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Investigación Alimentaria Internacional 175 (2024) 113683

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Tolerancia al frío enCampylobacter jejuniy su impacto en la seguridad alimentaria

Jeong-in-hura,b,1, Jinshil Kima,b,C,d,1,2, Mi Seon Kangmi,F,1, Hyun Jung Kimmi,F,*,

Sangryeol Ryua,b,C,*, Byeonghwa Jeongramo,*
aDepartamento de Biotecnología Animal y Alimentaria, Instituto de Investigación de Agricultura y Ciencias de la Vida, Universidad Nacional de Seúl, Seúl 08826, República de Corea
b Departamento de Biotecnología Agrícola, Universidad Nacional de Seúl, Seúl 08826, República de Corea
CCentro para la Alimentación y la Bioconvergencia, Universidad Nacional de Seúl, Seúl 08826, República de Corea
dDepartamento de Ciencia de los Alimentos y Biotecnología y Centro de Investigación de Bioproductos de Carbohidratos, Universidad Sejong, Seúl 05006, República de Corea
miGrupo de Investigación sobre Seguridad del Consumidor, Instituto de Investigación Alimentaria de Corea, Wanju 55365, República de Corea

FDepartamento de Biotecnología de Alimentos, Universidad de Ciencia y Tecnología, Daejeon 34113, República de Corea
gramoDivisión de Ciencias de la Salud Ambiental, Facultad de Salud Pública, Universidad de Minnesota, St. Paul, MN 55108, EE. UU.

INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO ABSTRACTO

Palabras clave: Campylobacter jejuniEs una causa importante de enfermedades transmitidas por alimentos en todo el mundo y se transmite
Campylobacter jejuni principalmente a los humanos a través de la carne de aves de corral contaminada. Para controlar este patógeno, es fundamental
Seguridad alimenticia
comprender su tolerancia al frío porque los productos avícolas generalmente se distribuyen en la cadena de frío. Sin embargo, existe
Tolerancia al frío
información limitada sobre cómo este patógeno microaerófilo termotolerante puede sobrevivir en ambientes fríos y aeróbicos en la
Aerotolerancia
cadena de frío avícola. En este estudio, investigamos la tolerancia al frío deC.jejunimidiendo la viabilidad de 90C.jejunicepas aisladas de
Patógeno transmitido por los alimentos

Pollo crudo al por menor

pollo crudo al por menor a 4◦C en condiciones aeróbicas y microaeróbicas. A pesar de la naturaleza microaerófila deC.jejuni, en
condiciones aeróbicas,C.jejuniexhibió una mayor viabilidad a las 4◦C y requirió un tiempo de inactivación prolongado en comparación con
las condiciones microaeróbicas. Algunas cepas fueron altamente tolerantes a las temperaturas de refrigeración y exhibieron una mayor
supervivencia a 4◦C. Estas cepas tolerantes al frío pertenecían en su mayoría al complejo clonal de tipificación de secuencia multilocus
(MLST) (CC)-21 y CC-443, lo que indica que la tolerancia al frío está asociada con la filogenia deC.jejuni. En particular, las cepas tolerantes al
frío tenían una mayor probabilidad de enfermarse y eran más propensas a causar infecciones en humanos debido a su supervivencia
prolongada con carne de pollo refrigerada en comparación con aquellas sensibles al estrés por frío. Además, la mayoría de las cepas
tolerantes al frío exhibieron una aerotolerancia elevada, lo que indica que la tolerancia al frío está relacionada con la aerotolerancia. Estos
hallazgos sugieren que la refrigeración de la carne de pollo en condiciones aeróbicas puede no ser efectiva para controlarC.jejuniy ese
tolerante al frioC.jejunipuede suponer un mayor riesgo para la seguridad alimentaria.

1. Introducción
Campylobacter jejunies una bacteria termófila y microaerófila obligada (
Acheson y Allos, 2001; Parque, 2002; Parkhill y otros, 2000) y es una de las
causas bacterianas más frecuentes de gastroenteritis en todo el mundo (
Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria, 2021; Kaakoush y otros, 2015).
Además,C.jejuniEs la causa principal del síndrome de Guillain-Barré, una
neuropatía grave que causa parálisis muscular (Ruzante et al., 2011; Yuki y
Hartung, 2012). Dado que el tracto gastrointestinal de las aves de corral está
los principales reservorios deC.jejuni(Dorado y otros, 2021), infección humana por
C.jejuniLa causa más común es el consumo de carne de ave contaminada (Newell y
Fearnley, 2003; Rosenquist y otros, 2003). Los productos avícolas normalmente se
distribuyen a través de la cadena de frío para minimizar el crecimiento de
deterioro y microorganismos patógenos.Panel de Peligros Biológicos de la EFSA,
2016; Nastasijević y otros, 2017). La frecuente implicación de la carne de ave en la
campilobacteriosis humana implica que
C.jejunidebe superar el estrés por frío y sobrevivir en la cadena de frío
avícola (Kim y otros, 2021). Para mejorar la seguridad alimentaria asociada a

* Autores correspondientes en: Grupo de Investigación sobre Seguridad del Consumidor, Instituto de Investigación Alimentaria de Corea, Wanju 55365, República de Corea (HJ Kim). Departamento de
Biotecnología Animal y Alimentaria, Instituto de Investigación en Agricultura y Ciencias de la Vida, Universidad Nacional de Seúl, Seúl 08826, República de Corea (S. Ryu). División de Ciencias de la Salud
Ambiental, Facultad de Salud Pública, Universidad de Minnesota, St. Paul, MN 55108, EE. UU. (B. Jeon).
Correos electrónicos:hjkim@kfri.re.kr (HJ Kim),sangryu@snu.ac.kr (S. Ryu),bjeon@umn.edu (B. Jeon).
1Jeong
In Hur, Jinshil Kim y Mi Seon Kang contribuyeron igualmente a este trabajo.
2Coautor correspondiente en: Sección de Regulación y Expresión Génica, Laboratorio de Bioquímica y Genética, Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades

Digestivas y Renales, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD 20892, EE. UU.

