NORMA CUBANA NC

ISO 4833-1: 2014

(Publicada por la ISO en 2013)

MICROBIOLOGÍA DE LA CADENA ALIMENTARIA- MÉTODO

HORIZONTAL PARA LA ENUMERACIÓN DE
MICROORGANISMOS ― PARTE 1: CONTEO DE COLONIAS A
30 °C POR LA TÉCNICA DE PLACA VERTIDA
(ISO 4833-1: 2013, IDT)

Microbiology of the food chain ― Horizontal method for the enumeration of

microorganisms ― Part 1: Colony count at 30 °C by the pour plate technique

ICS: 07.100.30 1. Edición Julio 2014

REPRODUCCIÓN PROHIBIDA
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Teléfono: 830-0835 Fax: (537) 836-8048; Correo electrónico: nc@ncnorma.cu; Sitio
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Cuban National Bureau of Standards

NC-ISO 4833-1: 2014  NC

Prefacio

La Oficina Nacional de Normalización (NC) es el Organismo Nacional de Normalización de

la República de Cuba y representa al país ante las organizaciones internacionales y
regionales de normalización.

La elaboración de las Normas Cubanas y otros documentos normativos relacionados se

realiza generalmente a través de los Comités Técnicos de Normalización. Su aprobación
es competencia de la Oficina Nacional de Normalización y se basa en las evidencias del
consenso.
Esta Norma Cubana:
• Ha sido elaborada por el Comité Técnico de Normalización NC/CTN 61 de Microbiología, integrado por
representantes de las siguientes entidades:
- Dirección Nacional de Salud Ambiental -Ministerio de Salud Pública (DNSA-MINSAP)
- Instituto de Nutrición e Higiene de los Alimentos (INHA-MINSAP)
- Centro Nacional de Higiene de los Alimentos (CNHA-IMV-MINAGRI)
- Centro Nacional de Inspección de la Calidad (CNICA-MINAL)
- Laboratorio de Cuba-Control S.A. (MINCEX)
- Oficina Nacional de Normalización (ONN)
- Instituto de Farmacia y Alimentos (UH-IFAL-MES)
- Centros Provinciales de Higiene y Epidemiología (CPHE- MINSAP)
- Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA-MES)
- Centro de Investigaciones Pesqueras (CIP-MINAL)
- Laboratorio Central de Calidad (CID-CI. MINCIN)
- ALIMPORT (MINCEX)
- Escuela de Hotelería y Turismo (MINTUR)
- Instituto de Investigaciones para la Industria Alimenticia (IIIA-MINAL)
- Centro Nacional de Biopreparados (BIOCEN-CITMA)

• Es una adopción idéntica por el método de traducción de la versión en inglés de la ISO 4833-1: 2013
Microbiology of the food chain- Horizontal method for the enumeration of microorganisms- Part 1: Colony
count at 30 °C by the pour plate technique. Consta de un anexo informativo

• De conjunto con la ISO 4833-2 (en proceso de adopción), sustituye a la NC-ISO 4833: 2011 Microbiología
de alimentos de consumo humano y animal- Guía general para la enumeración de microorganismos —
Técnica de conteo de colonias a 30 °C - Método de referencia.

La NC-ISO 4833 consta de las partes siguientes, bajo el título general de Microbiología de la cadena
alimentaria- Método horizontal para la enumeración de microorganismos:
Parte 1: Conteo de colonias a 30 °C por la técnica de placa vertida.

Parte 2: Conteo de colonias a 30 °C por la técnica de siembra en superficie.

© NC, 2014
Todos los derechos reservados. A menos que se especifique, ninguna parte de esta
publicación podrá ser reproducida o utilizada en alguna forma o por medios
electrónicos o mecánicos, incluyendo las fotocopias, fotografías y microfilmes, sin
el permiso escrito previo de:
Oficina Nacional de Normalización (NC)
Calle E No. 261, El Vedado, La Habana, Habana 4, Cuba.
Impreso en Cuba.
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 NC NC ISO 4833-1: 2014

MICROBIOLOGÍA DE LA CADENA ALIMENTARIA ― MÉTODO HORIZONTAL PARA LA

ENUMERACIÓN DE MICROORGANISMOS ― PARTE 1: CONTEO DE COLONIAS A 30 °C POR
LA TÉCNICA DE PLACA VERTIDA

1 Objeto

Esta parte de la Norma Cubana proporciona un método horizontal para la enumeración de

microorganismos, mediante el conteo de colonias obtenidas en medio sólido después de la
incubación en aerobiosis a 30 °C.

