PRACTICA Nº 3

PROTEINAS II
RELACION DE EXPERIMENTOS
1.- Determinación de las proteínas totales del suero sanguíneo
2.- Desnaturalización de proteínas y actividad biológica
3.- Identificación de la presencia de proteínas en la orina
4.- Electroforesis de las proteínas del suero sanguíneo

INTRODUCCIÓN
La determinación de las proteínas totales del suero sanguíneo es un
procedimiento de rutina del laboratorio clínico. Hay diversos métodos para hacerlo,
sin embargo, aquellos que utilizan ciertas reacciones de color, son los más
difundidos. Uno de ellos es el que utiliza la reacción de Biuret.
Desde hace mucho tiempo se conoce qué al calentar la urea hasta 180°C, se
descompone para rendir amoniaco y un compuesto denominado biuret. Este último,
en presencia de iones cúpricos y en medio alcalino, rinde una coloración violeta.
No solamente el biuret es capaz de dar esta reacción, otras sustancias que tienen
dos radicales CONH2 o CH2NH2, también pueden hacerlo; incluso estos radicales
están unidos mediante átomos de carbono o de nitrógeno. De la misma manera, los
péptidos con más de dos enlaces peptídicos dan positividad a esta reacción, que es
comúnmente conocida como la reacción de Biuret.
Con aplicación de la reacción de Biuret se ha estandarizado un método para la
determinación de las proteínas totales del suero sanguíneo y que se utilizará en la
presente práctica. Los valores normales para este método son de 6 a 8 g%. Por
debajo de 6 g% se habla de hipoproteinemia y por encima de 8g% hablamos de
hiperproteinemia.
A pesar de existir una concentración tan alta de proteínas en el suero,
normalmente no se detectan proteína en la orina, explicable por la incapacidad de las
proteínas (macromoléculas) de atravesar los poros de la membrana basal del
glomérulo renal. Por esta razón el encontrar proteínas en cantidades demostrables en
la orina de un paciente, es una situación de mucho cuidado desde el punto de vista
médico.
Las proteínas pueden ser identificadas en la orina, de amanera muy sencilla, al
calentar una muestra de orina y apreciar la turbidez, lo cual es indicativo de la
desnaturalización de las proteínas por el calor. Sin embargo, debe tenerse en cuenta
que los fosfatos también pueden enturbiar la orina; la distinción puede hacerse
considerando que los fosfatos se vuelven solubles en medio ácido.
 En muchos casos no resulta suficiente hacer la determinación de las proteínas del
suero sanguíneo, sino que es también necesario establecer las concentraciones de las
diferentes fracciones proteicas. En este sentido, se usa un procedimiento
denominado electroforesis de las proteínas del suero, que nos permite aislar las
diferentes fracciones y cuantificarlas.
El procedimiento separa a las proteínas por la carga que adquieren a un pH
determinado. La velocidad de migración de estas macromoléculas dependerá de la
intensidad de su carga eléctrica, su tamaño y forma, la naturaleza del soporte sobre
el cuál migran, la fuerza iónica del medio, la temperatura, etc. Se entiende que este
procedimiento también será de utilidad para la separación de las proteínas de otros
muestras biológicas.
La electroforesis de las proteínas del suero sanguíneo, como comúnmente se
realiza, determina la separación de 5 fracciones proteicas, que ordenadas en función
de su velocidad de migración, son las siguientes: albúmina, alfa 1 globulina, alfa2
globulina, beta globulina y gamma globulina. La albúmina es la más homogénea, su
peso molecular es de 69,000; su PI es aproximadamente 4,9 y es la de mayor
velocidad de migración. Tiene como función importante su participación en el
equilibrio hídrico y además el transporte de una serie de sustancias como la
bilirrubina, los ácidos grasos, etc. La albúmina también se une a drogas que son
poco solubles en el agua, como barbitúricos, digitálicos, aspirina, etc. Normalmente,
el 50% del calcio plasmático está unido a la albúmina y esto debe tomarse muy en
cuenta para explicar las manifestaciones de hipocalcemia asociadas a las situaciones
en las cuales disminuye la concentración de albúmina plasmática.
Las alfa globulinas incluye dos fracciones electroforéticas, las alfa 1 PI (5.1) y
las alfa 2 (5.5 - 5.8). las principales alfa 1 globulinas, son la proteína C reactiva y las
lipoproteínas de alta densidad (HDL): en tanto que las alfa 2 globulinas son la
haptoglobina, ceruloplasmina y protrombina. La beta globulina (PI 5.4 - 6.3) incluye
la proteína transportadora de fierro (transferrina) y a las lipoproteínas de baja
densidad (LDL). Las gamma globulinas (PI 6.3 - 7.3), contiene las diferentes
inmunoglobulinas, como la inmunoglobulina G (Ig G) que corresponde al 80%, la
inmunoglobulina A (Ig A) que representa un 13% y a otras inmunoglobulinas, que
se encuentran en menor concentración (Inmunoglobulinas M, D, E, etc.).
La técnica más comúnmente usada para la separación de las proteínas del suero
sanguíneo por electroforesis consiste en depositar unos microlitros de suero en una
tira de papel filtro humedecida con buffer barbital pH 8.6. Los extremos de la tira
luego son introducidos en dos recipientes que contienen el mismo tampón y que
están en contacto con los electrodos.
En vista que el PI de todas las fracciones, es menor que el pH del tampón, se
cargarán negativamente y por lo tanto migrarán al polo positivo. Como quiera que la
intensidad de carga de las diferentes fracciones, es distinta, al igual que su tamaño,
migrarán a diferente velocidad. Esto quiere decir que una vez desconectado el
aparato de la fuente eléctrica, quedarán separadas las fracciones y será posible su
identificación si las teñimos con un colorante específico para proteínas (como el
amido black). La cuantificación de cada fracción se hará en función de la intensidad
de color que tiene cada banda y que puede hacerse por diversos métodos, como con
el uso de un aparato llamado densitómetro que nos grafica un pico para cada
fracción y cuya área es proporcional a su intensidad de color.
La tabla siguiente muestra los valores que podemos considerar como normales
tanto en valores absolutos (g%) como en valores relativos (porcentaje). En la tabla 2
se muestran las variaciones en la concentración de las diferentes fracciones
electroforéticas de las proteínas del suero sanguíneo en algunas enfermedades, en
donde este método es de gran ayuda en su diagnóstico.