https://doi.org/10.1016/j.foodres.2023.113683
Recibido el 23 de septiembre de 2023; Recibido en forma revisada el 30 de octubre de 2023; Aceptado el 3 de noviembre de 2023
Disponible en línea el 4 de noviembre de 2023 0963-9969/© 2023
Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.
JI Hur et al.
Campilobacter,Es crucial comprender los mecanismos subyacentes.
C.jejunisupervivencia en ambientes fríos (Chaisowwong et al., 2012;
Stintzi y Whitworth, 2003).
La tolerancia bacteriana a condiciones de estrés amenaza la seguridad
alimentaria al permitir que los patógenos transmitidos por los alimentos hagan
frente a condiciones ambientales adversas durante la transmisión por alimentos.
Begley y Hill, 2015; Ah y otros, 2019).C.jejunies sensible al estrés ambiental
principalmente debido a la falta de proteínas tolerantes al estrés comúnmente
presentes en otros patógenos transmitidos por alimentos bien estudiados (
Battesti et al., 2011; Parkhill y otros, 2000; Spector y Kenyon, 2012). Por ejemplo,
Escherichia coliySalmonela Poseen RpoS, un regulador crucial para responder a
diversas condiciones de estrés, como la privación de nutrientes (Battesti et al.,
2011; Ibáñez-Ruiz et al., 2000), mientrasC.jejunino posee este factor sigma de
respuesta al estrés (Parkhill y otros, 2000).C.jejunies microaerófilo y no puede
crecer en condiciones atmosféricas normales debido a la sensibilidad a los
productos tóxicos del metabolismo del oxígeno (Ataque y Kelly, 2009). Además,
C.jejunies sensible a la desecación (Kusumaningrum et al., 2003) y sobrevive
mal en ambientes de pH bajo (Waterman y pequeño, 1998). Se han descrito
varios mecanismos de defensa enC.jejuni, incluida la formación de
biopelículas (Ah y otros, 2018a), síntesis mejorada de polisacáridos de
superficie en condiciones aeróbicas (Kim y otros, 2023), y la transición
fisiológica a un estado viable pero no cultivable (VBNC) (Tangwatcharin y
otros, 2006). Sin embargo, estos mecanismos no explican completamente
cómoC.jejunisupera los factores estresantes durante la transmisión
alimentaria y está cada vez más implicado en infecciones humanas.
Estudios anteriores han demostrado queC.jejuniLa supervivencia en
ambientes fríos varía dependiendo de la cepa (Hur et al., 2022; Zorman y otros,
2006). Para sobrevivir en ambientes de estrés por frío, los patógenos transmitidos
por los alimentos comúnmente utilizan proteínas de choque por frío (CSP) (
Graumann y otros, 1997; Horton y otros, 2000), que contribuyen a la protección,
desagregación y replegamiento de proteínas dañadas por el frío (Langer y otros,
1992; Rosenzweig et al., 2015; Zolkiewski, 1999). Sorprendentemente,C.jejunies
único porque mantiene la supervivencia bajo estrés por frío, aunque su genoma
no tiene genes que codifiquen CSP (Chaisowwong y otros, 2012). En cambio, las
respuestas al estrés oxidativo parecen desempeñar un papel en la tolerancia al
frío de los animales.C.jejuni. El shock por frío aumenta la expresión de genes
relacionados con las respuestas al estrés oxidativo (Stintzi y Whitworth, 2003).
Nuestro estudio anterior demostró queC.jejuniLas cepas con mayor aerotolerancia
exhiben una mayor tolerancia al frío que las cepas aerosensibles (Ah y otros, 2019
). Sin embargo, se sabe poco sobre los mecanismos y la fisiología bacteriana
detrás de la tolerancia al frío deC.jejuni.
Aquí mostramos queC.jejunimuestra una mayor tolerancia al estrés por frío en
condiciones aeróbicas en comparación con condiciones microaeróbicas, aunqueC.jejuni
es un microaerófilo. El modelado matemático también mostró queC.jejunirequiere un
tiempo de inactivación significativamente mayor a 4◦C en condiciones aeróbicas que en
condiciones microaeróbicas. Además, descubrimos que ciertosC.jejuniLas cepas son
altamente tolerantes al estrés por frío, pueden sobrevivir en carne de pollo refrigerada
durante un tiempo prolongado y tienen más probabilidades de causar infecciones
humanas según la probabilidad de enfermedad resultante de la estimación de riesgo
basada en escenarios. Estos resultados demuestran que refrigerar la carne de ave en
condiciones aeróbicas no controla adecuadamenteC.jejuni, y que la presencia de
tolerantes al fríoC.jejunien la carne de aves de corral puede suponer una grave amenaza
para la seguridad alimentaria.
2. Materiales y métodos
2.1. Cepas y condiciones de cultivo bacteriano
NoventaC.jejuniEn este estudio se utilizaron cepas previamente aisladas de
pollo crudo al por menor para las pruebas de tolerancia al frío (Kim y otros, 2019).
Las cepas se aislaron de 133 productos de pollo crudo recolectados en tiendas
minoristas en siete provincias diferentes de Corea (Kim y otros, 2019).
C.jejuniNCTC 11168 es la primera cepa secuenciada del genoma en
Campilobacter(Parkhill y otros, 2000) y se utilizó como cepa de referencia. El
C.jejuniLas cepas se cultivaron de forma rutinaria en medio Mueller-Hinton (MH)
(Oxoid, Hampshire, Reino Unido) a 42◦C en condiciones microaeróbicas (85%
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norte2, 5% O2,y 10% CO2) generado por Anoxomat (Mart Microbiology BV,
Lichtenvoorde, Países Bajos).
2.2. Prueba de tolerancia al frío
La prueba de tolerancia al frío se realizó como se describió anteriormente (Ah
y otros, 2017). Brevemente, se resuspendió un cultivo nocturno en agar MH en
caldo MH hasta una densidad óptica de 600 nm (OD600) de 0,1 (aproximadamente,
109UFC/mL). La suspensión bacteriana se transfirió a múltiples placas de 96
pocillos en alícuotas de 200 µl. Para evitar la desecación de la muestra, los pocillos
exteriores se llenaron con un volumen igual de agua destilada y se colocó un
recipiente con agua cerca de las placas de 96 pocillos. Se colocaron palos de
madera esterilizados debajo de ambos lados de las tapas de las placas de 96
pocillos para mejorar la circulación del aire. Las placas de 96 pocillos se incubaron
a 4◦C en condiciones aeróbicas o microaeróbicas, y se tomaron muestras después
de 0, 7, 14 y 21 días para dilución seriada y recuento bacteriano. El límite de
detección del ensayo fue<200 UFC/mL.
2.3. Ajuste de distribución estadística
Los datos de reducción logarítmica obtenidos al medir los recuentos viables en
caldo MH se ajustaron utilizando la herramienta BestFit en el software @RISK v7.6
(Palisade Corporation, NY, EE. UU.). Se sugirió la función de distribución estadística
más probable para el conjunto de datos de seis entradas: tres puntos de tiempo
(7, 14 y 21 días) combinados con dos condiciones de aire (aeróbicas y
microaeróbicas). Para elegir la distribución que mejor se ajusta, se utilizó el
Criterio de Información de Akaike (AIC) para cuantificar la bondad de ajuste. Se
utilizó el intervalo de confianza del 90% de los datos de entrada para comparar la
tolerancia al frío de 90C.jejunicepas en condiciones aeróbicas y microaeróbicas.
2.4. Supervivencia de cepas en pollo crudo refrigerado
Supervivencia deC.jejunise determinó como se describió anteriormente (Ah y
otros, 2018b; Ah y otros, 2017). Se prepararon trozos de piel de pollo cruda. (≈1cm
2/pieza) de piel de pollo cruda al por menor cortándola con una tijera esterilizada.
Se sumergieron trozos de piel de pollo crudo en etanol al 70% durante la noche a
4◦C para eliminar contaminantes bacterianos. Los contaminantes restantes los
esterilizamos y el exceso de etanol se secó exponiendo los trozos de piel de pollo a
luz ultravioleta en cada lado durante 30 minutos. Los trozos de piel de pollo
esterilizados y secos se colocaron en placas de 24 pocillos. El
C.jejuniLa suspensión preparada a partir de cultivos nocturnos en agar MH se
diluyó hasta una DO600de 0,01 con solución salina tamponada con fosfato de
Dulbecco sin calcio ni magnesio (DPBS) (GenDEPOT, TX, EE. UU.). Una alícuota de
10 uL de cultivo (ca, 106UFC/mL) se inoculó en la superficie de la piel del pollo. Se
prepararon controles negativos inoculando 10 uL de DPBS en piel de pollo. Se
colocó un palo de madera estéril debajo de ambos lados de la tapa de las placas
de 24 pocillos para evitar el bloqueo de la circulación del aire. Los pocillos
exteriores de las placas de 24 pocillos se llenaron con agua destilada para evitar
que las muestras se sequen durante la incubación. Los trozos de piel de pollo