Este método es aplicable a:

a) productos destinados tanto para el consumo humano, como para la alimentación animal.
b) muestras ambientales en áreas de producción y manipulación de alimentos para consumo
humano y animal.

Esta parte de la NC-ISO 4833 es aplicable a:

1) Productos que requieran un conteo confiable ya que se especifica un bajo límite de

detección (por debajo de 102/ g o 102/ mL para muestras líquidas o por debajo de 103/ g
para muestras sólidas);

2) Productos que se esperan contengan colonias que se expanden y escondan las colonias de
otros microorganismos, por ejemplo: leche y productos lácteos que probablemente
contengan colonias expandidas de Bacillus spp.

La aplicabilidad de esta parte de la NC-ISO 4833 para el examen de ciertos productos fermentados
y piensos para animales es limitado y otros medios o condiciones de incubación pueden ser más
apropiados. Sin embargo, este método puede ser aplicado a tales productos aunque es posible
que los microorganismos predominantes en ellos no sean detectados eficazmente.

Para algunas matrices, el método especificado en esta parte de la NC-ISO 4833 pueden brindar
diferentes resultados a los obtenidos usando el método especificado en la NC-ISO 4833-2.

2 Referencias normativas

Las siguientes normas son indispensables para la aplicación de este documento. Para referencias
fechadas, solo se aplican las ediciones citadas. Para referencias no fechadas, se aplica la última
edición del documento referido (incluyendo cualquier enmienda).

NC-ISO 6887-1: 2002 Microbiología de alimentos de consumo humano y animal – Preparación de

la muestra de ensayo, la suspensión inicial y las diluciones decimales para pruebas
microbiológicas. Parte 1: Reglas generales para la preparación de la suspensión inicial y las
diluciones decimales.

ISO 6887 (all parts), Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples,
initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination.

NC-ISO 7218: 2013 - Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal. Reglas
generales para los exámenes microbiológicos.
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NC-ISO 4833-1: 2014  NC

NC-ISO 11133-1: 2012 Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal. Guía para
la preparación y producción de medios de cultivo. Parte 1: Guías generales en el aseguramiento
de la calidad para la preparación de medios de cultivo en el laboratorio.

3 Términos y definiciones

Para los propósitos de esta norma se aplica la siguiente definición:

3.1
microorganismo
entidad de tamaño microscópico, comprendiendo bacterias, hongos, protozoos y virus.
[Fuente: ISO/TS 11139:2006, 3 2.26]

NOTA 1: para los propósitos de esta parte de la NC-ISO 4833, microorganismos son bacterias, levaduras y
mohos que son capaces de producir colonias bajo las condiciones especificadas es esta parte de la norma.

4 Principio

Se preparan dos placas vertidas empleando un medio de cultivo específico y una cantidad
específica de la muestra de ensayo, si el producto inicial es líquido, o una cantidad específica de
una suspensión inicial en el caso de otros productos.

Bajo las mismas condiciones prepare otros pares de placas vertidas, usando diluciones decimales
obtenidas a partir de la muestra para ensayo o de la suspensión inicial.

Las placas se incuban en aerobiosis a 30 °C, durante 72 h.

El número de microorganismos por gramo o por mililitro de la muestra de ensayo es calculado del
número de colonias obtenidas en las placas que contienen menos de 300 colonias.

5 Medio de cultivo y diluentes

5.1 Generalidades

Para la preparación, producción y evaluación del desempeño de los medios de cultivo guíese por
la NC-ISO 11133.

5.2 Diluentes

Ver la NC-ISO 6887-1 o la parte relevante de la ISO 6887.

