normal Normal Solo sabemos si
está presente

María Valbuena Castillo

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RESULTADOS

A1 Infarto reciente (elevada CK-MB) recibe inyección IM (elevada got y Ck total) y cardiomiopatía (alelo 340)

A2 Normal

A3 Enfermedad mitocondrial

A4 Portador de la delección Ndufv2 y tiene cardiomiopatía

G1 Normal recibe inyección IM (elevada got y Ck total)

G2 Infarto pasado (elevada Ldh marcador retrospectivo) y enfermedad mitocondrial y cardiomiopatía.

G3 Portador de la deleción Ndufv2

G4 Enfermedad mitocondrial

María Valbuena Castillo