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Analista
REVISIÓN CRÍTICA
Publicado el 13 de marzo de 2014. Descargado por la Universidad de Arizona el 20/06/2014

Medición de masas de grandes biomoléculas y

biopartículas mediante técnicas de espectrometría de
Cite esto: Analista, 2014, 139, 3507
masas
Wen-Ping Peng,* Szu-Wei Chou y Avinash A. Patil

Recibido el 17 de diciembre de
2013 Aceptado el 13 de marzo de
2014
DOI: 10.1039/c3an02329j
www.rsc.org/analyst
08:25:22.
Las grandes biomoléculas y biopartículas desempeñan un papel fundamental en la biología, la química, la ciencia
biomédica y la física. La masa es un parámetro crítico para la caracterización de grandes biomoléculas y biopartículas.
Para lograr el análisis de masas, la elección de una fuente de iones adecuada es el p r i m e r paso y los instrumentos
de detección de i o n e s , masa
También hay que tener en cuenta los analizadores y detectores. Se han utilizado numerosas técnicas de espectrometría
de masas
propuestas para determinar las masas de grandes biomoléculas y biopartículas, y estas técnicas pueden dividirse
en dos categorías. La primera categoría mide la masa (o el tamaño) de las partículas intactas, e incluye la
espectrometría de masas con trampa de iones cuadrupolar de una sola partícula, la espectrometría de masas
celular, la espectrometría de masas con detección de carga y el análisis de masas con movilidad diferencial; la
segunda categoría tiene como objetivo medir la masa y la masa en tándem de los i o n e s biomoleculares, e incluye
la espectrometría de masas con trampa de iones cuadrupolar, la espectrometría de tiempo de vida.
espectrometría de masas, la espectrometría de masas cuadrupolar ortogonal y la espectrometría de masas
orbitrap. Además, los algoritmos para la asignación de masa y estequiometría de la masa de electrospray
se desarrollan para obtener información precisa sobre la estructura y las combinaciones de subunidades.

1. Introducción Hasta ahora, sigue siendo un reto detectar biopartículas con

Las técnicas de espectrometría de masas pueden aplicarse para
adquirir las masas y fragmentos de grandes biomoléculas y
biopartículas, lo que facilita el estudio de los procesos
biológicos, la interacción de las biomoléculas y sus estructuras
y funciones. 1-3 Los tamaños de las grandes biomoléculas y
biopartículas están en el rango de 1 nm a 100 mm. Estas
grandes biomoléculas y biopartículas incluyen complejos de
proteínas, virus, bacterias y células.
Departamento de Física, Universidad Nacional Dong Hwa, Shoufeng, Hualien,
97401, Taiwán, República de China. Correo electrónico: pengw@mail.ndhu.edu.tw
tamaños de 20 nm a 100 nm. 4,5 Muchos grupos de
investigación han intentado desarrollar espectrómetros de
masas para detectar masas de estos tamaños. En general, un
espectrómetro de masas incluye una fuente de iones, un
analizador de masas y un detector y, por lo tanto, la selección
de fuentes de iones y el diseño de analizadores y detectores de
masas viables son una necesidad. 6
Los iones son un tema primordial para el análisis de masas.
Las fuentes de iones utilizadas en la espectrometría de masas
(EM) para iones grandes incluyen la ionización por elec-
trospray (ESI),7 la desorción/ionización láser asistida por matriz
(MALDI)8,9 y la desorción acústica inducida por láser (LIAD).
10-12
Con una fuente de iones ESI, las proteínas, los

Wen-Ping Peng se graduó en el espectrometría de masas con

Departamento de Física de la trampa de iones (EM), la EM
Universidad Nacional de Taiwán preparativa, la teoría y el
en 2004. Es profesor asociado de desarrollo de algoritmos para la
física en la Universidad asignación de masas de los
Nacional Dong Hwa de Taiwán. espectros de masas con
Su programa de investigación electrospray,
actual se centra en la Desarrollo de un algoritmo de huella digital para la identificación de
instrumentación de la microorganismos.
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cación, y la identificación de biomarcadores de microorganismos. Szu-Wei Chou se licenció en
química por la Universidad
Nacional Sun-Yet San de Taiwán
en 2009. Fue asistente de
investigación en el Laboratorio
de Espectrometría de Masas
Biofísica bajo la dirección del
Dr. Wen-Ping Peng en la
Universidad Nacional Dong
Hwa de 2010 a 2013. Realiza un
máster en electrónica y física
médica en la Queen Mary,
Universidad de Londres. Está
interesado en la instrumentación
de la espectrometría de masas,
los sensores químicos y
biológicos y el procesamiento de
señales.

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Los complejos víricos y las cápsides virales se generan en el la detección de iones MALDI de
aire y se mantienen intactos en el vacío. 13-17 Una fuente de alta masa y en la transmisión de
iones ESI puede producir múltiples iones cargados, con una iones de alta masa en el
relación masa-carga (m/z) inferior a 100 000. Sin embargo, espectrómetro de masas de
cuando el tamaño de la partícula es grande, las partículas trampa de iones rectilínea con
adquieren cargas más altas en las superficies (típicamente detección de carga.
>50+) y causan series de iones altamente superpuestas, El estudio continuado de estos sistemas hará avanzar las
haciendo que la asignación de carga sea difficulta. 18-20 Por el tecnologías de detección/cuantificación de cargas y de aterrizaje
contrario, la fuente de iones MALDI genera sobre todo picos de iones de biopartículas de gran masa.
con carga simple o doble, que pueden asignarse fácilmente.
Los iones intactos pueden producirse por irradiación láser en
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un cristal matriz. Cuando se analizan iones grandes, se

encuentra la formación de partículas en el rango de tamaño de
10 nm a 1000 nm, mediante la irradiación de muestras de
matriz MALDI. 21,22 Las partículas de la matriz interferirán con
las partículas virales (el rango de tamaño de 20 nm a 300 nm)
durante el proceso de desorción del láser y, por lo tanto,
obstaculizarán el análisis de grandes biopartículas. Además,
cuando la masa de la partícula es grande (>100 kDa), su
velocidad iónica es baja, lo que hace que la detección de iones
de alta masa sea muy difícil. 23-25 Además, el análisis de masas
en tándem de los iones MALDI es útil para adquirir la
información estructural, pero aún no está bien estudiado, para
m/z > 12 000.26 La fuente de iones LIAD es favorable para
generar partículas con un tamaño superior a 50 nm mediante
ondas acústicas. 12,27,28 Se pueden generar múltiples iones
precargados
sin interferencia de la matriz y se ha ajustado a un análisis de
una sola partícula con detección óptica y de carga. 12,27 El
El inconveniente de una fuente de iones LIAD es la baja
efficiencia de generación de iones.
A los iones generados hay que transportarlos y
guiados a los analizadores de masas para el análisis de masas.
08:25:22.