5.3 Medio Agar: Agar para Conteo en placa (PCA)

5.3.1 Composición

Digerido enzimático de la caseína 5,0 g

Extracto de levadura 2,5 g
Glucosa, anhidro (C6H12O6) 1,0 g
Agara 9 g to 18 g
Agua 1 000 mL
a
Dependiendo de la fortaleza del agar.
4
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Cuando se examinan productos lácteos, adicione 1.0 g de leche descremada en polvo por litro de
medio de cultivo. La leche descremada en polvo debe estar libre de sustancias inhibitorias.

5.3.2 Preparación

Disolver los componentes o el medio completo deshidratado en el agua, mediante calentamiento si

fuera necesario. Mezclar vigorosamente y dejar reposar varios minutos.

Ajuste el pH (6.4), si fuera necesario, de manera tal que después de la esterilización sea de
7,0 ± 0,2 a 25 °C.

Dispensar el medio en tubos, frascos o botellas de capacidad adecuada. Esterilizar en autoclave

(6.1) a 121 °C por 15 min.

Si el medio es para ser usado inmediatamente, enfriar en baño de agua (6.3) de 44 °C a 47 °C. Si
no, almacenar en la oscuridad a temperatura de (5± 3)°C por no más de 3 meses, bajo condiciones
que no permitan ningún cambio en su composición y propiedades.

Antes de comenzar el examen microbiológico, fundir completamente el medio, y luego enfriarlo de

44 °C a 47 °C en un baño de agua antes de su uso. Véase NC-ISO 11133.

Usar el agar fundido tan pronto como sea posible; este no debe ser retenido por más de 4 horas.

5.3.3 Pruebas de desempeño para el medio de cultivo

5.3.3.1 General

El agar de recuento en placa es un medio no selectivo, usado en esta parte de la NC-ISO 4833
para verter en placa. La productividad debe ser comprobada de acuerdo a la NC-ISO 11133.
5.3.3.2 Productividad

Incubación (30 ± 1) °C por (72 ± 3) h

Cepas control Escherichia coli WDCM 00013 o WDCM 00012a [World date
Centre for Microorganism (WDCM)]
Bacillus subtilis subsp. spizizenii WDCM 00003a
Staphylococcus aureus WDCM 00032 o WDCM 00034

Medio de referencia Agar Triptona soya

Método de control Cuantitativo

Criterio Razón de productividad PR ≥ 0,7

a
Cepas que deben ser usadas como mínimo por el laboratorio usuario. Vea la referencia [7] para la
información de los números de colección de cultivos de cepas y detalles de contacto.
5.4 Medio para sobrecapa (si es necesario; ver 9.2.7)
5.4.1 Composición

5
NC-ISO 4833-1: 2014  NC

Agara 12 g a 18 g
Agua 1000 mL
a
Dependiendo de la fortaleza del agar.
5.4.2 Preparación

Adicione el agar al agua y caliente hasta ebullición, revolviendo frecuentemente hasta que el agar
esté completamente disuelto, o al vapor por cerca de 30 min.

Ajuste el pH (6.4), en caso de ser necesario, de manera que después de la esterilización sea
7,0 ± 0.2 a 25 °C.

Dispense el medio en los tubos de ensayo o frascos (6.8), con capacidad apropiada.
Esterilice en autoclave a 121 °C durante 15 min.

Si el medio va a usarse inmediatamente, enfríelo antes de usarlo en un baño de agua (6.5) de

44 ºC a 47 ºC. Si no, almacene en la oscuridad a una temperatura de 3 ºC ± 2 ºC no más de
3 meses, bajo condiciones en las que no se permita ningún cambio en su composición y
propiedades.

Antes de comenzar el análisis microbiológico, fundir completamente el medio, antes de usarlo,

enfriarlo en baño de agua (6.3) regulado de 44 ºC a 47 ºC. Vea NC-ISO 11133.

6 Aparatos y cristalería

La cristalería desechable es una alternativa aceptable ante la cristalería reutilizable si esta tiene las
especificaciones adecuadas.

