PRACTICA No.

4 Inmunodifusión doble

Enriquez Chavez PR, Miércoles. 10:00- 13:00 p.m. Agosto- Diciembre 2021. Laboratorio de Inmunología
General, Unidad Académica de Ciencias Químicas, Universidad Autónoma de Zacatecas.

Resumen:

La inmunodifusión doble de Ouchterlony es un método inmunológico sencillo y rutinariamente usado en el

laboratorio clínico para la detección de antígenos o anticuerpos en una muestra biológica. Es considerado el
proceso estándar para la detección de Antígenos Nucleares Extraíbles (ENA).

Palabras Clave: Inmunodifusión doble de Ouchterlony, Antígeno, Anticuerpo

Introducción

Inmunodifusión Doble de Ouchterlony distintas mezclas antigénicas. Este patrón de bandas

se puede clasificar de tres
Por medio de la Inmunodifusión Doble de
maneras: identidad parcial, total o no identidad y
Ouchterlony se pueden realizar análisis cuali y
se muestra en la Figura 1.
cuantitativos de antígenos y anticuerpos en una
solución, mediante una inmunoprecipitación en gel
de agarosa.
Cabe destacar que existen dos tipos de
inmunodifusión, doble o simple; en la
inmunodifusión simple se mantiene fijo el antígeno
o el anticuerpo; en la inmunodifusión doble, ambos,
antigeno y anticuerpo, están libres para difundir (de
forma radial o lineal) hacia el otro y formar un
precipitado.
La técnica consiste en colocar en una placa de petri
con gel de agarosa distintas soluciones de Ag/Ac y
se las deja difundir libremente; en la región donde
los gradientes de difusión se encuentran en
proporciones de equivalencia se forma un
precipitado que se visualiza como una banda opaca
en el gel.
La precipitación ocurre, debido a la formación Sobre una placa con gel se corta una serie de hoyos
de complejos antígeno-anticuerpo en una con atención a la geometría entre un hoyo y los
proporción justa en la cual se forma una demás. Se coloca un extracto de células humanas
gran matriz de agregados (punto de (extraídas de tejido de las amígdalas) en el pocillo
equivalencia), por lo cual precipitan dando bandas. del centro. Este extracto contiene un cóctel de
Diferentes preparaciones que contienen múltiples antígenos humanos naturales que se quiere obtener.
antígenos frente a un antisuero multiespecífico dará El suero sanguíneo del paciente es colocado luego
numerosas bandas de precipitado debido a que las en uno de los pocillos exteriores y la placa se deja
distintas interacciones entre Ag-Ac tienen distintos por 48 horas para su revelado. Durante este tiempo,
puntos de equivalencia, de esta forma se pueden los antígenos de las amígdalas y los anticuerpos en
analizar la complejidad de el pocillo del suero migrarán de manera radial hacia
afuera de sus respectivos pocillos. Al encontrarse cantidad de precipitación disminuye (fenómeno de
ambos a mitad de camino y, de haber anticuerpos en postzona).
contra de los antígenos tonsilares, se unirán en una
red de enlaces llamado complejo inmune, el cual
precipita en el gel revelando una línea blanquecina.

El precipitado que se forma al combinarse el

antígeno con los anticuerpos pueden forman una
línea continua llamada identidad completa, una
La precipitación ocurre con la mayoría de los línea continua con un espolón en un lado llamado
antígenos, debido a que éstos tienden a ser línea de identidad parcial, o bien dos líneas que se
multivalente, es decir, tienen varios determinantes entrecruzan llamadas líneas de no-identidad. El tipo
antigénicos por molécula, al que los anticuerpos de línea que se forma dictará si el paciente tiene
pueden enlazarse. Cada anticuerpo, a su vez, tiene alguna forma del anticuerpo que puede estar
por lo menos dos sitios de unión para los antígenos, asociado a un proceso de enfermedad.
de modo que se entrecruzan formando una gran
matriz de agregados antígeno-anticuerpo.
Experimentalmente, una cantidad de antígeno se
añade de manera incrementada a una cantidad
constante de anticuerpo en solución. Inicialmente, a
una baja concentración, todo el antígeno participa
en el precipitado, lo cual se conoce como una zona
de exceso de anticuerpo o fenómeno de prozona.
A medida que se añade más antígeno, la cantidad
de proteína que precipita, aumenta hasta que las
moléculas de antígeno:anticuerpo alcanzan una
proporción óptima, llamada zona de equivalencia.
La zona de exceso se logra cuando la concentración
del antígeno excede a la de los anticuerpos, y la

Materiales y Métodos:  Agar bacteriológico al 1%

MATERIAL Y EQUIPO  Buffer salino de Fosfatos (PBS)
Material biológico. Material.
 Suero humano  Caja de Petri chica
 Antisuero Anti-IgG  Matraz de 125 ml
 Antisuero Anti-C3  Micropipeta de 100 ul.
Reactivos.  Puntillas para micropipetas.
  Pipeta de 10 ml.
 Pipeta de 5ml.
 Pipera Pasteur.
 Parilla eléctrica.
 Cámara húmeda.
 Centrifuga.

Diagrama de Flujo:

Resultados:

2: antisuero C3

1: antisuero IgG;
 Se pueden visualizar las bandas de precipitación en
azul. En todos los casos se visualiza un patrón
de identidad total, debido a que en los pocillos se
encuentra el mismo antígeno en distintas
concentraciones.
Existe una relación entre la concentración del
antígeno sembrado y la posición de la banda.
Cuanto más concentrado se encuentre el antígeno
más lejos del posillo se encontrara la banda.
Es por esto que la banda correspondiente a sulfato
de amonio 50% (1/2) se encuentra mas cerca del
pocillo central (pocillo de siembra de suero de
conejo total anti-humano) que las demás bandas.
En el caso de B (IgGs ) no se pueden interpretar
muy bien los resultados debido a que la banda es
muy tenue.

3: antisuero C3

Discusión:

Conclusión:
Se pudieron realizar las técnicas de Inmunodifusión
radial e Inmunoelectroforésis para estudiar la
interacción Antígeno-Anticuerpo, así como también
el marco teórico de las mismas.
Con respecto a la Inmunodifusión, se pudieron
observar patrones de identidad total en los
resultados según lo esperado. Sin embargo no se
pudieron analizar los resulados de la siembra con
IgGs de conejo (B), debido a que las bandas
resultaron muy tenues.
Los resultados de la Inmunoelectroforesis nos
permitieron observar el patron de migracion de las
distintas globulinas.
en:
https://sisbib.unmsm.edu.pe/BVRevistas/sp
mi/v09n2/fen%C3%B3meno.htm#:~:text=El
%20fen%C3%B3meno%20de%20zona%2C
%20conocido,sitio%20de%20uni%C3%B3n
%20del%20anticuerpo.
 BIOTED. Interacción antígeno-anticuerpo.
el procedimiento ouchterlony. Disponible
en:
https://www.bioted.es/protocolos/ANTIGEN
O-ANTICUERPO.pdf

Bibliografía
 Hospital Arzobispo Loayza. Instituto
Nacional de Salud Fenómeno de zona y
brucelosis humana. Luis Sánchez Hurtado,
Rosa Asmat Aquije, Leonidas Carrillo,
Alfredo Guillén y Víctor Quispe. Disponible