Normalmente, reduciendo la frecuencia de conducción del

cuadrupolo de guía y aumentando la presión del gas buffer, los
iones de alta masa pueden ser enfriados y guiados a los
analizadores de masas. 29-33 La masa
Los analizadores se pueden dividir en trampas de iones y cate
gorías. Los analizadores de masas con trampa de iones, como las
trampas de iones cuadrupolares (QIT) bidimensionales34-37 y
tridimensionales,38,39 la trampa de iones de compuerta DC40 y la
orbitrap31,32,41 muestran buenas efficiencias de captura de
partículas grandes. Los analizadores de masas con tiempo de
visión (TOF) pueden funcionar en modo lineal, reectrón y
ortogonal y acoplarse a un cuadrupolo para la selección de
masas, la activación de iones y el aislamiento. 29,30
Además, ningún analizador de masas puede cubrir completamente
toda la gama de tamaños

Avinash A. Patil se licenció en

física por la Universidad Shivaji
de la India en 2011. Es
estudiante de doctorado en el
Laboratorio de Espectrometría
de Masas Biofísica bajo la
dirección del Dr. Wen-Ping
Peng en la Universidad
Nacional Dong Hwa. Su
investigación actual se centra en
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de las nanopartículas. Si se conoce la densidad de las iones fragmentarios se adquieren con la MS TOF cuadrupolar
partículas, el tamaño de las mismas puede convertirse en una ortogonal. 19,60 La MS de Orbitrap es ahora capaz de analizar
masa de partículas. Por lo tanto, el análisis de movilidad grandes complejos proteicos, de hasta 1 MDa, y su capacidad de
differencial (DMA), acoplado a una fuente de iones de MS en tándem alcanza la MS3 con una alta resolución de masa.
31,32
electrospray, ofrece un enfoque alternativo para medir el Los espectros de masas de alta calidad permiten el estudio
tamaño de las partículas effectivas y, por lo tanto, caracterizar de alto rendimiento de grandes iones ESI. Para
grandes biomoléculas y nanopartículas, que van desde unos agilizar la identificación de la masa, la estequiometría y la
pocos nanómetros hasta varios cientos de nanómetros. 42–44 interacciones de differentes subunidades, se desarrollaron
Los detectores se incorporan a los analizadores de masas nuevos algoritmos, como AutoMass19 y Massign,20.
para detectar los iones. La principal razón por la que los
espectrómetros de masas convencionales no pueden detectar
iones de gran masa es el uso de un detector de electrones
secundarios, como un multiplicador de electrones y placas
multicanal (MCP), que provocan bajos rendimientos de
electrones secundarios de iones de gran masa. Por lo tanto, se
han diseñado nuevos detectores, incluyendo un detector de
carga,27,40 un detector de nanomembrana,45,46 un detector de iones
secundarios 47,48
, un detector de píxel activo,49 y un criodetector50
que se incorporan a los analizadores de masas para superar
ese problema. 46,47,51,52
En general, al determinar las masas de grandes
biomoléculas y biopartículas, podemos dividir las técnicas de
espectrometría de masas en dos categorías. La primera
categoría tiene como objetivo medir
las masas de las partículas intactas, incluidas las de una sola
partícula cuádruple.
rupole ion trap mass spectrometry,12,28,53 cell mass spectrom-
etry,27,54 charge detection mass spectrometry40,55,56 and
differential mobility mass analysis. 42,43 En la espectrometría de
masas con trampa iónica de cuadrupolo simple
de masas con trampa y la espectrometría de masas celular, los
detectores, como la dispersión de la luz, o la uorescencia
inducida por láser, un detector de carga y un multiplicador de
electrones se desarrollan para
superar el límite de detección de grandes biomoléculas y
biopartículas. La espectrometría de masas de detección de
carga adopta un detector de carga no destructivo para detectar
la carga de imagen de las partículas. El análisis de masas de
movilidad diferencial emplea los contadores de partículas por
condensación (CPC) para detectar ópticamente las
nanopartículas. La segunda categoría se centra en la masa y la
masa en tándem
medición de iones biomoleculares, incluyendo la
espectrometría de masas con trampa iónica cuadrupolar, 57-59
espectrometría de masas con tiempo de visión,23,24,46
espectrometría de masas con tiempo de visión cuadrupolar
ortogonal29,30 y espectrometría de masas orbitrap. 31,32,41
Cuadrupolo
La espectrometría de masas con trampa de iones utiliza un
multiplicador de electrones para adquirir los espectros de
masas de grandes proteínas. La espectrometría de masas con
tiempo de visión se acopla a varios detectores, entre ellos un
detector de placa de microcanal, un detector de iones
secundarios, un detector criogénico, un detector de
nanomembrana y un detector de carga, para ampliar el límite
de detección de las grandes proteínas. Espectrometría de
masas ortogonal de tiempo de visión cuádruple y orbi-
La espectrometría de masas con trampa puede realizar análisis
de masas en tándem y
análisis de alta resolución de masas.
La EM de tiempo de visión cuádruple ortogonal y la EM
orbitrap desempeñan ahora un papel importante en la
espectrometría de masas nativa. 1 Grande
Las cápsides virales, como las del virus de la hepatitis B, y sus

4 | Analista, 2014, 139, 3507-3523 Esta revista es © The Royal Society of Chemistry 2014
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con la espectrometría de masas con trampa de iones cuadrupolar.

2. Fuentes de iones 12,27,28

2.1. Ionización por electrospray

Dole et al. desarrollaron la ionización por electrospray para 3. Instrumentación
generar un haz molecular de macroiones. 61 Los macroiones de
poliestireno con un peso molecular de hasta 411.000 amu de 3.1. Espectrometría de masas con trampa iónica
media parecen ser, en su mayoría, especies individuales con cuadrupolar y espectrometría de masas con trampa iónica
carga múltiple. Un hito importante fue alcanzado por Fenn et lineal
al. que aplicaron la técnica ESI para generar oligo- nucleótidos Una trampa de iones cuadrupolar (QIT) es un dispositivo de
y proteínas, y se obtuvieron proteínas con pesos moleculares de trampa de iones adecuado para la medición de masa no
hasta 130 000 Da. 7 Robinson et al. realizaron una destructiva de los
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impresionante medición de masas de la cápside viral del

bacteriófago MS2
de hasta 2,5 × 106 Da y con un estado de carga de ~113,62 El
Las cápsides virales del bacteriófago MS2 permanecieron
intactas durante su
ón y se disociaron en subunidades monoméricas. Benner y
Siuzdak et al. utilizaron la ESI para generar virus del mosaico del
tabaco (TMV) en fase gaseosa, con cargas de hasta varios
cientos. 14 Hepatitis B
(HBV),60 el virus Norwalk63 y los virus bacteriófagos HK9764
con pesos moleculares de unos pocos MDa fueron generados por
ESI y analizados por un instrumento Q-TOF modificado por Heck
et al.
estudios demostraron que una fuente de iones ESI acoplada a
la masa
La espectrometría es una poderosa técnica analítica para
generar macros y obtener la información estructural de los
iones.

2.2. Ionización por desorción láser asistida por matriz

Tanaka et al. generaron primero polímeros y proteínas hasta
m/z 100 000 con la desorción/ionización por láser de un polvo de
08:25:22.

nanogold dispersado en glicerol y adquirieron los espectros de

masas. 8 Karas y Hillenkamp informaron de que la
desorción/ionización láser asistida por matriz mediante
irradiación ultravioleta podía obtener la masa
de las proteínas. 9 Hillenkamp et al. utilizaron además un láser
infrarrojo para adquirir los espectros de masas de ADN
sintético, fragmentos de enzimas de restricción de ADN
plasmídico y transcripciones de ARN, hasta un tamaño de 2180
nucleótidos. 25 Li y Schriemer generaron polímeros de hasta 1,5
MDa y detectaron las señales de iones de doble carga. 23 No sólo
se pueden generar polímeros y proteínas mediante fuentes de
iones MALDI, sino que también se pueden formar
nanomateriales en la fase gaseosa; se detectaron
nanopartículas de ZnS65 y Pt66 con un espectrómetro de
masas TOF. Los bajos estados de carga de los iones MALDI
hacen que la asignación de masas sea sencilla y directa.