Equipamiento usual en el laboratorio de microbiología, y en particular el siguiente:

6.1 Aparatos para esterilización seca (horno) o para esterilización húmeda (autoclave)

Ver NC-ISO 7218.

6.2 Incubadora: regulable a 30°C ± 1°C

6.3 Baño de agua: capaz de operar de 44 ºC a 47°C.

6.4 pH-metro: con precisión de calibración de ± 0,1 unidad de pH a 25 °C.

6.5 Placas Petri: de cristal o plástico, de 90 mm a 100 mm de diámetro.

6.6 Pipetas graduadas de descarga total: de 1 mL de capacidad nominal, graduada con

divisiones de 0,1 mL, ISO 835[1] de clase A, o pipetas automáticas, ISO 8655-2[2], usando puntas
estériles.

6.7 Contador de colonias: que consiste, por ejemplo, de una base iluminada con un fondo
oscuro, con lentes de aumento apropiados, pueden usarse lentes con un incremento de
aproximadamente 1,5 X, y un contador mecánico o electrónico digital.

6
 NC NC ISO 4833-1: 2014

6.8 Tubos de ensayo, frascos o pomos: de capacidad adecuada y que no excedan de 500 mL.

7 Muestreo

Es importante que el laboratorio reciba una muestra que sea verdaderamente representativa y que
no haya sido dañada o cambiada durante el transporte o el almacenamiento.

El muestreo no es parte del método especificado en esta Norma Cubana. Vea la norma específica
relacionada con el producto concerniente. Si no existe una Norma específica, se recomienda que
las correspondientes partes se pongan de acuerdo con respecto a este tema.

8 Preparación de la muestra de ensayo

Prepare la muestra de ensayo de acuerdo con la parte relevante de la ISO 6887, o ISO 8261, y a
la Norma específica del producto concerniente. Si no existe una Norma específica, se recomienda
que las partes correspondientes se pongan de acuerdo con respecto a este tema.

9 Procedimiento

9.1 Porción de ensayo, suspensión inicial y diluciones

Vea la parte relevante de la ISO 6887 y de la Norma específica del producto en cuestión.

9.2 Inoculación e incubación

9.2.1 Tome dos placas de Petri estériles (6.5). Usando una pipeta estéril (6.6), transfiera a cada
placa, 1 mL de la muestra de ensayo, si es líquido, ó 1 mL de la suspensión inicial en el caso de
otros productos (dilución 10-1).

9.2.2 Tome otras dos placas Petri estériles (6.5). Usando otra pipeta estéril (6.6), transfiera a cada
una de las placas 1 mL de la dilución 10-1 (si el producto es líquido) ó 1 mL de la dilución 10-2 (en el
caso de otros productos).

9.2.3 Si es necesario, repita el procedimiento con las diluciones sucesivas, usando una nueva
pipeta estéril para cada dilución decimal.

9.2.4 Si es apropiado y posible, seleccione solamente los pasos de las diluciones críticas (al
menos dos diluciones decimales consecutivas) para la inoculación de las placas de Petri en las
que se obtendrán conteos entre 10 y 300 colonias por placa.

9.2.5 Vierta aproximadamente de 12 mL a 15 mL de agar para conteo en placa (5.3) de 44 ºC a

47°C en cada placa de Petri. El tiempo que transcurre entre el final de la preparación de la
suspensión inicial (o de la dilución 10-1 si el producto es líquido) y el momento en que el medio
(5.3) es vertido en las placas, no deberá exceder los 45 min.

9.2.6 Mezcle cuidadosamente el inóculo con el medio de cultivo rotando las placas de Petri y deje
solidificar colocando las placas de Petri en una superficie fría y horizontal.

9.2.7 Después de la solidificación completa, y únicamente en el caso donde se sospeche que el

producto examinado contiene microorganismos cuyas colonias podrán tener un crecimiento de
7
NC-ISO 4833-1: 2014  NC

colonias expandidas (sábanas) en la superficie del medio, añada una sobrecapa de 4 mL de medio
(5.4) o de agar para conteo en placa (5.3) de 44 °C a 47 °C en la superficie del medio inoculado.
Deje que se solidifique tal como se especifica en 9.2.6.