TABLA 1: VALORES NORMALES PARA LAS DIFERENTES

FRACCIONES PROTEICAS DEL SUERO SANGUINEO SEPARADAS POR
ELECTROFORESIS AL PAPEL
Albúmina Alfa 1 Alfa 2 Beta Gama
globulina globulina globulina globulina
Porcentaje 50 - 58 4-7 7 - 11 11 - 15 14 – 22
Gramos por 100 3.24 - 4.42 0.36 - 0.48 0.5 - 1- 0.72 0.78 - 1.04 0.80 - 1.60
ml de suero

TABLA 2. VARIACION DE LAS FRACCIONES DEL

ELECTROFORETOGRAMA DE LAS PROTEINAS SÉRICAS EN ALGUNAS
ENFERMEDADES.
ENFERMEDAD P.T. Albumi Alfa -1 Alfa - 2 Beta Gama
Infecciones agudas N N A (+)
Endocarditis bacteriana N N A (++)
Plasmocitoma beta N N A (++)
Artritis reumatoide N D (+) A (+) A (++)
Hipogamaglobulinemia NóD N D (++)
Mieloma múltiple A N A (+++)
Síndrome nefrótico D (+) D (++) A (+)
Desnutrición D (+) D (+)
Cirrosis hepática D (+) D (+) A (+)

N : Normal A: Aumento D: Disminución

Rietmann y Daniels señalan que la electroforesis de las proteínas séricas (“serum
protein electrophoresis” SPE), junto con la determinación de las proteínas séricas
totales debe ser considerado como un procedimiento rutinario para cualquier
paciente, como ayuda en el diagnóstico y en el control de la enfermedad que tiene.

