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INFORME DE PROGRESO
Sistemas Acuosos Bifásicos
Aplicaciones biotecnológicas emergentes de productos acuosos
Sistemas bifásicos
Alyne G. Teixeira, Rishima Agarwal, Kristin Robin Ko, Jessica Grant­Burt, Brendan M.
Leung y John P. Frampton*
La separación de fases líquido­líquido entre soluciones acuosas que contienen dos
polímeros incompatibles, un polímero y una sal, o un polímero y un tensioactivo, se ha
aprovechado para una amplia variedad de aplicaciones biotecnológicas a lo largo de los
años. Si bien muchas aplicaciones de sistemas acuosos de dos fases caen dentro del
ámbito de la ciencia de la separación, la capacidad de dividir muchos materiales diferentes
dentro de estos sistemas, junto con los avances recientes en la ciencia de los materiales y el
manejo de líquidos, ha permitido a los bioingenieros imaginar nuevas aplicaciones. Este informe
de progreso proporciona una descripción general de la historia y las propiedades clave de
los sistemas acuosos de dos fases para contextualizar cómo estos materiales han
progresado hacia aplicaciones modernas como micropatrones celulares y bioimpresión,
ensamblaje de tejidos 3D de alto rendimiento, desarrollo de ensayos biomoleculares a
microescala, facilitación de la separación celular y producción de microcápsulas mediante
dispositivos de microfluidos y biología sintética.
Se evalúan más a fondo las direcciones futuras, las limitaciones actuales y las consideraciones
de diseño de este conjunto de herramientas adaptable y prometedor para la manipulación celular
y de biomoléculas.
1. Introducción
Los sistemas acuosos de dos fases (ATPS) se forman cuando dos polímeros
incompatibles, un polímero y una sal, o un polímero y un tensioactivo, exceden
las concentraciones umbral en un solvente a base de agua, lo que resulta en
una separación de fases líquido­líquido.[1,2] Este fenómeno fue reconocido por
primera vez por el microbiólogo Martinus Beijerinck en 1896. Mientras preparaba
una solución acuosa de almidón para cultivar bacterias, notó que se formaban
gotas cuando la solución concentrada de almidón se mezclaba con gelatina.[3,4]
Esta propiedad emergente se apreció más tarde para una variedad de diferentes
mezclas de polímeros de cadena larga. Sin embargo, la utilidad
AG Teixeira, R. Agarwal, KR Ko, J. Grant­Burt, Dr. BM Leung, Dr. JP Frampton
Escuela de Ingeniería Biomédica
Universidad de Dalhousie
5981 University Avenue, Halifax, NS B3H 4R2, Canadá
Correo electrónico: john.frampton@dal.ca
Dr. BM Leung
Departamento de Ciencias Orales Aplicadas
Universidad de Dalhousie
5981 University Avenue, Halifax, NS B3H 4R2, Canadá
Los números de identificación ORCID de los autores de este artículo se pueden
encontrar en https://doi.org/10.1002/adhm.201701036.
DOI: 10.1002/adhm.201701036
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La utilización de ATPS no se apreció hasta la década
de 1950, cuando Per­Åke Albertsson comenzó a
utilizar una variedad de soluciones de polímero­
polímero y polímero­sal para el aislamiento de
proteínas, virus, células y fragmentos de células (p.
ej., cloroplastos de algas verdes) explotando la
distribución preferencial de materiales entre fases, un
fenómeno conocido como partición.[5–7] La partición
ocurre cuando las moléculas o partículas se mezclan
en el sistema polimérico, pero no contribuyen a la
separación de fases. Después del equilibrio, estos
materiales se distribuyen en la fase por la que tienen
mayor afinidad relativa.[8]
Desde estos descubrimientos pioneros, los ATPS
se han utilizado ampliamente en el campo de la
ciencia de la separación para el aislamiento y la
recuperación de anticuerpos,[9,10] proteínas,[7,11,12].
partículas similares a virus,[13,14] antibióticos,[15–17]
ADN,[18–20] células,[21,22] vesículas extracelulares ,
[23,24] y hormonas.[25,26] Más recientemente, los
bioingenieros han comenzado a explotar las propiedades de los ATPS en una
amplia variedad de aplicaciones novedosas, entre ellas micropatrones de
células en solución para investigar la migración celular y las interacciones entre
células,[27] confinamiento de anticuerpos y otros reactivos en micromatrices con
patrones de solución,[28] dispositivos de microfluidos,[29] e incluso para generar
estructuras sintéticas similares a células.[ 30]
En la Figura 1 se presenta un cronograma que destaca eventos importantes en
el desarrollo de este campo en crecimiento. El propósito de este informe de
progreso es resaltar algunas de las aplicaciones emergentes más prometedoras
para los ATPS.
2. Propiedades del ATPS
Antes de describir en detalle las aplicaciones emergentes de los ATPS, es
necesario revisar algunas de las propiedades clave de estos materiales. Un
ATPS contiene tres zonas: las dos fases principales, que a menudo se separan
por densidad en una fase superior y una fase inferior, y la interfaz. Cada una de
estas zonas puede tener propiedades distintas (como se analiza a continuación),
que dictan su desempeño en diversas aplicaciones.
2.1. La separación de fases
La separación de fases puede explicarse por las propiedades termodinámicas
de soluciones incompatibles, que resultan en la formación de
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fases líquidas inmiscibles.[3,4] Para comprender mejor el proceso termodinámico

de formación de ATPS, se debe considerar la energía libre del sistema: ΔG = Alyne G. Teixeira es estudiante
ΔH −TΔS, donde ΔG representa el cambio en la energía libre de Gibbs del de doctorado en la Facultad

sistema, ΔH representa el cambio de entalpía, T representa la temperatura y ΔS de Ingeniería Biomédica de la