2.3. Desorción acústica inducida por láser

La desorción acústica inducida por láser (LIAD) puede generar
grandes iones. Chen et al. adoptaron la LIAD para desorber
partículas de Al2O3 de 20 mm de tamaño y la proteína citocromo
c de un sustrato de zafiro. 10 Además, las ondas acústicas
superficiales pueden desprender las partículas de la superficie de
un sustrato de muestra, lo que mejora la effec- tividad de la
limpieza, como demostraron Kolomenskii et al. 67 Las partículas
virales, las bacterias y las células se desorben mediante LIAD
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nanopartículas y para la medición de masa destructiva de Recientemente, McLuckey y Prentice desarrollaron el análisis de
grandes iones. La medición de masa no destructiva se inestabilidad selectiva de masas mediante el barrido de un
remonta a la década de 1950. 68 Se atraparon micropartículas voltaje de corriente continua (cc) aplicado a los electrodos de
individuales y se analizaron mediante dispersión de luz, la tapa, mientras se mantiene el
uorescencia inducida por láser y potencial de radiofrecuencia (rf) a un valor xed en un QIT. 59 Ellos
los métodos de detección de cargas. La medida destructiva de
la masa- i o n e s expulsados a lo largo de la línea de inestabilidad bz ¼
El proceso se realiza con un multiplicador de electrones y un 0 en la dirección
detector de carga. Para expulsar los iones, se aplica un modo desde una alta relación masa-carga (m/z) hasta una baja m/z.
Se observaron iones de piruvato quinasa con doble carga a m/z
de "inestabilidad selectiva de masa" en una trampa de iones
~ 131 000. La combinación de QIT y un detector
cuadrupolar. Una amplitud o una frecuencia de rf debe
multiplicador de electrones suffers
para adquirir los espectros de masas. El escáner de frecuencia
emplea el amplificador de potencia de banda ancha, por lo de una pobre efficiencia de conversión de iones en electrones
que puede cubrir fácilmente un amplio rango de masas. El secundarios y
escáner de voltaje necesita un amplificador de potencia para
elevar un transformador a varios miles de voltios. Debido al
elevado Q
de un transformador, es muy difícil cubrir un amplio rango de
masas con un escáner de tensión. Por lo tanto, una
exploración de frecuencia es superior a una exploración de
tensión. 54,57,69
La ventaja de la trampa de iones lineal (LIT) es su alta
capacidad de iones y su capacidad de MSn. 34,38 Una LIT es
favorable para almacenar más iones y permite el análisis en
tándem de los iones atrapados. Una multiplicidad de electrones y
una alta presión de gas affer la detección de biopartículas con
una LIT. 70 Se necesita un gas buffer alto para enfriar los iones
cuando el tamaño de los iones es mayor, pero un multiplicador
de electrones no puede funcionar en estas condiciones.
Normalmente, el voltaje del dinodo de conversión debe ser lo
suficientemente alto (>10 kV) para conseguir una alta ganancia
de señales de iones, pero la alta presión del gas bu ffer provocará
la descarga de un multiplicador de electrones. Un detector de
carga acoplado al LIT-MS puede trabajar en condiciones de alta
presión sin el problema de la descarga y, por tanto, mejora la
detección de señales de iones de alta masa.
3.1.1. Multiplicador de electrones. La sensibilidad de un
detector de electrones secundarios (por ejemplo, un
multiplicador de electrones y placas de microcanales)
disminuye a medida que n4,4, donde n es la velocidad del ion
incidente. 45,46 Esta relación de velocidad conduce a una
notable disminución de la sensibilidad de esos detectores para
iones grandes y pesados. Para
Para detectar iones MALDI de alta masa con un
multiplicador de electrones, Schlunegger et al. adoptaron por
primera vez un QIT tridimensional con el método de barrido
de frecuencia para cubrir un rango de masas elevado. 57 Por
Utilizando bajas frecuencias (por debajo de 100 kHz) y bajas
amplitudes (por debajo de 200 V), se atrapan iones de alta
masa con carga única de albúmina de suero bovino (BSA) e
inmunoglobulina G (IgG) y se analizan mediante un método
de barrido de frecuencia. El instrumento mostró una buena
sensibilidad, una relación señal/ruido (10 : 1) y una
resolución de masa de 70. Ding et al. propusieron utilizar una
trampa de iones digital de barrido de frecuencia acoplada a
fuentes de ionización por electrospray (ESI) y de
desorción/ionización láser asistida por matriz a presión
atmosférica (AP-MALDI) para demostrar la capacidad del
método digital. Se generaron 69 espectros de masas AP-
MALDI de iones de mioglobina de corazón de caballo con
carga simple (17 000 Th) utilizando un voltaje de captura de
sólo 1000 V y se alcanzó una resolución de masa de 2100.

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baja velocidad de eyección de iones y, por lo tanto, la
efficiencia de detección de iones de alta masa es pobre.
La LIT MS comercial, que funciona a una frecuencia de
~1 MHz, puede detectar un rango de masas de hasta m/z
~4000. Para ampliar el rango de masas del LIT MS, Chen et
al. desarrollaron un
espectrómetro de masas LIT de barrido de frecuencia con una
frecuencia de conducción de rf baja. 70 Adoptaron el método de
barrido de frecuencia para cubrir el amplio rango de masas y
elevaron el voltaje del dinodo de conversión hasta -30 kV
para aumentar las señales de los electrones secundarios y
Publicado el 13 de marzo de 2014. Descargado por la Universidad de Arizona el 20/06/2014
Trevitt et al. combinaron la medición de la frecuencia
secular con la medición de la dispersión Mie de una sola
partícula y descubrieron que pequeñas incertidumbres en la
medición de la frecuencia secular daban lugar a errores
significativos en la masa absoluta
y cargas. Sin embargo, la desalineación de los electrodos QIT
era pequeño y el parámetro de la trampa z0 es apropiado. 80 Para
superar la baja efficiencia de recogida de luz del QIT, Nie et al.
utilizaron una trampa de iones cilíndrica (CIT) para sustituir los
electrodos de la tapa por una placa de vidrio eléctricamente
conductora, que permite la recogida

>10% de la luz que irradia la partícula atrapada. En

Los iones de inmunoglobulina secreta de carga única A (385
kDa) fueron
detectadas. Reilly et al. demostraron que las proteínas intactas
con carga simple en el rango de 10 a 200 kDa y las partículas
de urea de 1,5 MDa pueden ser detectadas por una trampa de
iones de cuadrupolo lineal. 71
3.1.2. Dispersión de la luz. El fotón es una partícula
luminosa fundamental y es utilizado por el método de
dispersión de la luz para detectar iones, debido a su alta
sensibilidad. El experimento de la gota de aceite de Millikan
fue el primero en medir las cargas de las micropartículas por
método de dispersión de la luz. 72 Wuerker et al. demostraron la
para atrapar y detectar micropartículas individuales utilizando
un espectrómetro de masas QIT. 68 Hars y Tass propusieron
además medir el movimiento de los iones en forma de estrella
en el plano radial para determinar la masa de una sola
partícula en el rango de 109 a 1012 Da con una precisión de 10-
3;73 sin embargo, los cambios en los estados de carga no eran
obvios debido a las multipartículas
aglomeración durante la inyección de iones. Schlemmer et al.
desarrollaron una técnica de transformación rápida de Fourier
para medir la masa de una sola partícula en el plano r-z. 74,75 Se
atraparon partículas de SiO2 de 500 nm en una trampa de
08:25:22.

iones con una resolución (desviación de masa) de 10-4,

en una medición de 10 s. Cai et al. utilizaron además el QIT
para atrapar y
expulsar micropartículas, y los iones se detectaron mediante
un método de dispersión de luz. 76,77 Los espectros de masas de
una sola partícula se adquirieron en un modo de inestabilidad
de masa selectiva, sin embargo, el
Los estados de carga absolutos de las partículas atrapadas no
se conocían en este estudio. Peng et al. observaron un patrón
de estrella estacionaria al ne- sintonizar la frecuencia de
conducción para que resonara con el secular radial
en un QIT y se obtuvo una fórmula analítica de la frecuencia
secular que es válida para qz < 0,8.12,53 Se generaron células
individuales intactas de Escherichia coli mediante una fuente
de iones MALDI y se midió su masa absoluta. 53 Además, con
una fuente de iones de desorción acústica inducida por láser
(LIAD), se pueden generar virus, bacterias y células enteras de
mamíferos sin la confusión causada por las agrupaciones
MALDI. Se puede medir el m/z de una partícula
con una precisión muy alta, de hasta 10-4.78,79 El QIT MS
adoptado
un detector de voltaje promedio pico a pico para medir la
amplitud de rf, que se traza a una fuente de rf estándar y, por
lo tanto, la QIT MS puede utilizarse como medición
estándar de la masa de las partículas, con el tamaño de las
partículas superior a 300 nm. 79