enriquecidos conC.jejunifueron almacenados a las 4◦C durante 7 días. Todos los
días durante 7 días, se tomó la piel del pollo de placas de 24 pocillos, se transfirió a
tubos de 15 ml que contenían 1 ml de caldo MH fresco y se agitó vigorosamente
durante 2 minutos. Se recogieron los sobrenadantes para dilución en serie y
recuento bacteriano. El límite de detección del ensayo fue<100 UFC/mL.
2.5. Modelado predictivo para la supervivencia de C. jejuni en pollo crudo
refrigerado
Los recuentos bacterianos de cepas sensibles al frío (n = 5) y tolerantes (n = 5)
inoculadas en pollo crudo a las 4◦C en condiciones aeróbicas y microaeróbicas se
utilizaron para desarrollar un modelo predictivo que describe matemáticamente el
comportamiento del patógeno. La curva de supervivencia predictiva de cada
C.jejuniLa cepa se representó utilizando la ecuación de Weibull en la herramienta
de ajuste del modelo de inactivación de Geeraerd y Van Impe v1.6 (GInaFiT) (
Geeraerd y otros, 2005), log10(N) = log10(N)0)-(t/delta)ρ, donde N, número de
bacterias; norte0, número de bacterias al momento de la inoculación; t, tiempo. El
JI Hur et al.
Los parámetros cinéticos, delta y ρ denotan el tiempo requerido para la
primera reducción de 1 log UFC y la forma de la curva (ρ>1, convexo; ρ<1,
cóncavo), respectivamente (Geeraerd y otros, 2005).
2.6. Estimación de riesgos basada en análisis de escenarios.
La probabilidad de enfermedad (Penfermo) como resultado del consumo
de pollo crudo contaminado conC.jejunifue estimado mediante una
simulación de Monte Carlo utilizando @RISK. Para la simulación se construyó
un posible escenario de exposición y el diagrama esquemático se presenta
en Figura S3. El escenario constaba de tres partes principales, donde la
primera parte incluía una investigación de la prevalencia deC.jejunien pollo
crudo para evaluar los niveles iniciales de contaminación. Para este fin,
recopilamos los datos de prevalencia y nivel de contaminación deC.jejunien
pollo crudo al por menor de estudios previos y establecer las funciones de
distribución de probabilidad (Tabla S2). La segunda parte incluyó el
establecimiento de procesos adecuados para el producto alimenticio antes
de su consumo, como almacenamiento, transporte y cocción. En estos
procesos, el nivel poblacional (dosis) deC.jejuniSe cambió en función del
tiempo de exposición y la temperatura de cada paso. El modelo predictivo
desarrollado en este estudio determinó el nivel cambiante de bacterias para
el almacenamiento minorista, el transporte al hogar y el almacenamiento en
el hogar. La temperatura de exposición en estos tres pasos se fijó en 4◦C y
los datos para el tiempo de exposición se derivaron de estudios previos (
Jung, 2011; Ministerio de Seguridad de Alimentos y Medicamentos, 2016),
que se basaron en la población coreana. Para el paso de cocción, los datos
de tiempo y temperatura se obtuvieron deDogan et al. (2019)yEcoSeguro
(2007). El cambio bacteriano en este paso se determinó mediante los
parámetros de inactivación térmica (valores D y z) deCampilobacterespecies
(Adams y Moss, 2000; Van Asselt y Zwietering, 2006). La parte final incluyó la
estimación del Penfermo(campilobacteriosis humana) basado en un modelo de
dosis-respuesta. El modelo beta de Poisson, el modelo más utilizado para
C.jejuni, se utilizó para predecir la probabilidad de infección (Teunis y Havelaar,
2000), y el Penfermose estimó utilizando la infección dada según los datos de un
estudio previo en humanos (Nauta et al., 2007). Este estudio realizó la estimación
probabilística utilizando el complemento @RISK de Excel basado en una
simulación de Monte Carlo con 100.000 iteraciones para cada escenario. Los datos
de entrada que describen las variables y ecuaciones para cada paso se enumeran
enTabla S1.
2.7. análisis estadístico
Los estudiantest-Se realizó una prueba para el análisis comparativo entre
los dos grupos. Se realizó una prueba de chi-cuadrado al comparar
proporciones entre los dos grupos. Para el análisis estadístico se utilizó
GraphPad Prism v8.0.1 (GraphPad Software, Inc., CA, EE. UU.).
3. Resultados
3.1. Supervivencia mejorada de C. jejuni a temperaturas de refrigeración en
condiciones aeróbicas
C.jejunifrecuentemente se aísla de la carne de aves de corral que generalmente es
distribuidos en la cadena de frío en condiciones aeróbicas (Melo et al., 2013;
Támesis y Sukumaran, 2020), a pesar deC.jejuniEs una bacteria termotolerante y
microaerófila (Rossler y otros, 2020; Veranos y otros, 2023). Esto llevó a la
hipótesis de queC.jejuniPuede transmitirse a los humanos a través de la carne de
aves de corral al soportar temperaturas de refrigeración en condiciones aeróbicas.
comparamosC.jejunisupervivencia a las 4◦C entre condiciones aeróbicas y
microaeróbicas para examinar esta hipótesis utilizando 90C.jejuni cepas aisladas
de pollo crudo al por menor en nuestro estudio anterior (Kim y otros, 2019).
También descubrimos que algunas cepas deC.jejunison altamente tolerantes al
estrés por frío y que la tolerancia al estrés por frío está asociada con complejos
clonales específicos (CC), lo que indicó que las cepas con tolerancia al estrés por
frío están relacionadas filogenéticamente (Hur et al., 2022).C.jejuni NCTC 11168 se
incluyó en la prueba como control porque es uno de los
3
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comúnC.jejunicepas utilizadas por muchos laboratorios. Todas las cepas probadas
mantuvieron su viabilidad a 4◦C en condiciones aeróbicas durante el experimento
(21 días) (Figura 1). Notablemente,C.jejuniLa viabilidad a temperaturas de
refrigeración fue significativamente mayor en condiciones aeróbicas en
comparación con condiciones microaeróbicas en todos los tiempos de muestreo
(7, 14 y 21 días) a pesar de la naturaleza microaerófila obligada deC.jejuni(Figura 1
). Estos resultados sugieren que la tolerancia al frío deC.jejunise ve afectado por
las condiciones del aire.
3.2. Las condiciones del aire afectan la supervivencia de C. jejuni bajo refrigeración.
Para investigar la asociación entre las condiciones de oxígeno con la tolerancia
al frío, los niveles deC.jejunisupervivencia a las 4◦C en condiciones aeróbicas y
microaeróbicas se analizaron mediante un ajuste de distribución estadística (
Figura 2). Los intervalos de confianza del 90% para la viabilidad celular después de
7 días de incubación a 4◦C fue de -0,049 a 1,221 log UFC/mL de reducción en
condiciones aeróbicas (Figura 2A), mientras que una reducción de 0,553 a 3,434
log UFC/ml en condiciones microaeróbicas (Figura 2B). Esto indica que durante la
refrigeración,C.jejunise inactivó más rápidamente en condiciones microaeróbicas
en comparación con condiciones aeróbicas. Este patrón de distribución también
fue consistente con los resultados de 14 y 21 días para el rango de reducción log
UFC. Hubo reducciones de 0,216–2,032 y 0,75–3,84 log UFC/mL en condiciones
aeróbicas, y reducciones de 1,68–5,50 y 2,86–8,10 log UFC/mL en condiciones
microaeróbicas después de 14 y 21 días de incubación a 4◦C, respectivamente (
Figura 2CF). A pesar de
C.jejunicrece de manera óptima en ambientes microaerofílicos, nuestros hallazgos
indican que a 4◦C,C.jejunisobrevive mejor en condiciones aeróbicas en
comparación con condiciones microaeróbicas.
3.3. Complejos clonales (CC) MLST y aerotolerancia de cepas tolerantes
al frío de C. jejuni
En un estudio anterior, demostramos que ciertas cepas deC.jejunison
altamente tolerantes al estrés por frío y que la tolerancia al frío está asociada con
grupos filogenéticos deC.jejuni(Hur et al., 2022). Dado que no había criterios que
determinaran la tolerancia al frío, dividimos arbitrariamente las 90 cepas en dos
grupos de igual tamaño (n = 45) en función de la reducción de UFC el día 21 (
Figura S1). El grupo con mayor supervivencia a los 4◦C se consideró tolerante al
frío, mientras que el otro grupo con menor supervivencia se consideró sensible al
frío (Figura S1).
Dado que la tolerancia al frío está influenciada por las condiciones del aire (
Higos. 1 y 2), decidimos investigar la tolerancia al frío utilizando elC.jejuniCepas
que son tolerantes al estrés por frío tanto en condiciones aeróbicas como