EXPERIMENTO 1.
DETERMINACIÓN DE PROTEINAS TOTALES DEL SUERO
SANGUINEO
Objetivos.
Mediante el uso de la reacción de Biuret y la aplicación del método
fotocolorimétrico, hacer la determinación cuantitativa de las proteínas de una
muestra biológica (suero sanguíneo).
Método
Determinación de las proteínas totales del suero por el método de biuret
Procedimiento.
a) A 0,1 ml de suero sanguíneo añadir 1,9 ml de agua destilada y mezclar
b) Medir 1 ml de la solución anterior en un tubo de ensayo y añadir 4 ml
del reactivo de biuret. Mezclar
c) Dejar en reposo 30 minutos y medir la absorbancia en el fotocolorímetro
utilizando filtro verde
d) Preparar al mismo tiempo un blanco, que llevará 1 ml de agua destilada
en lugar del suero diluido
e) Durante el desarrollo de este experimento se proporcionará la lectura del
estándar, que se preparará en la misma forma que la muestra, solo que
en lugar de suero sanguíneo se usará una solución de proteínas, de
concentración 7 g %.

Resultados
Llenar los espacios en blanco :
Lectura bruta Lectura neta

Tubo Muestra ( M ) ___________ ___________

Tubo Blanco ( B ) ___________ ___________
Tubo Estándar ( St ) ___________ ___________

FACTOR DE CALIBRACION : ______________

Concentración de proteína de la muestra: _____ g por 100 ml de suero.

INTERROGANTES
 1. ¿Se puede hacer la determinación fotométrica de la concentración proteica,
sin utilizar una reacción de color? Fundamente su respuesta

2. ¿Cuál es el objeto de preparar el blanco?

3. ¿Por qué se utilizó el filtro verde del fotocolorímetro para medir la

absorbancia de la solución en el experimento 1?

EXPERIMENTO 2.
IDENTIFICACION DE LA PRESENCIA DE PROTEINA EN LA ORINA.
Objetivo:
Aplicar un método sencillo que permita la identificación de la presencia de
proteínas en la orina
Método
Coagulación de las proteínas por el calor
Procedimiento.
a) Medir 5 ml de orina en un tubo de ensayo y calentar hasta la ebullición.
Observar lo que sucede
b) En caso observe enturbiamiento, añada alguna gotas de solución de
ácido acético al 2%. Apreciar si la turbidez persiste o desaparece
c) Haga el mismo procedimiento con todas las muestras de orina que le
serán proporcionadas.

Resultados.
1.- Llene el espacio en blanco escribiendo + cuando hay turbidez y - cuando no
la hay o cuando desaparece la turbidez
ORINA X ORINA Y ORINA Z
Calentando la muestra
Añadiendo Ac. Acético
DIAGNOSTICO

INTERROGANTES.
1.- Puede una proteína coagulada dar la reacción de biuret. Fundamente su
respuesta
 2.- Que puede decir de un líquido biológico que al ser calentado se pone turbio y
con el añadido de unas gotas de limón desaparece su turbidez

EXPERIMENTO 3
DESNATURALIZACION DE PROTEINAS Y ACTIVIDAD BIOLOGICA
Objetivos
1. Verificar como la desnaturalización de la proteína determina la pérdida
de su actividad biológica
2. Verificar la acción de varios agentes desnaturalizantes

Método
Estudio de la actividad de la catalasa de los hematíes en presencia de diversos
agentes desnaturalizantes a través de la producción de oxígeno.