9.2.8 Invierta las placas preparadas y colóquelas en la incubadora (6.2) a 30 °C ± 1 ºC, de acuerdo
a NC-ISO 7218. Incubar durante 72 h ± 3 h.

9.3 Conteo de las colonias

9.3.1 Después del período de incubación especificado (9.2.8), si es posible, retenga las placas con
menos de 300 colonias. Cuente las colonias en las placas (10.1) usando el contador de colonias
(6.7), si es necesario. Examine las placas bajo la luz suave. Es importante que las colonias
puntiformes se incluyan en el conteo, sin embargo es esencial que el operador evite confundir
estas colonias con las partículas de materia precipitada o no disuelta en las placas. Examine los
objetos dudosos cuidadosamente, usando un aumento mayor cuando se requiera, para distinguir
las colonias de la materia extraña.

9.3.2 Las colonias expansivas deben considerarse como colonias simples. Si menos de un cuarto
de la placa presenta sobre crecimiento con estas colonias, cuente las colonias en la parte no
afectada de la placa y calcule el número correspondiente de toda la placa. Si más de un cuarto
presenta sobre crecimiento con colonias expansivas, descarte el conteo.

10 Expresión de los resultados

10.1 Método de cálculo

Siga el procedimiento especificado en NC-ISO 7218

10.2 Precisión

10.2.1 General

Los datos de precisión se evaluaron para placas que contenían más de 15 y menos de
300 colonias. Los datos de la precisión dependen de la microbiota asociada y de la matriz de la
muestra. Los datos presentados se derivan de estudios colaborativos (ver referencias [4]-[6]) y son
válidos para leche cruda y pasterizada. Estos datos pueden usarse como estimados cuando se
determinan conteos de colonias en otro productos.

10.2.2 Repetibilidad

La diferencia absoluta entre dos resultados de ensayos simples independientes, obtenidos usando
el mismo método en material de ensayo idéntico en el mismo laboratorio por el mismo operador
usando el mismo equipamiento dentro de un intervalo de tiempo corto, no debe ser mayor que el
límite de repetibilidad, r = 0.25, en log10N, donde N es el número de microorganismos por mililitro
(correspondiente a 1.8 de la escala normal en microorganismos por mililitro).

NOTA: Este límite de repetibilidad se derivó de estudios colaborativos para leche cruda y pasterizada (ver
referencias [4] - [6]) y pueden ser usadas para tales productos.

8
 NC NC ISO 4833-1: 2014

10.2.3 Reproducibilidad

La diferencia absoluta entre dos resultados de ensayo simples, obtenidos usando el mismo método
en material de ensayo idéntico en diferentes laboratorios con diferentes operadores usando
equipamiento diferente, no debe ser mayor que el límite de reproducibilidad, R = 0.45, en log10N,
donde N es el número de microorganismos por mililitro (correspondiente a 2.8 de la escala normal
en microorganismos por mililitro).

NOTA: Este límite de reproducibilidad se derivó de estudios colaborativos para leche cruda y pasterizada
(ver referencias [4] - [6]) y pueden ser usadas para tales productos.

10.3 Interpretación de los resultados de los ensayos

10.3.1 General

En los ejemplos (10.3.2 y 10.3.3) son considerados los datos de la precisión promedio, un nivel de
probabilidad del 95 % y el análisis de una muestra. Debe notarse que, en la práctica, se utiliza a
menudo el promedio de algunas muestras. Las cifras están expresadas en números de
microorganismos por mililitro.

10.3.2 Condiciones de repetibilidad

Primer resultado: 105 = 100 000

La diferencia entre el primer y el segundo resultado no debe ser mayor que 0,25 log10 N.

Segundo resultado: límite inferior: 104,75 = 56 000

Límite superior: 105,25 = 178 000

La diferencia entre el primer y el segundo resultado es aceptable si el segundo resultado no es

menor que 56 000 ó no es mayor que 178 000.