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detectó con éxito el adenovirus humano recombinante de tipo 5 trampa de iones digital,69 lo que favorece el desarrollo de un
(Ad5), el iridovirus del mero (GIV) y el virus de la vaccinia instrumento en miniatura con circuitos de conmutación,
(VV) con tamaños que van de 80 a 300 nm. 28 en lugar de un amplificador de potencia. La potencia de un
3.1.3. Uorescencia inducida por láser. La uorescencia instrumento CMS
inducida por láser (LIF) se utiliza ampliamente en la citometría puede reducirse en gran medida. Para reducir el tamaño de la
para medir la distribución del tamaño de las nanopartículas. Cai
et al. intentaron por primera vez integrar la LIF con un QIT para trampa de iones, Nie et al. han demostrado que un
conectar partículas individuales, con una masa superior a 5 MDa espectrómetro de masas con trampa de iones cilíndrica en
en una trampa. 81 Observaron con éxito nanoesferas individuales miniatura (CIT-MS) equipado con una bomba mecánica puede
uorescentes de 27 nm, que contenían 180
medir las masas de células y micropartículas. 87
equivalentes de colorante de uoresceína y una relación media
señal/ruido
de 10. Además, adoptaron otro QIT para enfriar las
nanopartículas dentro del QIT y controlar el LIF del
partículas atrapadas, para adquirir los espectros de masas de
las partículas individuales. 58,81 Esta conguración amplió el
análisis de masas de las nanopartículas con m/z > 105.5
Recientemente, Talbot et al. utilizaron LIF para
visualizar poblaciones de iones gaseosos almacenados en un
espectrómetro de masas con trampa de iones cuadrupolar
(QIT). Esta técnica podría ayudar a entender el movimiento
colectivo de los iones y el comportamiento de expulsión de
los iones de alta masa bajo una alta buffer presión de gas. 82
3.1.4. Detector de carga. La espectrometría de masas QIT
de una sola partícula puede medir biopartículas intactas,
incluyendo virus, bacterias y células enteras de mamíferos,
con gran precisión. 4 Sin embargo, se tarda entre 15 y 30
minutos en determinar la masa absoluta de
cada partícula atrapada. Peng et al. propusieron por primera
vez la carga-moni
tación de masas por desorción acústica inducida por láser
(CMS) para la medición rápida de la masa de células y
micropartículas. 27,54 El CMS mide simultáneamente la
relación masa-carga (m/z) y las cargas totales (z) de una
partícula. Normalmente, se adquieren más de 5 partículas con
una relación S/N de 10 en un segundo. El ruido de fondo del
detector de carga es de aproximadamente
500 e. CMS midió con éxito differentes tipos de células
mononucleares (linfocitos CD3+ y monocitos CD14+) y
células cancerosas. Nie et al. siguieron este enfoque para
adquirir la masa y las distribuciones de masa de di fferentes
glóbulos rojos. 83 A
resolución de masa de ~100 y una precisión de masa de ~1%
puede ser
logrado con este CMS de barrido de frecuencia. 84 Chen et al.
midieron la distribución de masa de los cúmulos de la matriz
del ácido sinapínico desde el monómero hasta la región MDa
con un CMS. 22 En el CMS, los armónicos
Los ruidos de interferencia de una fuente de alimentación de
CA y el ruido de interferencia de la tensión de rf a ffectan la
detección de un detector de carga. Chou et al. propusieron un
enfoque de ltering de descomposición de paquetes de ondas
ortogonales (OWPD) para eliminar las interferencias de los
espectros de masas adquiridos. Los espectros de masas
de micropartículas y de Escherichia coli se obtuvieron sin
interferencias de rf. 85 Cuando se aplica rf en un QIT en
condiciones de alta presión (~80 mTorr), se produce un arco
indeseado; por ello, Xiong et al. adoptaron formas de onda
rectangulares y triangulares para reducir la tensión de inicio y
encontraron su masa
resolución era la misma que la de una forma de onda
sinusoidal convencional. 86 Además, una técnica de forma de
onda rectangular puede detectar iones grandes con una
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Una fuente de iones MALDI se suele acoplar a un espectrómetro
de masas de tiempo de visión (TOF). 93 El rango de masas del TOF
MS debe
ser ilimitado en teoría; sin embargo, su rango de masa está
limitado por la sensibilidad del detector, en la práctica. Los
detectores convencionales de electrones secundarios, por
ejemplo el MCP, se incorporan a la MS TOF y el límite de
detección es <1 MDa. Los detectores de iones secundarios, los
detectores criogénicos, un detector de píxel activo y la
nanomembrana
Publicado el 13 de marzo de 2014. Descargado por la Universidad de Arizona el 20/06/2014

Fig. 1 (a) Configuración experimental de un CMS de desorción ambiental que

consiste en una fuente de iones AD, un analizador de masas QIT y un
detector de carga.
(b) Esquema del proceso de desorción ambiental. Las micropartículas son
desorbidas por la fuerza aerodinámica y aspiradas en el espectrómetro de
masas cuando la interfaz atmosférica discontinua (DAPI) estaba abierta.
Reimpreso con permiso de la ref. 91.

En las aplicaciones, el CMS se utiliza para medir la

cantidad de nano/micropartículas como portadores efficientes
para la administración de fármacos. 88,89 La medición
cuantitativa de la captación celular de nano/micropartículas es
de gran importancia para la elucidación de los mecanismos de
endocitosis y exocitosis celular. Descubrimos que el CMS podía
utilizarse para medir no sólo la captación celular de
nanopartículas metálicas, sino también la de
nano/micropartículas no metálicas, y que reducía
enormemente el tiempo de análisis en comparación con los
enfoques convencionales, como la espectrometría de masas con
plasma acoplado inductivamente (ICP-MS), que se limita a las
nanopartículas metálicas. Nie et al. utilizaron el CMS para
caracterizar los materiales de empaquetado de la columna en la
08:25:22.

cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). 90 El

desviación de la masa de las partículas de sílice aerodinámica por
También se pueden determinar las diferentes longitudes de las
cadenas alquílicas mediante el CMS. La superficie específica,
la carga de carbono y la distribución de tamaños de los
materiales de empaquetamiento también se caracterizan
simulta- riamente.
neamente. Nie et al. demostraron que el CMS puede incorporarse
con una fuente de desorción ambiental para medir las masas de
las micropartículas. 91 Este método de desorción ambiental
explotó la interfaz de presión atmosférica discontinua (DAPI)
para generar y desorber micropartículas bajo presión
atmosférica.
seguro, con una flecha pulsada, como se muestra en la Fig. 1.
Bacterias, células,
Los poliestirenos, los diamantes sintéticos y las partículas de
sílice pueden desorberse directamente en condiciones
ambientales.
Además, un detector de carga puede medir la cantidad de
moléculas. Peng et al. midieron por primera vez las señales de
C60 con un QIT MS,27 mientras que Chen et al. midieron los
iones de IgG e IgM. 92 Para
aumentar el número de iones y la señal iónica, una posible
forma es incorporar un detector de carga con LIT-MS.

