Primera Unidad Fundamentos Bioquímicos, Enzimología y Biología Molecular de las membranas biológicas

PRACTICA N° 03a
- ABSORCIÓN DE CARBOHIDRATOS Y GLICEMIA - -

INTRODUCCION:
La glucosa es la fuente de energía más importante del organismo, especialmente para algunos tejidos altamente especializados
como el cerebro y los glóbulos rojos que constituyen su única fuente de energía. Por tanto, nuestro organismo dispondrá de una
compleja maquinaria metabólica que asegure mantener constante la concentración de glucosa en la sangre y con ello, el aporte
permanente de este sustrato a los tejidos.

La glucosa sanguínea, proviene de dos fuentes: una de origen exógeno de los alimentos, y otra de origen endógeno del hígado
por glucogenólisis y de la gluconeogénesis. Se ha demostrado que la glucosa se gasta cuando es removida de los tejidos
periféricos (para su consumo) y por excreción renal por la orina; por tanto, la concentración de glucosa sanguínea dependerá
del balance entre el aporte y el gasto de la misma en el organismo.

El mantenimiento constante de la concentración de glucosa sanguínea depende de la interacción de diversos factores como la
absorción, producción endógena de glucosa, así como la utilización y excreción de la misma. El transporte de glucosa a través
de la membrana apical de las células de la mucosa intestinal se realiza ligado al sodio, en un mecanismo dependiente de
energía empleando una proteína transportadora para ambas moléculas llamada SGLT, requiriendo de alta concentración de
sodio en la luz intestinal para que se realice dicho mecanismo.

El transporte de glucosa al interior de las células se realiza por un mecanismo diferente al que se lleva a cabo en las células
intestinales; en el caso del hepatocito, célula muy permeable a la glucosa, el mecanismo estará asociado a difusión simple;
mientras que, en la mayoría de los demás tejidos, en particular en el tejido adiposo, corazón y músculo esquelético dicho
transporte estará dado por difusión controlada mediada por receptores asociados a la familia GLUT.

El conocimiento de la concentración de glucosa en sangre (glicemia) es importante no sólo porque permite tener una idea
integral del mecanismo de homeostasis metabólica existente, sino porque las variaciones de ella son expresiones de diversos
estados patológicos que se deben investigar y diagnosticar para su tratamiento. Los valores normales de glicemia son variables
de acuerdo al método utilizado; según el método de Folin Wu los niveles varían entre los 80 – 120 mg%; mientras que con el
método de la glucosa oxidasa la concentración varía entre 70 – 110 mg/dl.

FUNDAMENTACIÓN DE LA TECNICA.
La técnica empleada en la determinación de la glucosa en sangre es una técnica enzimática, basada en la siguiente reacción:
GOD POD
Glucosa + O2 + H2O ácido glucónico + H2O2; 2H2O2 + 4-AF + 4-Hidroxibenzoato Quinonimina roja

FINALIDAD.
 Demostrar la digestión y absorción de la glucosa, cuantificando la glicemia pre y postprandial, por el método de Glucosa
oxidasa; tanto en personas normales como en casos patológicos.

COMPETENCIA A LOGRAR POR EL ESTUDIANTE.

 Comprende como se demuestra la digestión y absorción de la glucosa, cuantificando la glicemia pre y posprandial por el
método enzimático.

MATERIAL, EQUIPO y REACTIVOS.

 Material de vidrio: tubos de ensayo, pipetas milimétricas.
 Equipo de extracción de muestra: guantes, alcohol, algodón, agujas N° 20, jeringas x 5 cc.
 Equipos: centrífuga, micropipetas, baño maría, espectrofotómetro.
 Reactivos:
 Reactivo A: Solución conteniendo glucosaoxidasa, peroxidasa, aminofenazona, hidroxibenzoato y buffer fosfato
pH: 7
 Estándar: solución de glucosa 1g/l. (100 mg/dl)

PROCEDIMIENTO.
1) Extracción de muestras: previa limpieza de la zona con alcohol, se extraerá 5 cc de sangre de la flexura del codo con jeringa
hipodérmica de 5 cc y aguja N° 20 en dos momentos:
 La primera extracción se realizará con la persona en ayuno de 4 a 8 horas.
 La segunda se realizará después de la ingesta alimenticia, una hora después como máximo.

2) Una vez obtenidas las muestras, colocarlas en tubos de ensayo y dejarlas reposar durante 10 minutos.

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3) Terminado el reposo, contrapesar los tubos conteniendo las muestras y centrifugarlos a 3000 RPM durante 10 minutos.

4) Finalizado el centrifugado separar el suero para trabajar la determinación.

5) Rotular previamente los tubos de ensayo y preparar el siguiente sistema agregando lo que se indica:
TUBOS DE ENSAYO
COMPONENTES (en ml)
B S Dpre (1) Dpos (2)
Estándar -- 10 ul -- --
Muestra 1 (suero preprandial) -- -- 10 ul --
Muestra 2 (suero posprandial) -- -- -- 10 ul
Reactivo A 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Incubar 5 minutos a todos los tubos de ensayo en baño maría a 37 °C
Observar los resultados en cada uno de los tubos (considerar cambio de color).
Leer en espectrofotómetro a 505 nm, llevando el aparato a cero con el blanco. Anotar los
resultados.

RESULTADOS.
1) Luego del Incubado:

B S D1 D2

2) Lecturas del espectrofotómetro: de las muestras de un paciente adulto en ayunas y posingesta alimenticia.
Glucosa [505 nm]
Muestra Muestra
Blanco Estándar
Preprandial Postprandial
0.000 0.220 0.225 0.298

ACTIVIDADES A DESARROLLAR POR EL ALUMNO.

1) Cálculos de los resultados:
 Cálculo del factor:
100mg /dl
F=
S
 Cálculo de la concentración de glucosa. (de cada una de las muestras).
Glucosa (mg/dl) = D x F

2) Interpretación de los resultados.

 Valores Referenciales:
 Suero o Plasma (adultos): 74 – 106 mg/dl.

3) Explique bioquímicamente lo encontrado.

PREGUNTAS DE APLICACIÓN.
1) Identifique las variables que intervinieron en el experimento realizado en la práctica.
2) Mediante un mapa mental, identifique los componentes del sistema enzimático empleado en la práctica y
señale sus principales características.
3) Confeccione un cuadro comparativo explicando cómo afecta el ayuno y el estado posprandial a la
concentración de la glucosa en sangre y que vía metabólica activa.
4) Esquematice un transportador de glucosa de la familia SGLT y GLUT, señalando sus componentes.
5) Analice los datos. Mujer de 54 años, que acude con las siguientes lecturas de absorbancia: Estándar =
0.240, Muestra preprandial = 0.446 y muestra postprandial = 0.523. Interprete y de una explicación bioquímica.

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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
1) Murray R. Harper Bioquímica Ilustrada. 31° edición, México 2019.
2) ADA, estándares para Diabetes 2020. Diabetes Care.
Disponible: https://care.diabetesjournals.org/content/44/Supplement_1
3) Vademecum Wiener Lab, Rosario, Argentina. Disponible: http://files.wiener-lab.com/Vademecum_completo_espanol.pdf
4) Alpaca H, J García. Guía de Práctica de Bioquímica. UNT 2007.
5) Huamán J. Laboratorio clínico. Procedimiento e interpretación. 2° edición, Trujillo 2018.