10.3.3 Condiciones de reproducibilidad

Resultados obtenidos en el primer laboratorio (promedio de determinación por duplicado): 105 =

100 000

La diferencia entre el primer y el segundo resultado obtenido en el segundo laboratorio no debe ser
mayor que 0,45 log10 N unidades:

Segundo resultado: límite inferior: 104,55 = 36 000

Límite superior: 105,45 = 280 000

La diferencia entre los resultados obtenidos por el primer y el segundo laboratorio es aceptable, si
el segundo laboratorio obtiene un resultado que no es menor que 36 000 y no mayor que 280 000.

El anexo A muestra el cálculo y el uso de la diferencia crítica (DC) para interpretar los resultados.

9
NC-ISO 4833-1: 2014  NC

11 Informe de ensayo

El informe del ensayo deberá especificar:

a) toda la información necesaria para la identificación completa de la muestra;

b) el método de muestreo utilizado, si se conoce;

c) el método de ensayo utilizado, con la referencia a esta norma cubana.

d) todos los detalles operacionales no previstos en la presente Norma, o los opcionales, así como
los detalles o incidentes eventuales que puedan tener influencia en los resultados;

e) los resultados de ensayo obtenidos;

f) si la repetibilidad ha sido chequeada, el resultado estimado final obtenido.

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 NC NC ISO 4833-1: 2014

Anexo A
(informativo)

Uso de la Diferencia Crítica (DC) para la interpretación de los resultados

A.1 General

En los ejemplos (A.2 y A.3) se consideran, los datos de precisión promedio, un nivel de
probabilidad del 95 % y el análisis de una muestra. Debe notarse que, en la práctica, es usado a
menudo el promedio de varias muestras. Las cifras se indican en microorganismos por mililitro.

A.2 Condiciones de reproducibilidad

Los resultados obtenidos por el primer laboratorio (promedio de la determinación por duplicado):
105 = 100 000

La diferencia entre este resultado y el resultado obtenido por un segundo laboratorio (promedio de
n determinaciones; n = 2 en este ejemplo) es aceptable si no excede la diferencia crítica (DC), en
log10N unidades:

DC

donde:

r es el límite de repetibilidad;

R es el límite de reproducibilidad.

La diferencia entre los resultados obtenidos por el primer y el segundo laboratorio es aceptable si
el segundo laboratorio obtiene un resultado el cual no es menor que 104,59 = 39 000 ó no es mayor
que 105,41 = 257 000.

A.3 Comparación con un límite (prueba unilateral)

Límite: 105 = 100 000

La diferencia entre el límite y el resultado de laboratorio (promedio de n determinaciones; n = 2 en

este ejemplo) tiene que ser comparado con el límite de la diferencia crítica (LDC):

LDC

Los resultados de ensayo superiores a 10 5,24 = 174 000 no indican incumplimiento con el límite.

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NC-ISO 4833-1: 2014  NC

Bibliografía

[1] ISO 835, Laboratory glassware- Graduated pipettes

[2] ISO 8655-2, Piston –operated volumetric apparatus- Part 2: Piston pippetes

[3] ISO/TS11139:2006, Sterilization of health care products- Vocabulary

[4] PITON, C., GRAPPIN, R. A model for statistical evaluation of precision parameters of
microbiologic al methods: Application to dry rehydratable film methods and IDG reference methods
for enumeration of total aerobic mesophilic flora and coliforms in raw milk. J. AOAC, 74, 1991, pp.
92-103

[5] SCOTTER, S., ALDRIDGE, M., BACK, J., WOOd, R. Validation of European Community
methods for microbiological and chemical analysis of raw and heat-treated milk . J. Assoc. Publ.
Analyst., 29, 1993, pp. 1-32

[6] DAHMS, S., WEISS, H. Estimation of precision values for microbiological reference methods:
Standardized pour plate technique. Milchwiss., 53, 1988, pp. 555-559

[7] World Data Centre for Microorganisms. Reference strain catalogue pertainingto organisms for
performance testing culture media. Available (viewed 2013-03-06) at:
http://www.wfcc.info/pdf/WDCM_Reference_Strain_Catalogue.pdf

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