3.2. Espectrometría de masas con tiempo de observación

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se proponen para superar el límite de detección de la TOF MS detectores criogénicos son una unidad de enfriamiento
y ahora son capaces de detectar iones con una masa >1 MDa. criogénico costosa, áreas de detección activas bajas y un
3.2.1. Placas de microcanal. El detector de placa de tiempo de respuesta largo, por lo que restringen su uso
microcanal se utiliza ampliamente en la EM TOF. La detección práctico.
de IgM humana a m/z aproximadamente 1 MDa fue lograda por 3.2.4. Detector de nanomembrana. Un detector de
Williams et al. 24 Li et al. demostraron además la detección de nanomembrana basado en la deformación mecánica y la
señales de poliestireno de doble carga con un peso molecular vibración de una nanomembrana fue desarrollado para superar
de hasta 1,5 millones. 23 Sin embargo, la relación señal/ruido la detección de iones de alta masa por Blick et al. 45,46 La Fig. 2
era pobre y cercana al límite superior de un detector MCP. muestra el diseño esquemático de un detector de
Para mejorar la sensibilidad de un detector MCP, Heeren et nanomembrana con TOF MS. Vibraciones mecánicas de la
al. desarrollaron un detector de píxel activo (sistema de nanomembrana excitadas por el bombardeo de iones
detección basado en MCP). La relación señal/ruido puede
mejorarse hasta
un factor de ~4 en la detección de moléculas de IgA. 49
3.2.2. Detector de iones secundario. Un detector Daly es un
detector de iones gaseosos que consta de un pomo metálico, un
centelleador (pantalla de fósforo) y un fotomultiplicador. 94 Se
utilizó ampliamente en los espectrómetros de masas. Zenobi et
al. recogieron los fotones producidos por el impacto de paquetes
de iones con un centelleador y demostraron que un detector de
iones a fotones mostraba unas 10 veces más señales que el MCP
para iones pesados (150 kDa). 48 Wang et al. desarrollaron
además un detector de iones bipolar (BID) para
detectar iones secundarios, en lugar de electrones
secundarios, con una tensión de dinodo de conversión a -25
kV. Para los iones con m/z ~ 90 000, la sensibilidad del BID era
de 1,4-14,4 veces la del MCP. 47
3.2.3. Detector criogénico. Los fonones son excitaciones
elementales de una red cristalina. Cuando los iones inciden en
el detector criogénico, se genera calor y se transfiere a
vibraciones colectivas en un dispositivo microcalorímetro
normal aislante-superconductor (NIS) cerca de la temperatura
cero absoluta. 95 Un cambio muy pequeño en la temperatura,
resultante de la interacción del NIS
dispositivo microcalorimétrico y una partícula conduce a una
significación
cambio de resistencia. La corriente de unión se mide con un
preamplificador de dispositivos de interferencia cuántica
(SQUID) de alta velocidad y bajo ruido. La medición de los
fonones es
por tanto, depende de la energía, no de las masas de las
partículas y
velocidad de los iones. Frank et al. introdujeron un detector
calo- rimétrico de baja temperatura para medir la energía
cinética de los iones individuales incidentes,
independientemente de su masa o estado de carga. 96,97 Los
microcalorímetros criogénicos y las uniones de túnel
superconductoras son independientes de la velocidad y se
miden los fonones de los iones a temperaturas inferiores a
cien milikelvin. Recientemente, Zenobi et al. demostraron
que un detector de unión de túnel superconductor (STJ) de 16
elementos acoplado a una fuente de iones/región de enfoque
montada en un cardán totalmente ajustable puede permitir
una
sensibilidad para la detección de ionesde inmunoglobulina M con
carga simple (~1 MDa). 98 Bier et al. utilizaron además el
mismo detector de 16 STJs y detectaron iones de poliestireno
y cápsides de virus hasta 2
MDa y 13 MDa, respectivamente. 99,100 Estos detectores
criogénicos de partículas muestran una buena sensibilidad de
masa en un rango de masa alto, pero los inconvenientes de los

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Fig. 2 Un detector de nanomembrana. (a) Esquema del detector acoplado a un espectrómetro de masas MALDI-TOF. (b) Ilustración detallada del
principio de funcionamiento del detector. (c) Esquema de la configuración del detector, que consiste en una tricapa de Al/Si3N4/Al , una puerta de extracción,
MCP y un ánodo. El recuadro de la derecha es el espectro de masas MALDI TOF de IgM con un detector de nanomembrana (a) Espectro de masas de
IgM. Recuadro:
de la IgM. (b) La resolución de masa FWHM del detector. Reproducido de las ref. 45 y 46 con permiso.

se traducen en las correspondientes oscilaciones de la

3.3.1. Trampa de recirculación. Benner diseñó una trampa
corriente de emisión de eld. La corriente de emisión de eld
de iones electroestática cerrada que puede medir
modulada es amplificada por la placa de microcanal (MCP).
repetidamente la carga y el m/z de grandes iones de
Las proteínas de alta masa, como la IgG y la IgM, se miden
electrospray. 40 El diseño esquemático de esta
con una alta resolución de masa de 129 44 y 250 48. En el El instrumento se muestra en la Fig. 3. Con el paso de un solo
recuadro de la derecha de la Fig. 2, 45 la resolución de masa ion por el tubo detector, el detector muestra un ruido de
(m/Dm) mejora a medida que aumenta la masa molecular, ya amplificación de 50 electrones. Al promediarlo, el ruido puede
que el tiempo de subida y la constante de decaimiento son reducirse a 5 electrones. Jarrold et al. mostraron que el
enfriamiento del JFET puede
muy independientes tanto de la
aumentar su transconductancia y disminuir el ruido térmico, y
masa y energía cinética del ion, y la resolución temporal 55 Se
depende en gran medida del enfriamiento effectivo de la así mejorar la relación señal/ruido (S/N). han detectado
08:25:22.

nanomembrana de silicio mediante la emisión de eld. iones simples con 9 cargas elementales, mientras que los iones
3.2.5. Detector de carga. Hillenkamp et al. desarrollaron monoméricos de ADH con 32 a 43 cargas fueron atrapados
un durante 1500 ciclos y el
detector de carga para la detección de iones en instrumentos
MALDI-TOF. 101
El detector de carga consta de un electrodo metálico de 18 mm de diámetro.
trode como colector de carga de Faraday y preamplificador FET sensible a la
carga. Se requiere una carga neta de 1,8 × 104 para una relación S/N
de 2. Los iones IgG pueden detectarse con una relación S/N
>10. Con un tiempo de subida de 25 ns, la resolución de masa
para la detección de iones MALDI no se limita a un detector de
carga. Para aumentar la sensibilidad de un detector de carga,
Bouyjou et al. desarrollaron un sistema de 16 canales de baja
potencia
dispositivo CMOS y alcanzó una carga de ruido equivalente de 954e-. 102

3.3. Espectrometría de masas con detección de carga
La espectrometría de masas con detección de carga (CDMS)
mide la carga de imagen de los iones. La detección de la carga de
imagen de las micropartículas fue
rmado en 1960 por Shelton et al. , que utilizaron pares de con-
canalización de placas metálicas dentro de un cilindro
blindado para detectar esferas de hierro cargadas en un sistema
acelerador de alta tensión. 103 Con un tiempo de vuelo conocido
de los iones, las masas absolutas de los iones pueden
para calcularla. Para medir las masas absolutas de las partículas
Precisamente, se han desarrollado dos tipos de medición para
aumentar la relación señal/ruido. El primer método es la trampa
de recirculación, que permite múltiples trayectorias de iones en
una corriente continua electrostática.
trampa de iones. 40 El segundo enfoque es elp2 conjunto
ffiffiffi lineal,
que puede ampliar el límite de detección en con
múltiples etapas de detección. 56

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Fig. 3 La trampa electrostática de iones con compuerta. Las placas de

captura situadas en los lados izquierdo y derecho del módulo detector
definen el campo de potencial que obliga a los iones a realizar un ciclo de
ida y vuelta a través del tubo detector. Un brazo de soporte, unido a la parte
inferior del bloque detector, sostiene el detector
para minimizar las vibraciones y protege el FET interno del ruido de rf.
Reproducido con permiso de la ref. 40.

