FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES

LABORATORIO BIOQUÍMICA

Alumno: Código:

Alumno: Código:

Práctica 5: ESTUDIO CINETICO DEL ENZIMA ALFA – AMILASA:

EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN, EL pH Y LA TEMPERATURA SOBRE LA
VELOCIDAD DE UNA REACCIÓN ENZIMÁTICA.

OBJETIVOS DE APRENDIZAJE:

• Reconocer y diferenciar los factores que afectan la velocidad de las reacciones

catalizadas por enzimas.

• Ilustrar el mecanismo por el cual ciertos factores afectan la velocidad de las

reacciones enzimáticas.

• Utilizar aquellos factores que afectan la velocidad de las reacciones enzimáticas

para comprender cómo se regula el trabajo de las enzimas en los organismos
biológicos.

• Discutir los efectos de las variaciones bruscas de factores como temperatura y

pH en el funcionamiento adecuado de los organismos.

1. FUNDAMENTO TEÓRICO
Estudio cinético del enzima α-amilasa: Introducción a la enzimología
La cinética enzimática tiene por objeto el estudio de la velocidad de las reacciones
catalizadas por enzimas, así como los factores que en ella influyen y los
mecanismos por los cuales transcurren las reacciones enzimáticas. La velocidad
de las reacciones enzimáticas se puede medir:
1. Por la cantidad de sustrato que desaparece por unidad de tiempo.

2. Por la cantidad de producto que aparece por unidad de tiempo.

En esta práctica de laboratorio se comprobará la influencia de la concentración del
sustrato [S], del enzima [E], el pH y la temperatura (T °C) sobre la velocidad de la
reacción catalizada por el enzima α-amilasa salival, al hidrolizar los enlaces α-1,4
del almidón.

Para ello nos basaremos en la hidrólisis del almidón por unidad de tiempo,
mediante la prueba de yodo. La prueba de yodo se basa en la coloración oscura
que produce la interacción del almidón con el ión yoduro presente en el reactivo de
Lugol.
Dado que el almidón está integrado por dos fracciones, la amilosa y la
amilopectina, debe tenerse en cuenta las reacciones que ambas producen, así
como sus respectivos productos de hidrólisis, con el reactivo de Lugol.
Basándonos en las reacciones anteriores podemos estudiar el efecto que provocan
en la cinética enzimática la variación de los factores que en ella influyen: [S], [E],
pH y T °C, fundamentalmente.

2. SEGURIDAD DURANTE LA PRÁCTICA

2.1 Normas de seguridad

El estudiante debe referirse al manual de normas de seguridad.

2.2 Equipos de protección personal

Usar durante todo el desarrollo de la práctica los siguientes elementos de seguridad:

• Bata de laboratorio
• Guantes de nitrilo
• Gafas de seguridad
Mantener los elementos personales de seguridad identificados y en buen estado. Está prohibido
su intercambio con los demás compañeros de laboratorio.

2.3 Manejo de Residuos químicos

Tanto por razones de seguridad como por respeto al medio ambiente, es importante disponer los
residuos generados en las prácticas del laboratorio de química en forma adecuada. Por ello el
estudiante debe:

Emplear los recipientes destinados para eliminar los residuos o desechos de laboratorio, los
cuales están debidamente identificados según el tipo de sustancia a desechar.

Verter únicamente los residuos en el recipiente correspondiente para evitar reacciones no

controladas y potencialmente peligrosas.

No arrojar por el desagüe los desechos o residuos químicos obtenidos durante el desarrollo de la
práctica. Si tiene alguna inquietud al respecto comuníquela al responsable del laboratorio, quien le
indicará la forma correcta de hacerlo.
 3. CONSULTAS PREVIAS.
¿Cuáles son las características estructurales del almidón?

¿Qué tipo de enzima es la α-amilasa salival?

¿Cuáles son los productos que origina la acción de este enzima sobre el almidón?
¿Qué tipo de reacción/ interacción se debe dar entre el lugol y el almidón y de qué
forma a través de este proceso se puede determinar la presencia o ausencia de
almidón?
¿Cómo se calcula la velocidad de una reacción a partir de la generación de producto y
del consumo de sustratos?

4. METODOLOGIA

4.1 Materiales

Tabla 1. Listado de materiales necesarios para el desarrollo de la práctica por pareja.

