9/6/2022

Técnicas para el Análisis de proteínas

análisis de proteínas Aislamiento: lisis celular, destrucción
mecánica, etc.
Purificación: técnicas cromatográficas,
precipitación selectiva, etc.

Concentración: diálisis, etc.

Cuantificación: método de Biuret, método

de BCA, etc.
Caracterización: composición
aminoacídica, secuenciación, etc.
Proteómica: ciencia que estudia la estructura y función de las proteínas.
Química Biológica, UNAH
2022 Proteoma: conjunto de proteínas de un organismo.

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Aislamiento de proteínas Purificación de proteínas

• Precipitación por salado “salting-out”: se utilizan
• Lisis celular: solución concentraciones elevadas de sulfato amónico.
hipotónica, detergentes (RIPA,
NP40, etc.)
• Destrucción mécanica:
sonicación
• Congelación – descongelación:
uso de nitrógeno líquido

Aspectos a considerar:
• Tampón adecuado, pH
• Uso de disolventes orgánicos y/o detergentes.
• Temperatura
• Técnicas cromatográficas
• Inhibición de proteasas
• Técnicas electroforéticas

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Cromatografía en columna
Técnicas cromatográficas
1. Cromatografía en
columna:
• Cromatografía de
intercambio iónico
• Cromatografía de
filtración en gel
• Cromatografía de
afinidad

Modificado de: Nelson DL, Cox MM. Lehninger Principles

of Biochemistry. 5th edition, 2008.

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Cromatografía de intercambio iónico Cromatografía de intercambio iónico

Appling D-Biochemistry-Concepts and Connections-2016

Modificado de: Nelson DL, Cox MM. Lehninger Principles of Biochemistry. 5th edition, 2008. Appling D-Biochemistry-Concepts and Connections-2016

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Cromatografía de filtración en gel Cromatografía de filtración en gel

Modificado de: Nelson DL, Cox MM. Lehninger Principles of Biochemistry. 5th edition, 2008.
Appling D-Biochemistry-Concepts and Connections-2016

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Cromatografía de afinidad Cromatografía de afinidad

Modificado de: Nelson DL, Cox MM. Lehninger Principles of Biochemistry. 5th edition, 2008. Appling D-Biochemistry-Concepts and Connections-2016

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Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
Video:

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Técnicas electroforéticas
1. Electroforesis
unidimensional:
• Electroforesis nativa
• Electroforesis
desnaturalizante

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Puntos Isoeléctricos
Ala: 6 (0)
Lys: 9.7 (+)
Asp: 2.8 (-)

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Electroforesis en gel en dos dimensiones

Aplicaciones de la electroforesis
• Determinación de pesos moleculares
• Determinación del número de subunidades
• Identificación de proteínas cuando se acopla a reconocimiento por
anticuerpos (Western blot o Inmunoblot)

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Ejemplo: Flujograma para la purificación de hemoglobina recombinante

Concentración de proteínas: diálisis
Proceso mediante el cual se añaden o se eliminan
solutos de bajo peso molecular de una disolución
mediante la difusión a través de una membrana
semipermeable.

Appling D-Biochemistry-Concepts and Connections-2016

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Cuantificación de proteínas Caracterización de proteínas

• Método de absorción de luz UV (280 nm) Suele incluir procesos como:
• Método de Biuret • Composición aminoacídica
• Método de Bradford • Secuenciación de aminoácidos
• Método de BCA • Difracción de rayos X
• Método de Lowry • Resonancia magnética nuclear
• Métodos turbidimétricos
• Métodos de unión a colorantes

“A discutir en el laboratorio de Química Biológica”

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Composición de aminoácidos Composición de aminoácidos

• Primer paso en la caracterización de
una proteína • En el análisis por cromatografía de intercambio iónico
• Determinación del número de cada se aplica el hidrolizado a una columna que contiene
clase de residuo de aminoácidos una resina de intercambio catiónico (pH 3.0).
presente en la molécula. • Los aminoácidos se hacen reaccionar con Ninhidrina
(forman un color purpura).
1. Hidrólisis completa: HCl 6N, 10-100
horas, aplicación de calor (105-110°C/24
horas).
2. Análisis del hidrolizado: por
cromatografía de intercambio iónico o
por HPLC.

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Secuenciación de aminoácidos Proteasas de uso común:

Pasos:
• Ruptura de todos los puentes
disulfuro: oxidación con ácido
perfórmico, reducción con ditiotreitol Proteasa Sitio de corte
(DTT).
Tripsina Lys, Arg (C)
• Determinación de los aminoácidos Quimotripsina Phe, Trp, Tyr (C)
N-terminal y C-terminal: uso de
Fluor dinitro benceno (FDNB) para la Pepsina Phe, Trp, Tyr (N)
formación de derivados Paranitrofenil
(DNP) y uso de carboxipeptidasas, Asp-N-Proteasa Asp, Glu (N)
respectivamente.
Bromuro de cianógeno* Met (C)
• Rotura del péptido en fragmentos:
uso de diferentes proteasas.
* No es una proteasa.

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Secuenciación de aminoácidos
• Determinación de la
secuencia de los
fragmentos: degradación
de Edman con
isotiocianato de fenilo
(PITC), seguido del
análisis por HPLC.

• Ordenamiento de los
fragmentos peptídicos:
descubrir los fragmentos
solapantes.

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Gracias
¿Preguntas?

Créditos:
Jafet Ortíz MSc.
Heidy Cabrera MSc.
Miguel Zúñiga MSc.
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