microaeróbicas. Basándonos en la tolerancia al frío en ambas condiciones de aire,
categorizamos las cepas y creamos un diagrama de Venn, que llevó a la
identificación de 29 cepas que eran tolerantes al frío en las dos condiciones (AT y
MA-T) (Fig. 3A). Además, de la misma manera, identificamos 29 cepas que fueron
sensibles al estrés por frío en ambas condiciones de aire (AS y MA-S) (Fig. 3A). El
resto de las cepas fueron excluidas de análisis posteriores (Fig. 3A). Las cepas AT y
MA-T fueron más tolerantes al estrés por frío que las AS &Cepas MA-S con
significancia estadística (PAG <0.0001) bajo ambas condiciones de aire (Fig. 3B).
Evaluamos la asociación de la tolerancia al frío con la filogenia bacteriana
comparando los CC MLST entre los grupos sensibles al frío (AS y MA-S) y
tolerantes al frío (AT y MA-T). Los CC MLST de laC.jejuni Las cepas se
determinaron en nuestro estudio anterior (Kim y otros, 2019). La
composición de los CC de MLST fue significativamente diferente entre los
dos grupos (Fig. 3C). CC-21 y CC-443 (48,3% y 20,7%, respectivamente)
fueron predominantes en las cepas tolerantes al frío, mientras que la
mayoría de las cepas sensibles al frío pertenecían a CC-45 y no asignadas
(UA) (cada 24,1%) (Fig. 3C). Estos hallazgos indican que la tolerancia al frío
está relacionada con el grupo filogenético deC.jejuni.
La exposición al estrés por frío aumenta la expresión de genes relacionados con el
estrés oxidativo enC.jejuni(Stintzi y Whitworth, 2003). Esto nos permitió plantear la
hipótesis de que la tolerancia al frío puede estar relacionada con la aerotolerancia a
través de respuestas al estrés oxidativo enC.jejuni. Para investigar esto
JI Hur et al.
Fig. 1. La supervivencia de 90C.jejunicepas a las 4◦C en condiciones aeróbicas y microaeróbicas.Recuentos viables de 90C.jejuniLas cepas se midieron en los días 0, 7, 14 y 21 de
exposición a las 4◦C en caldo MH en condiciones aeróbicas y microaeróbicas. Los estudiantest-Se realizó una prueba para comparar la viabilidad entre condiciones aeróbicas y
microaeróbicas. Una línea negra indica la media. La línea de puntos indica el límite de detección. Los datos son representativos de tres experimentos independientes que muestran
resultados similares.****,PAG <0,0001.
hipótesis, comparamos los niveles de aerotolerancia entre cepas de animales
sensibles y tolerantes al frío.C.jejuni(Kim y otros, 2019). Curiosamente, las cepas
aerosensibles tuvieron una alta prevalencia en las cepas sensibles al frío en
comparación con las cepas tolerantes al frío (20,7 % frente a 6,9 %) con una
significación estadística (PAG <0,05) (Fig. 3D). Se demostró que las cepas
aerotolerantes eran más dominantes en las cepas tolerantes al frío que en las
cepas sensibles al frío (58,6 % frente a 37,9 %) (Fig. 3D). En general, las cepas con
mayor aerotolerancia, incluidas las aerotolerantes y las hiperaerotolerantes,
fueron más prevalentes en las cepas tolerantes al frío que en las cepas sensibles al
frío.Fig. 3D). Estos resultados sugieren que la tolerancia al frío está asociada con la
aerotolerancia enC.jejuni.
3.4. Supervivencia de C. jejuni en pollo crudo refrigerado en condiciones
aeróbicas y microaeróbicas
Para evaluarC.jejunisupervivencia con pollo crudo refrigerado a las 4◦C,
seleccionamos al azar 10 cepas sensibles y tolerantes al frío (Tabla S3) y
determinaron su supervivencia con pollo crudo. Se observaron diferencias
significativas en la supervivencia bacteriana entre las cepas sensibles y tolerantes
al frío a los 7, 14 y 21 días en condiciones aeróbicas y microaeróbicas.Figura S2A y
S2B). Las reducciones de UFC no fueron significativamente diferentes entre las
condiciones aeróbicas y microaeróbicas durante los primeros tres días (Figura 4A).
Sin embargo, en condiciones microaeróbicas,
C.jejuniLas cepas mostraron una reducción de la viabilidad más rápida en comparación con las
condiciones aeróbicas después de 4 días bajo estrés por frío (Figura 4A).
Las cepas tolerantes al frío mostraron una mayor viabilidad en la piel de pollo
que las cepas sensibles al frío después de unos días de refrigeración en
condiciones aeróbicas.Figura 4B). En condiciones microaeróbicas, la viabilidad de
las cepas tolerantes al frío fue mayor que la de las cepas sensibles al frío en el
segundo día con una significación estadística.ce, un d el promedioy CF Los niveles
de U de las cepas tolerantes al frío fueron consistentemente más altos que los de
las cepas sensibles al frío (Figura 4B). Estos hallazgos indican que las condiciones
de oxígeno determinan el período de supervivencia deC.jejunicepas en carne de
pollo refrigerada (5 días en condiciones aeróbicas en comparación con 3 días en
condiciones microaeróbicas). La tolerancia al frío no extendió el tiempo de
supervivencia a los 4 años.◦C pero aumentó los niveles deC.jejunien revie Carne de
pollo gerificada en ambas condiciones de aire.
4
Investigación Alimentaria Internacional 175 (2024) 113683
3.5. Modelado matemático para evaluar la supervivencia de C. jejuni en
pollo refrigerado en condiciones aeróbicas y microaeróbicas.
Desarrollamos un modelo matemático para predecir la supervivencia de
C.jejunia través de un parámetro cinético asociado con las condiciones del aire y la
tolerancia al frío enC.jejuni. Se utilizó la ecuación de Weibull para ajustar los 11 conjuntos
de datos deC.jejunisupervivencia aeróbica y microaeróbica en pollo crudo refrigerado (
C.jejuniNCTC 11168; 5 cepas sensibles al frío; 5 cepas tolerantes al frío enFigura 4), lo que
da como resultado una curva de supervivencia de 0,88 a 0,99 de bondad de ajuste (figura
5). Se analizó estadísticamente el valor delta, el tiempo necesario para una reducción de 1
log UFC/g, demostrando que en condiciones aeróbicas,C.jejunicepas requeridas
significativamente (PAG <0,05) mayor tiempo de inactivación que las condiciones
microaeróbicas (Figura 6A). Además, las cepas tolerantes al frío necesitaban
significativamente (PAG <0,05) tiempo de inactivación más largo que las cepas sensibles
al frío en ambas condiciones de aire (Figura 6B y C). Estos resultados indican que la
refrigeración deC.jejuni-aves de corral contaminadas en condiciones aeróbicas y aves de
corral contaminadas con tolerantes al frío.C.jejuniLas cepas requieren intervenciones
cuidadosas para garantizar la seguridad alimentaria.
3.6. Estimación del riesgo basada en escenarios de la carne de pollo contaminada con
C.jejuni
Estimamos estadísticamente la Penfermoinvestigar la influencia de las condiciones del
aire yC.jejuniLa tolerancia al frío sobre el riesgo de campilobacteriosis humana. En este
sentido, se realizó una simulación Monte Carlo para las cuatro combinaciones (AS, AT,
MA-S y MA-T) utilizando el mismo escenario de exposición (Figura S3). Más
específicamente, aplicamos el escenario simple desde el comercio minorista hasta el
consumo, que incluye el almacenamiento durante el comercio minorista y en el hogar, el
transporte al hogar y la cocción antes del consumo.
consumo en Materiales y Métodos (Sección 2.6), para comparar los riesgos
asociados con la tolerancia al frío deC.jejuni.
En todas las distribuciones, la probabilidad de enfermedad por persona por
día para los cuatro escenarios de exposición fue muy asimétrica (asimetría>0). Los
valores medios estuvieron entre los 95thy 99thpercentiles, lo que sugiere que la
probabilidad de campilobacteriosis era muy baja en el escenario actual y los datos
debido a la cocción antes del consumo (tabla 1). Sin embargoejem, la penfermode
cepas tolerantes al frío fue mayor que el de cepas sensibles al frío tanto en
condiciones aeróbicas (valores medios de Penfermopara sensibles al frío, 5,9×10-5;
tolerante al frío, 2,9×10-4) y microaeróbico
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Fig. 2. Distribuciones de mejor ajuste para los datos de reducción logarítmica de 90C.jejunicepas a las 4◦C en condiciones aeróbicas (A) y microaeróbicas (MA).(A) 7 días según A,
(B) 7 días según MA, (C) 14 días según A, (D) 14 días según MA, (E) 21 días según A y (F) 21 días según MA. El ajuste de la distribución se realizó utilizando la herramienta de distribución
de mejor ajuste en la versión 7.6 del software @RISK (Palisade Corporation, Ithaca, NY, EE. UU.).