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La carga de imagen medida es de unos 2,2 electrones. Con la
CDMS, Jarrold et al. midieron además la masa (23,6 MDa) y
la carga (427 e) de los procápsidos del bacteriófago P22104 y
detectaron los intermedios de las cápsides del virus de la
hepatitis B. 105
3.3.2. Arreglo lineal. Otro enfoque para reducir el ruido es
disponer los detectores de carga en serie. En la Fig. 4,
Gamero-Castano mostró el diseño y calculó cuidadosamente
su detección de carga
límite. 56 El límite de detección y el error estándarp2
de la pnmedición
ffiffiffiffiffiffi
de la carga pueden reducirse por factores de y . El
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medición de una gota, con un tiempo de luz de 493 ms y un
ruido de carga de ~100 electrones se demostró.
3.4. Análisis de movilidad diferencial
El análisis de movilidad diferencial (DMA) es un método de
análisis rutinario utilizado para caracterizar rápidamente los virus
y las partículas similares a los virus. 42,44 Un dispositivo de DMA
se compone de cuatro elementos principales:
08:25:22.
Fig. 4 Detector de carga por inducción con múltiples etapas de detección. Reproducido con permiso de la ref. 56.
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un flujo de gas, un neutralizador, un campo eléctrico generado
por dos electrodos perpendiculares al flujo de gas y un
contador de partículas de condensación (CPC) colocado en el
extremo de uno de los electrodos.
electrodo para la detección de partículas, como se muestra en la
Fig. 5.43 En un dispositivo DMA, una partícula cargada es
impulsada por dos fuerzas, la fuerza de arrastre (relacionada
con el ow del gas, el dri de la partícula y su tamaño) y la fuerza
eléctrica (generada por la interacción entre el eld eléctrico y la
carga de la partícula). Las partículas específicas pueden
derivar en el CPC
en condiciones exactas; por lo tanto, el DMA es capaz de
separar las partículas cargadas en función de su m/z o de su
movilidad eléctrica en fase gaseosa. 42 A diferencia de los
analizadores típicos de EM, la fuerza de arrastre tiene un gran
effecto en el movimiento de las partículas, ya que el DMA se
opera a cerca de
presión atmosférica, con gas ow. Así, la información sobre la
Los tamaños de las partículas pueden ser o ffered por el análisis
DMA.
El análisis de movilidad differencial por electrospray de
carga reducida (ES-DMA) puede analizar cuantitativamente
tamaños de partículas de 0,7 a 800 nm. La notable precisión de
las partículas de 24 nm separadas por
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Fig. 5 Esquema de los diferentes componentes del sistema de análisis de movilidad diferencial por electrospray (ES-DMA). Reproducido con permiso de la ref.
43.

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ES-DMA es de 1,2 nm (derivación estándar). 106 La ES-DMA es
adecuada para el análisis del tamaño de virus enteros y
fragmentos de virus. Por ejemplo, Guha et al. midieron el PR772
y el PR7 con ES-DMA, y se determinó que los tamaños medios
eran de 62,1 0,4 nm y
23,0 0,3 nm, respectivamente. 107 Hogan et al. también
analizaron el bacteriófago MS2 y encontraron que su diámetro
era de 24,13 0,06 nm, mientras que las cabezas de la cápside de
los grandes bacteriófagos T2 y T4 eran
88,32 nm 1,02 nm y 87,03 0,18 nm, respectivamente. 43
Además, la ES-DMA tiene la capacidad de medir la
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concentración de un virus en solución. Cole et al.
determinaron la concentración de partículas de tres
bacteriófagos MS2, PP7 y fX174, que fueron similares al
análisis de aminoácidos en la mayoría de los casos. 108
3.5. Espectrometría de masas cuadrupolar
ortogonal con tiempo de visión
Utilizando un electrospray con análisis de masas en tiempo real,
Robinson y Rostom demostraron que es posible obtener
estados de carga denitivos en los espectros de grandes
multiproteínas
complejos. 109 En la Fig. 6a, el complejo GroEL muestra una
serie de picos centrados en m/z 10 000. A continuación, se
demostró que el bacteriófago MS2 mantenía la cápside intacta
en el vacío y que había sufrido una disociación inducida por
colisión (CID) con moléculas de gas neutro y el espectro de
masas CID se muestra en la Fig. 6b. 62
Heck et al. modificaron aún más el instrumento Q-TOF 1,
incluyendo
la introducción de una presión mejorada y una electrónica
alterada (por ejemplo, la frecuencia del cuadrupolo, la energía
de colisión y la frecuencia del empujador TOF), así como
detectores especializados para mejorar la transmisión y la
08:25:22.
medición de iones muy grandes. 30 El diseño del instrumento
se muestra en la Fig. 7. Se determinaron cápsides del VHB
con 90 y de 120 dímeros y masas de 3 y de 4 MDa de m/z 20
000 a 30 000.60,110 La precisión medida de ambas cápsides está
dentro del 0,1%. Se midieron partículas similares al virus
Norwalk de 10,1 MDa en función del pH de la solución, la
fuerza iónica y la concentración de proteína de la cápside. 63 La
Fig. 8 muestra las partículas intactas
18 MDa de las cápsides del bacteriófago HK97, medido con
un instrumento Q-TOF 1 modificado con un número de carga de
350.64 Se observa que la desolvatación incompleta de la
muestra provoca la
separación de picos y solapamiento en torno a 40 GDa, lo que
limita la detección de grandes complejos proteicos de GDa a
MDa.
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3.6. Espectrometría de masas Orbitrap
Con un analizador de masas orbitrap, Cooks41 y Heck et al.
midieron conjuntos de proteínas intactas con un peso
molecular cercano al millón de daltons. 31,111 Desde la
introducción del primer espectrómetro de masas basado en
orbitrap en 2006, este analizador de masas se ha hecho cada
vez más popular. 112-114 El espectrómetro de masas orbitrap
Los espectrómetros se utilizan para analizar moléculas
pequeñas y péptidos, pero ahora estos instrumentos pueden
modificarse para analizar conjuntos de proteínas nativas muy
grandes. La Fig. 9 muestra una modificación instrumental
específica de un instrumento Q Exactive Plus
(ThermoFisher Scientic), con una colisión de mayor energía
opción de disociación inducida (HCD). Briey, las modificaciones
incluyen la alteración del soware para permitir la detección de
iones en un rango m/z más alto, la sintonización de los voltajes
de radiofrecuencia de trans-
puerto multipolar y alterando la presión en la célula HCD. Se
detectaron cúmulos de CsI hasta m/z de 18 000 y se alcanzó
una resolución de 25 000 a un m/z de 5000 y se obtuvo una
resolución de 16 000 a un m/z de 10 000. La resolución de la
anchura total a la mitad del máximo (FWHM) de los picos de
GroEL (68+ a 77+ a m/z de 10 000 a 12 000) fue cercana a
4000, y el peso molecular experimental fue cercano a 1 MDa.
Además, se resolvieron y asignaron las glicoformas de una
construcción basada en anticuerpos, con un patrón de glicanos
muy heterogéneo. 111 Se necesitaron unos pocos femtomoles de
muestras y la adquisición de datos de un solo espectro de
masas se realizó en pocos segundos. Se obtuvo una resolución
de hasta 12 000 en m/z
6000 con una alta precisión de masa (~0,001%), permitiendo
así la asignación de anticuerpos modificados. Kelleher y
Makarov et al. modificaron el instrumento Q Exactive plus
con una interfaz de inyección de iones ortogonal, dos embudos
de iones, un lter cuadrupolar y una célula HCD de alta presión
(10-2 mbar). 32 La relación señal/ruido puede mejorarse con la
inyección ortogonal de iones y los embudos de iones y el
tiempo de inyección
se redujo considerablemente. La transmisión de iones se
amplió hasta m/z 20 000 y los iones pueden seleccionarse en
masa en este rango de masas. La ventana de aislamiento fue de
unos 70 en el rango de m/z que supera los 10 000 Th. El
análisis de MS en tándem de grandes complejos proteicos,
como la fosporilasa B (194 kDa), la piruvato quinasa (232
kDa) y GroEL (801 kDa) puede alcanzarse a MS3.
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Fig. 6 (a) Espectro de masas de GroEL. (b) Espectro de masas CID de los iones de la cápside del virus MS2. Reproducido de las ref. 109 y 62 con permiso.

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Fig. 7 Esquema del instrumento Q-TOF 1 modificado (Micromass, Reino Unido). Los elementos en azul oscuro son modificaciones relativas a la configuración
estándar del Q-TOF 1. Reproducido con permiso de la ref. 30.
08:25:22.