ITEM Cantidad
Gradilla 1
Tubos de ensayo pequeño 15
Pipeta pasteur 5
Vasos de precipitados de 250 mL 2
Vaso de precipitados de 25mL 1
Erlenmeyer de 50mL 1
Probeta 25 mL 1
Pipetas graduadas de 2mL, 5mL y 10mL 1 de c/u
Pipeta graduada de 1mL 2
Propipeta 1
Termómetro 1
Pinza para tubos de ensayo 1
Cronómetro 1
Frasco lavador 1
Varilla de vidrio 1
Placa de aglutinación 2
Estufa 9 para todo el salón
Erlenmeyer de 25mL con tapa 2 para todo el salón
Vaso de precipitados de 250mL 1 para todo el salón
4.2 Reactivos

Tabla 2. Listado de reactivos necesarios para el desarrollo de la práctica por pareja.

Reactivos Cantidad
Lugol (en frasco ámbar con tapa gotero) 25mL
Almidón al 0,5% 30mL
Soluciones tampón de pH 4 2 mL
Soluciones tampón de pH 7 2 mL
Agua destilada 50mL
Hielo

5. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Preparación de muestra de amilasa:
• Obtenga aproximadamente 1 mL de amilasa salival de su boca en una
probeta y complete hasta 20 mL con agua destilada.

• Esta solución es el EXTRACTO ENZIMÁTICO.

I. Estudio del efecto de la [E] sobre la velocidad de la reacción enzimática.

• Rotule 4 tubos de ensayo y agregue 2 mL de almidón al 0,5%

• Encuentre la cantidad de lugol necesaria para detectar la solución de almidón

proveída en esta práctica. Para ello tome 3 gotas de uno de los tubos
preparados en el punto 1 y adicione 1 gota de lugol. Repita el procedimiento
aumentando a 2 y 3 gotas de lugol. Escoja la menor cantidad que de una
coloración fuerte.

• Llévelos tubos preparados en el paso 1 a 37 °C en baño maría y mantenga la

temperatura constante.

• Agregue en el siguiente orden 2.9 mL, 2.8 mL, 2.7 mL y 2.6 mL de agua
destilada a los tubos de ensayo.

• Luego en el mismo orden, adicione: 0.1 mL, 0.2 mL, 0.3 mL y 0.4 mL del
extracto enzimático. En este momento empieza la reacción (t0)

• En placas para ELISA, tome 3 gotas de cada reacción y agrégueles 1 gota

de lugol (o la cantidad que usted determinó apropiada). Repita este
procedimiento cada 2 minutos durante los primeros 20 minutos de reacción.
Para los 40 minutos restantes tome muestras cada 10 minutos.
 • Tiendo en cuenta la escala presentada en la Figura 1 asígnele un valor a
cada muestra según la coloración que observa y consigue sus resultados en
la bitácora en una tabla como la que se muestra en la Tabla 3.

Figura 1. Escala de colores obtenidos por la interacción entre el lugol y el

almidón hidrolizado y sin hidrolizar

Consulte con su instructor sus resultado para ajustar los tiempos y volúmenes
de los siguientes experimentos de acuerdo con la velocidad de su amilasa
salival (resultados varían según grupo).

II: Efecto del pH sobre la velocidad de una reacción enzimática.

• En dos tubos de ensayo agregue 2 mL de almidón al 0.5 %, rotúlelos y

agregue 2.8 mL de buffer pH 7.0 a uno y 2.8 mL de buffer pH 4.0 al otro, o
según lo indique su instructor (Si los volúmenes que empleó no son los acá
indicados escríbalo en la bitácora y tenga en cuenta eso a la hora de escribir
su informe).

• Incúbelos a 37 °C en baño maría y mantenga la temperatura constante.

• Agregue 0.2 mL del extracto enzimático a cada Erlenmeyer o según lo

indique su instructor (Si los volúmenes que empleó no son los acá indicados
escríbalo en la bitácora y tenga en cuenta eso a la hora de escribir su
informe). Aquí comienza la reacción (t0).

• En placas para ELISA, tome 3 gotas de la reacción y agrégueles 1 gota de

lugol (o la cantidad que usted determino apropiada), esto para cada reacción.
Repita este procedimiento en intervalos de 3 minutos durante 30 minutos o
según lo indique su instructor.

• Tiendo en cuenta la escala presentada en la Figura 1 asígnele un valor a

cada muestra según la coloración que observa y consigue sus resultados en
la bitácora en una tabla como la que se muestra en la Tabla 4.
III: Estudio del efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática

• Rotule 3 tubos de ensayo, para realizar los experimentos a 4 °C, temperatura

ambiente y 50 °C. Registre la temperatura ambiente en su bitácora según lo
que registra el termómetro.

• Agregue a todos los tubos 2 mL de almidón al 0,5 % y 2.8 mL de agua destilada.

• Al primer tubo llévelo a 4°C en hielo, el segundo a temperatura ambiente y el

tercero a 50 °C en baño maría.