condiciones (valores medios de Penfermopara sensibles al frío, 1,2×10-5; tolerante al
frío, 1.4×10-4) (tabla 1). Los resultados de la estimación de riesgos basada en
escenarios indicaron que la contaminación de la carne de pollo refrigerada por
animales tolerantes al fríoC.jejunicepas en condiciones aeróbicas pueden
presentar el mayor riesgo de infección humana conCampilobacter.
En este estudio, adoptamos una práctica de cocina de consumo de un caso;
por lo tanto, se deben realizar más investigaciones y recopilación de datos sobre el
tiempo y la temperatura de la práctica de cocción para reflejar situaciones reales.
Las lagunas y limitaciones de datos identificadas durante el análisis de riesgo.
Las estimaciones realizadas en este estudio se presentan en la Discusión (
Sección 4).
4. Discusión
la capacidad deC.jejunisobrevivir en poul Probar carne en la cadena de frío presenta
un grave problema de seguridad alimentaria (Chaisowwong et al., 2012; Kaakoush y
otros, 2015). A pesar deC.jejunies un patógeno termotolerante transmitido por los
alimentos que crece de manera óptima a temperaturas elevadas (es decir, 42◦C)

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Fig. 3. CC de MLST y aerotolerancia de cepas sensibles y tolerantes al frío. (A) Un diagrama de Venn del grupo sensible al frío (S, n = 45) y del grupo tolerante al frío (T,
n = 45) en condiciones aeróbicas (A) y condiciones microaeróbicas (MA) basadas en la tolerancia al frío en ambos casos de aire. condiciones. El análisis condujo a la
identificación de 29 cepas sensibles al frío en condiciones aeróbicas (AS) y microaeróbicas (MA-S) y 29 cepas tolerantes al frío en condiciones aeróbicas (AT) y
microaeróbicas (MA-T). (B) Reducción de la viabilidad de 29 cepas sensibles al frío en ambas condiciones de aire (AS y MA-S) y 29 cepas tolerantes al frío en ambas
condiciones de aire (AT y MA-T). La proporción de (C) MLST CC y (D) aerotolerancia se compararon entre AS y MA-S (n = 29) y AT y MA-T (n = 29). Los números en negrita
representan la cantidad de cepas que pertenecen a AS & MA-S y AT & MA-T, respectivamente. Estudiantest-Se realizó una prueba para comparar la viabilidad entre los dos
grupos. Se realizó una prueba de chi-cuadrado para comparar la proporción de CC y aerotolerancia, respectivamente. *,PAG <0,05;**,PAG <0,01;***,PAG < 0,001;****,PAG <
0,0001; CC, complejo clonal; UA, no asignada a ninguna CC definida; HAT, hiperaerotolerante; AT, Aerotolerante; AS, Aerosensible.