Fig. 8 El ensamblaje de las cápsides de HK97 analizado con ESI-MS nativo. (a) Ruta de ensamblaje y maduración de HK97. (b) Capsómeros libres con señal de
penton en azul y señal de hexon en rojo. (c) Partícula intacta de Prohead-1. Reproducido con permiso de la ref. 64.

4. Algoritmos investigar y asignar los espectros de masas de proteínas o

La ionización por electrospray acoplada a la espectrometría de
masas (EM) nativa ha evolucionado como una herramienta
importante en la biología estructural para descifrar la
composición de los complejos proteicos. 1,20,115 Se ha
desarrollado con éxito un programa comercial de EM para
péptidos. Es apropiado para la identificación de series de
estados de carga de complejos proteicos, ya que las series de
estados de carga están sufficientemente separadas. Sin
embargo, el solapamiento de las distribuciones de los estados de
carga, la neoestructura y el ensanchamiento de los picos de las
muestras heterogéneas dificultan el análisis de masas. Para
facilitar el análisis de masas, la teoría

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Fig. 9 Esquema del instrumento Q Exactive Plus modificado con la opción HCD. Reproducido con permiso de la ref. 31.

A continuación se discute el desarrollo y la automatización del periódico

preprocesamiento de los espectros de masas en bruto, la podría explicarse con la teoría de la desviación mínima
asignación de los picos a las series de iones y el estándar, en la que una oscilación armónica indica una
desciframiento de las composiciones de las subunidades. asignación correcta del estado de carga. La Fig. 11 muestra el
análisis de HBV
4.1. Teoría
El enfoque convencional para asignar los espectros de masas
ESI de las proteínas fue inventado por Mann et al.
08:25:22.

ridad de promediación y deconvolución para asignar el

estados de carga en los espectros de masas ESI de los
complejos proteicos. 116 El "algoritmo de promediación",
asigna números de carga a los iones asociados con el valor m/z
para cada pico y promedia las masas resultantes para dar una
mejor estimación de las masas moleculares. El "algoritmo de
deconvolución", transforma varios picos de un ion con carga
múltiple en un solo pico, correspondiente a
un ion con una sola carga, como se muestra en la Fig. 10.
Además, se utilizan enfoques de máxima entropía para
encontrar la mejor asignación y reducir la complejidad de los
espectros basados en la decon-
volución. 117-122 Estos enfoques son útiles para analizar proteínas
de masas intermedias, pero no son capaces de asignar
correctamente los estados de carga de complejos proteicos
más grandes, por ejemplo, cápsides virales o
nano/micropartículas. Peng et al. introdujeron un algoritmo
LeastMass, que es capaz de lograr la asignación de estados de
carga de iones de muy alta masa creados por ESI. 18 Este
algoritmo busca una serie de picos m/z, que pueden coincidir
con la relación de carga como entrada y la masa molecular se
obtiene teniendo en cuenta todos los posibles estados de carga.
El gráfico de
S/hmi frente a z o hmi, donde S es la desviación estándar, z es el
ion
y hmi es la masa media, muestra un patrón periódico cuando se
identifica la asignación correcta de la carga. El patrón
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cápsulas. El patrón periódico se observa en los iones T ¼ 3 y T
¼ 4 cuando se empareja la carga correcta. Sin embargo, una
selección de los picos de mezcla de los iones T ¼ 3 y T ¼
4 da lugar a la pérdida de

Fig. 10 (a) Deconvolución del espectro de masas del citocromo c (M 12

360). Las posiciones teóricas de los primeros picos laterales están marcadas ¼
con triángulos oscuros. (b) Expansión con "zoom" del espectro en (a)
para el
de masa entre 10 000 y 14 000. Reimpreso con permiso
de la ref. 116.

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Fig. 11 (a) Espectro de masas de los iones del VHB. Análisis de las cápsides del VHB (b) iones T3 , (c) iones T4
¼¼¼¼ ,y
(d) mezcla de iones T3 y T4 en la región de m/z superpuesta. El recuadro muestra los
picos m/z seleccionados para el análisis de la parte (d). Reproducido con permiso de la ref. 18.

periodicidad. LeastMass también puede ayudar a asignar los la Fig. 12, los complicados espectros de masas en tándem
estados de carga correctos de iones de ADN y PEG de derivados del VHB intacto
plásmidos individuales analizados por espectrómetro de masas
de resonancia de ciclotrón de iones por transformación de
Fourier (FTICR)123,124 y cápsides de 18 MDa del bacteriófago
08:25:22.

HK97 por un instrumento QTOF 1. 64

4.2. Procesamiento de datos brutos

El procesamiento de los datos brutos es importante para
reducir el tiempo de análisis. Es necesario un algoritmo que
pueda manejar los espectros de masas brutos con ruido. El
preprocesamiento de los datos requiere un alisado exhaustivo,
la sustracción del fondo y la determinación automática del
umbral. Esto es especialmente difícil cuando las señales están
muy deformadas y mezcladas con ruido. 19 El
El software de preprocesamiento automático puede reducir en
gran medida el tiempo de análisis y mantener la pureza de los
espectros de masas adquiridos.

4.3. Motor de búsqueda

Peng et al. desarrollaron un motor de búsqueda, AutoMass, para
asignar automáticamente las series de iones a los picos mediante
la teoría del juego. 19 AutoMass puede dene el límite correcto
entre distribuciones differentes para producir masas precisas.
Ayuda a analizar las masas y el límite de conjuntos de proteínas
heterogéneas con distribuciones de estado de carga superpuestas,
ne estructura y ensanchamiento de los picos. Los límites de las
series de iones en los espectros de masas en tándem bien
resueltos del virus de la hepatitis B (VHB)
cápsides y los del espectro de masas del complejo proteico en
cascada relacionado con CRISPR se asignan con precisión. En
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en condiciones de alta energía de colisión. Los espectros de
masas en tándem generados por el VHB de iones precursores
T ¼ 3 y T ¼ 4 con un voltaje de aceleración de 400 V se
representan en la Fig. 12a y c, y el análisis de masas en tándem
por AutoMass se muestra en la Fig. 12b y d, respectivamente.
La desviación de las masas de los oligómeros predichos y
medidos es inferior al 0,03%, mucho menos que una sola
subunidad proteica. Además, menos bien
Los espectros de masas resueltos, por ejemplo, los espectros
de masas de la cápside del norovirus a differentes niveles de
desolvatación también se analizan.

4.4. Asignación de complejos de subunidades

Morgner y Robinson introdujeron Massign para optimizar el
análisis de datos reduciendo el tamaño de los espectros,
suavizando y sustrayendo el fondo, identificando los picos,
asignando las series de iones y el número de posibles
combinaciones de subunidades mediante la integración de
información de múltiples fuentes. 20 Al añadir restricciones de
conectividad y estequiometría en el soware, Massign reduce
el número de complejos potenciales a uno o dos, como se
muestra en la Fig. 13. En la práctica, el límite de los iones tiene
que ser rediseñado manualmente
y es necesario introducir manualmente el rango de masa
potencial, el rango m/z y la carga máxima posible. Benesch et
al. desarrollaron el programa CHAMP, que puede estimar el
distribución de estequiometrías differentes a partir de la
superposición y
picos no resueltos. 125 Es similar a SOMMS122 pero es más fácil
de usar. Thalassinos et al. desarrollaron el soware Amphitrite,126
que es favorable para analizar datos de movilidad iónica y es
comparable a CHAMP y SOMMS en su asignación de picos.
Puede recuperar o comparar diferentes formas de iones de
muestras muy complejas.

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Fig. 12 Análisis AutoMass de los espectros de masas CID en tándem de las cápsides del VHB a una tensión de aceleración de 400 V. (a) Espectro de masas CID de
iones T ¼ 3,
(b) el análisis AutoMass de (a), (c) el espectro de masas CID de los¼iones T4 , (d) el análisis AutoMass de (c). N0 indica el número de proteínas en el
oligómeros. Reproducido con permiso de la ref. 19.
08:25:22.