Agentes
desnaturalizantes

Catalasa
X Catalasa
Nativa desnaturalizada
a
H 2O 2 H 2O + ½ O 2 (g)

Figura Nº 3.1 .- Fundamento del método

Procedimiento
a) Rotular 4 tubos de ensayo del 1 al 4 y medir respectivamente, 0,1 ml de
sangre diluida (dos gotas de sangre en 100 ml de agua destilada), 0,1 ml
de sangre diluida hervida, sangre diluida en presencia de Urea 8 M y
sangre diluida en SDS al 3 %
(0,1 ml)
b) Medir en cada tubo 5 ml de peróxido de hidrogeno 0,05 M y mezclar
c) Con ayuda de una varilla de vidrio depositar en el fondo de cada tubo un
circulo de papel filtro y tomar el tiempo que tarda en cada tubo para
subir hasta la superficie
 Resultados
Complete la siguiente tabla:
1 Sangre 2 Sangre 3 Sangre 4 Sangre
diluida diluida diluida con diluida
normal con SDS Urea 8 M hervida
Tiempo que tarda en subir el
papel hasta la superficie

INTERROGANTES
1.- Junto al nombre de cada agente desnaturalizante describa su mecanismo de
acción
a) Urea 8 M
____________________________________________________________
b) SDS :
_____________________________________________________________
c) DTT :
_____________________________________________________________

2.- Escriba la reacción química catalizada por la catalasa

3.- Es la catalasa una proteína simple o conjugada?. Fundamente su respuesta

4.- Con qué experimento (s) podría demostrar que la desnaturalización no afecta
la estructura primaria de la proteína

5.- Que importancia podría tener en clínica la búsqueda de actividad catalásica

en la orina

EXPERIMENTO 4
ELECTROFORESIS DE LAS PROTEINAS DEL SUERO SANGUINEO
Objetivos
1.- Reconocer las diferentes fracciones proteicas que aparecen luego de realizada
la electroforesis de las proteínas del suero sanguíneo
2.- Identificar las alteraciones cualitativas y cuantitativas en el
electroforetograma y proponer un diagnostico en los casos de alteración.
 Método.
Electroforesis de las proteínas del suero sanguíneo en un medio de Buffer
barbital pH 8,6 y usando como soporte papel para electroforesis (papel Watman
N°1).
Procedimiento.
a) Cada mesa dispondrá de varios electroforetogramas y su trazo
densitométrico.
b) Identificar cada fracción y marcar sus límites utilizando lápiz
c) Contando los cuadraditos estimar el área de cada fracción y estimar el
porcentaje del área total que le corresponde.
d) Con el valor de las proteínas totales del suero, que será
proporcionado, estime la concentración absoluta de cada fracción en
g%.

Resultados.
1.- Llene la Tabla con las cifras obtenidas. Junto a cada valor de las cifras
absolutas (g%) anote A(+), A(++),A(+++), D(+), D(++) ó D(+++), según encuentre
aumento o disminución, con respecto a lo normal. Considere (+) cuando el aumento
o disminución es hasta un 10%, (++) cuando el aumento o disminución está entre 10
- 25%; considere (+++), cuando el aumento o disminución sea mayor del 25%.
MUESTRA P.T. Albúmin. Alfa 1 Alfa 2 Beta Gama
A Valor en %
Valor en g %
B Valor en %
Valor en g %
2.- De acuerdo a la tabla 2, el diagnostico probable es:

Muestra A
_______________________________________________
Muestra B
_______________________________________________

INTERROGANTES
1.- Cómo será el electroforetograma de las proteínas del plasma sanguíneo
2.- Si en lugar de buffer de pH 8,6, se emplea otro de pH 3,8, que diferencias
importantes esperaría encontrar en el electroforetograma
3- Si las proteínas totales de una muestra de suero fueron 4.74 g % y el
porcentaje para las diferentes fracciones fue de 23.2%, 8.0 %, 31.1 %, 17.7% y 20.0
% para albúmina, alfa1, alfa2, beta y gamma, respectivamente, estimar la
concentración absoluta de cada una