(Veranos y otros, 2023), los estudios han revelado queC.jejunipuede sobrevivir a bajas y CC-45 prevalecieron entre las cepas tolerantes y sensibles al frío,
temperaturas de refrigeración en comparación con la temperatura ambiente (Elmonir et respectivamente (Fig. 3C). Estos resultados están bien alineados con estudios
al., 2022; Solow y otros, 2003). Además, un estudio previo demostró que los aislados previos, que muestran que CC-21 es muy común enC.jejunipresiones i solado
clínicos humanos deC.jejunisobrevivir mejor que los aislamientos de aves de corral bajo durante el invierno (Friedrich y otros, 2016), mientras que CC-45 es dominante
estrés por frío, lo que sugiere que la tolerancia al frío puede ser mayor. en verano aísla (McCarthy y otros, 2012). Estos hallazgos indicaron que
relacionado con la frecuente implicación de esta bacteria con enfermedades transmitidas Los antecedentes filogenéticos están asociados con la tolerancia al frío de
por alimentos (Chan y otros, 2001). Sin embargo, estos estudios presentan observaciones C.jejuni.
fenotípicas sólo en un número limitado de cepas, y los mecanismos de tolerancia al frío La estimación del riesgo se basó en un escenario simple para comparar
permanecen velados enC.jejuni. el riesgo causado por cepas de animales sensibles y tolerantes al frío.C.jejuni
Nuestros hallazgos sugieren que los animales tolerantes al fríoC.jejunipuede ser soyoh Son una amenaza grave (Figura S3). Es importante reconocer que este escenario no puede abarcar el
para la seguridad alimentaria que las cepas sensibles al frío. Bajo ambos aires acondicionados.oh ns, frío entire granja a f procedimiento de trabajos . El propósito principal de
- st tolerante lluvias exhibí yo mayor supervivencia en valores de elta nuestro riesgo unanálisis w en cuanto a distingo Complete las
Rhodepreguntas
Island relacionadas con la
eleganteconocido (Figura 4 B). Bas ed en la d refrigerados, reducciones de viabilidad en s este estudio, nosotros asumimos t frío. En una temperatura térmica de 4◦
con una iso tolerancia al
refri chi generado pollo m comer eran les significativas en las cepas B y C tolerantes al frío). cadena a ut ilizarte r supervivencia C en el modelo frío deC.jejuni. Sin embargo, sería
que en frío-sen sitivo s trenes (Figura 6 Dado que los productos avícolas son granos, la que la mayoría f bienes mamá y experiencia necesario considerar la fluctuación de temperatura
usúally distribuye ted en el frio c contaminación de los productos refrigerados cadena, una completa escala l predictivo m dentro del enfoque de modelado en frío que cubra
pouintentar con col d-tolerantehormigaC.jejuni Puede que en serioh comer comidas seguridad. rango de naturaleza i n el co ld cadena wo la temperatura. Además, no hicimos y solo
Nuestro estimación de riesgo ción una También mostré que la contaminación de los frigoríficos unicepas considerar cr oss-con contaminación reflejamos la inactivación térmica.
elegantecarne conocida por frío-t toleranteC.jej en condiciones aeróbicas tabla 1). Curiosamente, ción de c cocinando. Esto implica que la penfermoestimado en este estudio podría ser
presentré el hola fantasma v valor de Penfermo( MLST CC-21 ser modificado d si su dato eficiente una e información sobre el comportamiento de