(DMA) es un instrumento alternativo para adquirir rápidamente

5. Elección del espectrómetro de masas la distribución del tamaño de las nanopartículas. 43 Fihly, los
analizadores de masas orbitrap31,41 y los cuadrupolares
Las técnicas de espectrometría de masas se resumen en la ortogonales con tiempo de visión62,64 permiten
Tabla 1. A continuación, discutiremos cómo elegir una técnica
de espectrometría de masas adecuada. En primer lugar, para
medir las masas de las micropartículas (por ejemplo, las
células), una trampa de iones cuadrupolar con un detector de
carga sería favorable, ya que puede medir las masas y la
distribución de masas de las células en un corto período de
tiempo. 27 Además
puede medir la differencia de masa antes y aer el celular
la captación de nanopartículas y la adhesión de moléculas a las
superficies de las micropartículas y a las columnas. 88,90,127 En
segundo lugar, una trampa de iones cuadrupolar con
dispersión de luz puede medir las masas de un solo virus,
bacterias y células con gran precisión. 12,53 Con esta técnica se
pueden estudiar los cambios en la masa debidos a la adhesión
de moléculas en nano/micropartículas individuales en el vacío.
En tercer lugar, la espectrometría de masas de detección de
carga puede medir las masas de los virus; 14 ,105 sin embargo, la
naturaleza de carga múltiple de la ESI provoca una amplia
distribución de masas de los iones y limita su aplicación. En
cuarto lugar, la movilidad differencial ESI

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el análisis de masas de cápsides de virus intactas y de grandes

proteínas. El análisis de masas en tándem offers la
información de la estructura. 31 Cuando el tamaño de las
partículas es mayor, se requiere una mayor energía para
activar y disociar esas biopartículas. Durante la activación y
disociación de las nanopartículas, la frecuencia de captura en
un dispositivo de trampa de iones no es capaz de cubrir un
rango de tablas. Por lo tanto, se favorece el tándem en el
espacio sobre la técnica del tándem en el tiempo. 128,129 Mann
et al. demostraron que un instrumento de trampa iónica lineal
dual orbitrap puede aumentar la velocidad de la secuencia en
la investigación pro- teómica. 130 Las trampas de iones duales
proporcionan una posible solución para disociar iones
grandes en fragmentos combinando las técnicas tándem en el
tiempo y tándem en el espacio. 58,131 En sexto lugar, con la
ayuda de los programas AutoMass y Massign, el tiempo de
análisis de los complicados espectros de masas ESI puede
reducirse considerablemente. Sin embargo, se requiere un
preprocesamiento automatizado de los datos para minimizar
el effecto de los espectros de masas deformados de complejos
proteicos heterogéneos, reducir el tamaño de los datos y
acelerar el tiempo de análisis. En séptimo lugar, la naturaleza
del pulso del ion MALDI
es adecuada para acoplar con un analizador de masas de tiempo
de visión
para adquirir espectros de masas sencillos. El TOF-MS con
un detector criogénico, un detector de píxel activo y un
detector de nanomembrana puede ahora ampliar la
detección de masas desde un centenar de kDa hasta

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Fig. 13 La asignación de masa de los complejos de subunidades 5, 2, 3 y 4 se muestra en (A), (B), (C) y (D) respectivamente. La asignación final de los 4 complejos a la
serie se muestra en (E). Reproducido con permiso de la ref. 20.

MDa. Sin embargo, el análisis de masas en tándem de iones de

alta masa en un instrumento TOF-TOF y la baja efficiencia de
ionización de la fuente de iones MALDI en la detección de
biopartículas grandes (>100 kDa) siguen siendo un gran
desafío. El uso de un detector de carga con MS TOF y MS con
trampa de iones cuadrupolar puede ayudar a entender la
cantidad de iones y examinar el posible mecanismo de
ionización. Por último, la resolución de masa en el rango de
masa alto y el análisis isotópico de
Las biomoléculas de alta masa132 siguen siendo un reto para
los analizadores de masas FTICR y orbitrap.
6. Conclusiones y perspectivas de futuro
El enfoque de la espectrometría de masas cuadrupolar de una
sola partícula proporciona una medición precisa de la masa
para tamaños de partículas de

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Tabla 1 Comparación de las técnicas físicas de espectrometría de masas disponibles para grandes biomoléculas y biopartículas

Resolució
Técnicas de Tamaño Masa de n de masa Precisió
espectrometría de Analitos Analizador/detector de las la (m/Dm) n de la Ref.
masas partícula partícula masa
s (nm) (Da)

Trampa de iones Micropartículas, Electrón secundario <10 <106 10 a 103 -— 57, 59 y 69

cuadrupolar
103 104
espectrometría de masas nanodiamante, Dispersión de la luz 10 a <1012 10 a 1% 12, 28, 53, 68,
nanopartículas, 73-76 y 78-80
bacterias/
10 a 102 -— -—
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virus/células Inducido por láser <105 5, 58 y 81

uorescencia
Detector de carga 10 a 104 <1016 ~102 1% 4, 27, 54, 83–86,
88-92 y 127
Espectrometría de Proteínas, Electrón secundario, <101 <106 ~102 -— 70, 71 y 133
masas con trampa de complejos detector de carga
iones lineal proteicos,
orgánicos
compuestos
Tiempo de visión (TOF) Proteínas, proteínas Electrónica secundaria, 10 a 102 <106 10 a 103 1% 23, 24, 45–48, 96
espectrometría de masas complejos, orgánicos detector criogénico, y 97
compuestos, polímero, nanomembrana,
nanopartículas detector de carga
Masa de detección de Micropartículas, Detector de carga, lineal 10 a 104 <1012 10 a 102 -— 40, 55, 56 y
carga
espectrometría nanopartículas, matriz, trampa de 104
proteínas, recirculación
complejo de proteínas,
virus
Espectrometría de Nanopartículas DMA 10 a 104 109
a 10 a 102 -— 43, 44 y
espectrometría proteína, 1012 111
masas de movilidad , 106–108
proteína
diferencial micropartícula

80 nm a 10 mm. 4 Sin embargo, no es adecuado para el análisis masas son herramientas poderosas y siguen proporcionando
08:25:22.

de alta velocidad. La espectrometría de masas celular permite valiosa información estructural y de masas de grandes
la medición destructiva de células con tamaños de 700 nm a biomoléculas y biopartículas.
30 mm. 27 Permite el análisis de alta velocidad de las células.
La espectrometría de masas con detección de carga permite la
determinación no destructiva de las cargas de las partículas. La
relación señal/ruido puede mejorarse con el aumento de las
trayectorias múltiples de los iones. El uso de un detector
criogénico en la TOF MS puede ampliar el límite de detección
hasta 2 MDa. 99 Con detectores de nanomembrana, las
moléculas de IgM pueden ser
detectado con TOF MS, con una resolución de ~250,45
Differencial
El análisis de movilidad (DMA) está ahora disponible para
caracterizar rápidamente los virus y las partículas similares a
los virus. Se han explorado partículas virales de 18 MDa con
cargas de hasta 350. 64 La reso- lución de masas ha alcanzado
el límite instrumental de la MS de cuadrupolo ortogonal TOF.
La MS Orbitrap podría ser una solución prometedora para
mejorar la resolución de masa en el análisis de grandes
biopartículas hasta el rango de masa de MDa. 32 AutoMass, un
motor de búsqueda basado en la teoría del juego, puede
asignar con éxito los complicados espectros de masas en
tándem de las cápsides del VHB con m/z de 40 000 a 80 000.19
Además, Massign puede simplificar la asignación de
combinaciones de subunidades diferentes en grandes sistemas
heterogéneos. 20 En general, las técnicas de espectrometría de
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Declaración de divulgación
El autor no tiene conocimiento de ninguna afiliación,
membresía, financiación o participación financiera que pueda
percibirse como un factor que afecte a la objetividad de esta
revisión.

Agradecimientos
El autor agradece a la Universidad Nacional Dong Hwa (NSC
102- 2112-M-259-003-MY3) y al Ministerio de Ciencia y
Tecnología de Taiwán, República de China, el apoyo continuo a
su trabajo durante los últimos seis años.

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