• Agregue a todos los tubos 0.2 mL del extracto enzimático o según lo indique su
instructor (Si los volúmenes que empleó no son los acá indicados escríbalo en la
bitácora y tenga en cuenta eso a la hora de escribir su informe). Aquí comienza
la reacción (t0).

• En placas para ELISA, tome 3 gotas de la reacción y agrégueles 1 gota de

lugol (o la cantidad apropiada), esto para cada reacción. Repita este
procedimiento en intervalos de 2 o 5 minutos durante 30 minutos o según lo
indique su instructor.

• Asígnele valores cualitativos a cada tubo en cada tiempo y consígnelos en la

Tabla 5.

IV: Efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad enzimática

• Tome 4 tubos de ensayo, rotúlelos y agregue en el siguiente orden 1.0 mL,

1.5 mL, 2.0 mL y 3.0 mL de almidón al 0,5%. Llévelos a 37°C en baño maría
y mantenga la temperatura constante.

• Luego agrégueles a cada tubo, en el orden correspondiente: 3.8 mL, 3.3 mL,
2.8 mL y 1.8 mL de agua destilada.

• Agregue a cada tubo 0.2 mL del extracto enzimático. o según lo indique su

instructor (Si los volúmenes que empleó no son los acá indicados escríbalo en la
bitácora y tenga en cuenta eso a la hora de escribir su informe). Aquí comienza
la reacción (t0).

• En placas para ELISA, tome 3 gotas de la reacción y agrégueles 1 gota de

lugol (o la cantidad que usted determino apropiada), esto para cada reacción.
Repita este procedimiento en intervalos de 2 o 5 minutos durante 30 minutos
o según lo indique su instructor.

• Tiendo en cuenta la escala presentada en la Figura 1 asígnele un valor a

 cada muestra según la coloración que observa y consigue sus resultados en
la bitácora en una tabla como la que se muestra en la Tabla 6.

6. RESULTADOS

I. Estudio del efecto de la [E] sobre la velocidad de la reacción enzimática.

Tabla 3 Datos crudos del estudio del efecto de la [E] sobre la velocidad de la reacción
enzimática

Tiempo de reacción Observación

(Min) Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4
(0.1 mL Enz) (0.2 mL Enz) (0.3 mL Enz) (0.4 mL Enz)
0
10
20
30
40
50
60

• Copie la Tabla 3 en su bitácora y durante el experimento vaya ingresando los

valores correspondientes a sus observaciones.

• Con los datos obtenidos construya un gráfico de concentración de sustrato

(corresponde al valor asignado a la coloración observada) en el eje ordenado
contra tiempo en el eje abscisas e incluya la leyenda del gráfico indicando en
volumen de enzima agregada para cada tubo. Incluya las cuatro curvas en el
mismo gráfico para facilitar su comparación

• Calcule la velocidad de la reacción para cada concentración enzimática

teniendo en cuenta la clase de teoría y las consultas previas de la práctica

• Describa lo que observa en la gráfica y los valores de las velocidades

calculadas para cada volumen enzimático.
II: Efecto del pH sobre la velocidad de una reacción enzimática

Tabla 4 Resultados del pH sobre la actividad enzimática

Tiempo de reacción Observación

(Minutos)
pH 7.0 pH 4.0
0

3
6
9
12
15
18
21
24
27
30

• Copie la Tabla 4 en su bitácora y durante el experimento vaya ingresando los

valores correspondientes a sus observaciones.

• Con los datos obtenidos construya un gráfico de concentración de sustrato

(corresponde al valor asignado a la coloración observada) en el eje ordenado
contra tiempo en el eje abscisas e incluya la leyenda del gráfico indicando el
pH en cada tubo. Incluya las dos curvas en el mismo gráfico para facilitar su
comparación

• Calcule la velocidad de la reacción para cada pH teniendo en cuenta la clase

de teoría y las consultas previas de la práctica

• Describa lo que observa en la gráfica y los valores de las velocidades

calculadas para cada pH.
III. Estudio del efecto de la temperatura sobre la velocidad de la reacción
enzimática

Tabla 5 Resultados del efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática.

Tiempo de reacción Observación

(minutos) 4 °C Temperatura ambiente 50 °C
(ºC medido)
0
3
6
9
12
15
18
21
24
27
30

• Copie la Tabla 5 en su bitácora y durante el experimento vaya ingresando los

valores correspondientes a sus observaciones.