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Fig. 4. Supervivencia mejorada de los tolerantes al frío.C.jejunitensiones en entre chic crudo refrigerado conocido.(A) Comparación deC.jejunisupervivencia en pollo crudo refrigerado (n
aeróbico y microaerotransmisión exterior Condiciones ic durante 7 días. (BC) Supervivencia ival de cepas sensibles al frío = 5) y cepas tolerantes al frío (n = 5) en pollo crudo refrigerado
en condiciones (B) aeróbicas y (C) microaeróbicas. Los estudiantest-Se realizó una prueba para el análisis estadístico. Una barra negra indica la media. Las líneas de puntos indican el
límite de detección de los ensayos.t Los datos son representativos de tres experimentos independientes que muestran resultados similares. *,PAG <0,05;**,PAG <0,01; ns, no
significativo; ND, Ninguno detectado.

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Fig. 5. Modelos de supervivencia deC.jejunicepas de pollo crudo refrigerado.(A) Cepas sensibles al frío y (B) cepas tolerantes al frío en condiciones aeróbicas, (C) cepas sensibles al
frío y (D) cepas tolerantes al frío en condiciones microaeróbicas. Cada modelo de supervivencia paraC.jejuniLas cepas y la cepa de referencia se ajustaron utilizando el modelo de Weibull
en GinaFiT versión 1.6. El círculo coloreado y la línea continua indicanC.jejunicepas (naranja, sensible al frío, n = 5; azul, cepa tolerante al frío, n = 5), mientras que el círculo negro y la
línea discontinua representan la cepa de referencia (C.jejuniNCTC 11168).

Fig. 6. Valores delta del modelo de supervivencia deC.jejunisobre pollo crudo refrigerado.(A) Comparación de los valores delta (tiempo requerido para la primera reducción de 1 log
UFC) deC.jejunicepas (n = 10) en condiciones aeróbicas y microaeróbicas. Un punto negro indica la cepa de referencia,C.jejuniNCTC 11168. (BC) Valores delta de cepas sensibles al frío (n
= 5) y cepas tolerantes al frío (n = 5) en pollo crudo refrigerado en condiciones (B) aeróbicas y (C) microaeróbicas. Los parámetros cinéticos se calcularon utilizando el modelo de Weibull
en GinaFiT versión 1.6. + y una línea horizontal indican la media y la mediana, respectivamente. Los estudiantest-La prueba se realizó para el análisis estadístico.. Para el parámetro de
forma, todos los valores de ρ fueron<1, lo que indica que todas las curvas tienen forma cóncava (datos no mostrados). *,PAG <0,05.

los patógenos y los consumidores estén disponibles. No obstante, los resultados de Al analizar la tolerancia al frío en 90 cepas deC.jejuni, descubrimos que la
riesgo pueden servir como datos fundamentales para dilucidar lo significativo que esroja k
hormiga tolerancia al frío deC.jejunise ve afectado por las condiciones del aire. como un
asociar d con tolerante al fríoC.jejunien comparación con el sensible te presiones . microaerófilo obligado,C.jejunies sensible a la alta tensión de oxígeno y groh Es mejor
t o mitiga la brecha entre thmi estimaciones de riesgo basadas en y real - con una tensión parcial de oxígeno.el de 2 –10% (Kaakoush y otros, 2007), wh ich es más
w escenarios, una comprensións Se debe realizar una ARM
sentarse en el mundo Evaluar - oncentr(Bolton
bajo que el oxígeno c conorte condiciones (15–21%) y compañía
ación en condiciones atmosféricas normales. 983).

ent (Q cuantitativa de riesgo microbiano). Esto requeriría la d

metro desarrollar- come, 1 Curiosamente, en condiciones de refrigeración hay
entrada de
metro modelos primarios y secundarios para descripción ser b acteria yo temperaturas de funcionamiento,C.jeju niexh ibitado una mejor supervivencia en condiciones aeróbicas.

b comportamiento bajo r chang temperaturas a lo largo de la cadena alimentaria. condiciones que las condiciones microaeróbicas (Figura 1). Una estadística

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tabla 1
Probabilidad estimada de enfermedad por el consumo de aves contaminadas conC.jejuni
basado en el análisis de escenarios.
Análisis de riesgo Almacenamiento Tipo de Significar 95%
condición presiones
Probabilidad de Aerobio Frío- 5.9× 1.4×
enfermedad (Penfermo) sensible (n) 10-5 10-10
=5)
Tolerante al frío 2.9× 2.6×
(norte = 5) 10-4 10-9
microaeróbico Frío- 1.2× 1.5×
sensible (n) 10-5 10-11
=5)
Tolerante al frío 1.4× 7.9×
(norte = 5) 10-4 10-10
#
PAGenfermo: Probabilidad de enfermedad por persona por día.
distribución también demostró queC.jejunies más probable que mantenga la
viabilidad en condiciones aeróbicas que en condiciones microaeróbicas (Figura 2).
Además, el PenfermodeC.jejunia través de carne de pollo refrigerada fue mayor en
condiciones aeróbicas en comparación con condiciones microaeróbicas (tabla 1).
Esto indica que refrigerar la carne de ave en condiciones aeróbicas puede
aumentar potencialmente el riesgo deC.jejunicontaminación porque las
condiciones aeróbicas extienden la supervivencia deC.jejunibajo condiciones de
refrigeración.
Los mecanismos moleculares del impacto de las condiciones aeróbicas en la
tolerancia al frío aún no se han dilucidado. Sin embargo, se puede especular que
C.jejunipueden afrontar mejor el estrés por frío en condiciones aeróbicas gracias
al aumento de la actividad metabólica inducida por la exposición aeróbica, que
probablemente esté asociada con la defensa contra el estrés oxidativo. Según
estudios previos, las respuestas al estrés oxidativo permitenC.jejunitolerar el
estrés aeróbico utilizando enzimas antioxidantes (Baillon et al., 1999; Kim y otros,
2015; Ah y otros, 2015). Además, recientemente demostramos que el aumento del
estrés oxidativo en condiciones aeróbicas altera el metabolismo del carbono en
C.jejuniy facilita la síntesis de polisacáridos capsulares y lipooligosacáridos, lo que
lleva a la formación de una capa superficial gruesa de polisacáridos para proteger
de altas concentraciones de oxígeno (Kim y otros, 2023).
El sistema de defensa oxidativa es un mecanismo de defensa que confiere
protección cruzada en condiciones ambientales adversas.Lucchetti-Miganeh et al.,
2008). La protección cruzada es un mecanismo de supervivencia común
ampliamente utilizado por patógenos, comoE. colioSalmonela, en condiciones de
estrés (Battesti et al., 2011; Xu y otros, 2008). Las respuestas al estrés oxidativo
están relacionadas conC.jejuniLa tolerancia al estrés por congelación y
descongelación. Un mutante knockout decéspedB, que codifica una superóxido
dismutasa, aumenta significativamente la susceptibilidad al estrés de congelación-
descongelación enC.jejuni (Garénaux et al., 2009). Además, nuestro estudio
anterior también demostró queCfrA, que codifica el receptor de enterobactina
férrica implicado en el transporte y el metabolismo de iones, contribuye a la
tolerancia al frío enC.jejuni alterando los niveles de hierro intracelular y el estrés
oxidativo (Hur et al., 2022). Anteriormente, también demostramos que los
aerotolerantesC.jejuni Las cepas, que poseen niveles elevados de actividades de
catalasa y superóxido dismutasa, son altamente tolerantes al estrés por
refrigeración.Ah y otros, 2019). Estos estudios previos sugieren que la tolerancia al
frío puede estar asociada con la defensa contra el estrés oxidativo enC.jejuni.
Consistentemente, la proporción de cepas aerotolerantes fue significativamente
mayor en las cepas tolerantes al frío que en las cepas sensibles al frío.Fig. 3D).
Nuestros hallazgos en este estudio muestran queC.jejuniexhibe una mayor
tolerancia al frío en condiciones aeróbicas dondeC.jejuniexperimenta un mayor
estrés oxidativo en comparación con las condiciones microaeróbicas. Dada la
amplia regulación de la expresión genética por la respuesta al estrés oxidativo, es
posible que ciertos genes controlados por el estrés oxidativo desempeñen un
papel importante en la tolerancia al frío.
Aquí, hemos demostrado que las cepas tolerantes al frío deC.jejunipuede sobrevivir
en niveles más altos en pollo crudo refrigerado en comparación con las cepas sensibles al
frío. En particular, este es el primer estudio que muestra que las condiciones aeróbicas
pueden aumentar la tolerancia al frío de los animales.C.jejunien comparación con
Investigación Alimentaria Internacional 175 (2024) 113683
condiciones microaeróbicas. Aunque el manejo de la cadena de frío es una práctica
común para garantizar la seguridad de los productos avícolas, nuestros hallazgos
sugieren que la supervivencia bacteriana en la cadena de frío puede diferir de la que se
99% produce en condiciones óptimas de crecimiento, presumiblemente debido a una
fisiología bacteriana alterada a bajas temperaturas. Además, nuestros resultados indican
1.9× que la implementación de envases atmosféricos modificados que generen condiciones
10-5 microaeróbicas podría servir como una intervención novedosa para reducir el nivel de
C.jejunisobre pollo crudo refrigerado. Para mejorar las medidas de control deC.jejunien la
2.8×
cadena de frío de las aves, se requieren más estudios para dilucidar los mecanismos
10-4
2.1× moleculares de la tolerancia al frío deC.jejuni.
10-6
Declaración de contribución de autoría CRediT
7.9×
10-5
Jeong In Hur:Conceptualización, Investigación, Análisis formal, Escritura
– borrador original, Escritura – revisión y edición.Jinshil Kim:
Conceptualización, Investigación, Análisis formal, Escritura – borrador
original, Escritura – revisión y edición.Mi Seon Kang:Investigación, Análisis
formal, Escritura – borrador original, Escritura – revisión y edición.Hyun
Jung Kim:Conceptualización, Análisis formal, Escritura – borrador original,
Escritura – revisión y edición.Sangrieol Ryu:Conceptualización, Escritura
– revisión y edición, adquisición de fondos.Byeonghwa Jeon:
Conceptualización, Análisis formal, Redacción – borrador original, Redacción
– revisión y edición, Supervisión.
Declaración de intereses en competencia
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia
ni relaciones personales conocidas que pudieran haber influido en el trabajo
presentado en este artículo.
Disponibilidad de datos
Los datos estarán disponibles previa solicitud.
Expresiones de gratitud
JIH y JK contaron con el apoyo del programa BK21 Plus de la
Departamento de Biotecnología Agrícola, Universidad Nacional de Seúl, Seúl,
Corea. Este estudio fue apoyado por el Programa de Investigación Cooperativa
para el Desarrollo de la Ciencia y la Tecnología Agrícola (Proyecto No. PJ016298),
Administración de Desarrollo Rural, República de Corea. Este trabajo fue apoyado
por la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF)
financiada por el gobierno coreano (MSIT) (No. 2023R1A2C100635911). BJ cuenta
con el apoyo de MnDRIVE (Economía de descubrimiento, investigación e
innovación de Minnesota). JK recibió el apoyo del Programa de Investigación en
Ciencias Básicas a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF)
financiada por el Ministerio de Educación (2022R1A6A1A03055869 y
NRF-2021R1I1A1A01050990).
Apéndice A. Material complementario
Los datos complementarios de este artículo se pueden encontrar en línea enhttps://
doi. org/10.1016/j.foodres.2023.113683.
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