• Con los datos obtenidos construya un gráfico de concentración de sustrato

(corresponde al valor asignado a la coloración observada) en el eje ordenado
contra el tiempo en el eje abscisas e incluya la leyenda del gráfico indicando
la temperatura en cada tubo. Incluya las tres curvas en el mismo gráfico para
facilitar su comparación

• Calcule la velocidad de la reacción para cada temperatura teniendo en cuenta

la clase de teoría y las consultas previas de la práctica

• Describa lo que observa en la gráfica y los valores de las velocidades

calculadas para cada temperatura
IV: Efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad enzimática

Tabla 6. Efecto de la concentración de sustrato sobe la actividad enzimática

Tiempo de reacción Observación

(Minutos) Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4
(vol sustrato) (vol sustrato) (vol sustrato) (vol sustrato)
0
3
6
9
12
15
18
21
24
27
30

• Con los datos de la tabla construya un gráfico de velocidad de reacción en el

eje ordenado contra volumen de sustrato en el eje de abscisas (que
representa concentración de sustrato creciente en nuestro experimento).
Recuerde incluir la leyenda del gráfico. OJO! NO ES IGUAL A LOS
GRÁFICOS ANTERIORES

• A partir del gráfico anterior realice el doble recíproco (1/ velocidad vs 1/[S]) e
incluya la leyenda de la gráfica

• Calcule la constante de Michaelis-Menten, la constante catalítica y la

eficiencia (usando el volumen de enzima como concentración) a partir de las
gráficas anteriores, teniendo en cuenta lo visto en clase.

• Realice una tabla con los valores de las constantes de su enzima y las de sus
compañeros e incluya la leyenda correspondiente.

• Describa los resultados de las gráficas haciendo referencia a las mismas y

compare los valores de las constantes calculadas para cada grupo resaltando
la de mayor afinidad al sustrato, la de mayor velocidad y la mas eficiente
haciendo referencia a la tabla
7. ANÁLISIS DE RESULTADOS

I. Estudio del efecto de la [E] sobre la velocidad de la reacción enzimática.

• Describa qué características estructurales del almidón permiten su

identificación mediante las disoluciones de yodo, y el efecto de la amilasa
salival sobre los enlaces del almidón.

• Explique los resultados obtenidos teniendo en cuenta el modelo de la cinética

enzimática descrito por Michaelis-Menten. ¿Se ajustan a lo esperado? Por
qué?

• Consulte con los demás grupos de trabajo las velocidades de reacción

obtenidas para un volumen de 0.2 mL de extracto enzimático y regístrelos en
una Tabla (incluya la leyenda correspondiente). Compare la suya con la de
ellos, identificando la amilasa aparentemente más rápida y la más lenta, y
dando una posible explicación para la variabilidad (si la hay).

II: Efecto del pH sobre la velocidad de una reacción enzimática

• Describa las características generales de la alfa-amilasa tiendo en cuenta:

estructura primaria y tridimensional de la enzima, especificidad de sustrato,
pH óptimo, temperatura óptima y parámetros cinéticos (KM, kcat, Eficiencia). Si
va a incluir imágenes no se le olvide la leyenda correspondiente y
referenciarla en el texto.

• Teniendo en cuenta la información anterior, sus resultados corresponden a lo

reportado para la enzima?

• Teniendo en cuenta las características estructurales de la enzima y la

variación de pH en cada tubo, discuta a que se debe la diferencia en la
velocidad de reacción registrada.

III. Estudio del efecto de la temperatura sobre la velocidad de la reacción

enzimática

• Teniendo en cuenta la información anterior, sus resultados corresponden a lo

reportado para la enzima?

• Teniendo en cuenta las características estructurales de la enzima y la

variación de temperatura en cada tubo, discuta a que se debe la diferencia en
la velocidad de reacción registrada.
 IV: Efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad enzimática

• Teniendo en cuenta la información anterior, sus resultados corresponden a lo

reportado para la enzima? Explique haciendo referencia al modelo de cinética
enzimática de Michaelis-Menten. En caso de presentar diferencias a que se
le podría atribuir?

• Comparando sus resultados con los de sus compañeros, como puede

explicar las diferencias identificadas, en dado caso? Qué implicaciones tienen
esas diferencias a la hora de comer almidón? Ocurriría lo mismo al comer
celulosa? – Explique teniendo en cuenta las características estructurales del
almidón y de la celulosa y las propiedad de la alfa-amilasa

• Consulte sobre el gen de la amilasa salival en humanos comparado con el

de otros primates, y de una explicación de por qué la capacidad de
degradar almidón en la saliva pudo haber sido un factor importante en el
desarrollo de las civilizaciones humanas.
8. BIBLIOGRAFIA.

• Bioquímica de Stryer

• Bioquímica de Lehninger

• http://www.unav.es/acienciacierta/salud/amilasa.html,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2377015/, y
http://blogs.scientificamerican.com/guest-blog/2012/07/23/human-
ancestors- were-nearly-all-vegetarians/).