Universidad de Dalhousie.
representa el cambio de entropía. Cuando ΔG <0, el proceso es espontáneo, lo Realizó su licenciatura en farmacia
que significa que no se pueden formar ATPS porque los polímeros se mezclarán. industrial y su maestría en biociencias
Para que se produzca la separación de fases, la contribución entrópica debe ser y tecnología de productos
menor que la contribución entálpica de modo que ΔG > 0.[5,29,31] Aunque se bioactivos en la Universidad de
han hecho intentos de desarrollar modelos termodinámicos capaces de predecir Campinas en Brasil. Como
las concentraciones a las que se produce la separación de fases, [32­35] es científica de la industria,
costumbre determinar empíricamente las concentraciones requeridas para la anteriormente fue
separación de fases debido a la cantidad de factores como el pH, la temperatura
y la concentración iónica que pueden influir en la tendencia de las soluciones a involucrado en numerosos proyectos de investigación relacionados
separar las fases. [27,32] Estas concentraciones Las operaciones generalmente con la I+D farmacéutica. Actualmente está desarrollando tecnologías
se representan en un diagrama de fases binodal, con la concentración del de miniaturización para la manipulación de sistemas acuosos de dos fases.
polímero ocupando la fase superior en la ordenada y la concentración del Alyne posee una beca de posgrado de Nueva Escocia del gobierno
polímero ocupando la fase inferior en la abscisa. Las concentraciones provincial de Nueva Escocia.

supercríticas representadas por puntos encima de la curva binodal producen dos

fases inmiscibles. La curva binodal también proporciona información sobre los
volúmenes relativos de las dos fases y las concentraciones de las especies de
dos polímeros en las respectivas fases en equilibrio. En la obra clásica de
Albertsson se puede encontrar una descripción detallada de cómo interpretar
estos diagramas, incluida información sobre cómo interpretar los puntos críticos
y las líneas de unión. Sin embargo, cuando se utilizan ATPS para aplicaciones
prácticas, es importante considerar que los sistemas más cercanos al punto
crítico y otros puntos a lo largo de la curva binodal son menos estables y más
sensibles a las fluctuaciones ambientales que los sistemas supercríticos
alejados de la curva binodal. En la Figura 2 se presenta un diagrama de fase
binodal ficticio , junto con imágenes representativas de sistemas de
poli(etilenglicol) (PEG)­dextrano formados a partir de concentraciones
supercríticas de polímeros, concentraciones casi críticas de polímeros y
concentraciones subcríticas de polímeros.
El método más común para determinar el diagrama de fases binodal, la
valoración turbidimétrica, se realiza analizando una serie de sistemas poliméricos
de concentraciones conocidas antes y después de la dilución. El punto en el que
un sistema determinado se aclara al mezclarlo, lo que indica ausencia de gotas
microscópicas inmiscibles, se toma como punto de la curva binodal. Otro
método comúnmente utilizado, el método del punto de enturbiamiento, se realiza
añadiendo una solución madre concentrada de uno de los dos componentes del
sistema (p. ej., dextrano) a un volumen conocido de una solución madre
concentrada del segundo componente (p. ej., PEG ). Después de añadir una
cierta cantidad del segundo componente, se alcanza el punto de turbidez y la
mezcla se vuelve turbia, lo que indica la formación de un sistema de dos fases.
La composición que precede a la formación del ATPS se toma como un punto
de la curva binodal.[33] Aunque estos métodos se utilizan comúnmente para la
determinación del diagrama de fases binodal, consumen grandes cantidades
de reactivos y tienden a ser tediosos y requieren mucho tiempo.
John P. Frampton es profesor
asistente en la Escuela de
Ingeniería Biomédica de la
Universidad de Dalhousie y en el
Nivel 2 de Investigación de Canadá.
Cátedra de Interacción Celular,
Biomaterial y Matriz. Él
Se formó como estudiante de
doctorado en la Escuela de Salud
Pública de SUNY en Albany
antes de completar una beca
postdoctoral en el Departamento de
Ingeniería Biomédica de la Universidad de Michigan. En la Universidad de
Dalhousie, su equipo de investigación trabaja en la intersección de la
química, la física y la biología para explorar las interacciones de
diversos materiales blandos con las células, diseñar biomateriales
novedosos y desarrollar tecnologías de miniaturización de vanguardia
con aplicaciones en biotecnología y medicina.
presente en la fase de fondo, y el último para el agua. En el microcanal, los
fluidos fluyen en régimen laminar con mezcla únicamente por difusión. Para
evaluar la separación de fases, se realiza microscopía óptica en el extremo distal
del microcanal.[32] Ruthven et al. desarrollaron otro método alternativo para la
determinación eficiente del diagrama de fases. Utilizando una técnica simplificada
basada en la valoración en microplacas de 96 pocillos, fue posible analizar hasta
64 composiciones binodales en varias horas utilizando únicamente pipetas de
laboratorio y utensilios de plástico ampliamente disponibles. En este ensayo, la
presencia o ausencia de separación de fases (gotas) también se determina
mediante microscopía óptica.[27]

Para abordar estas limitaciones, Silva et al. desarrolló una plataforma de

microfluidos para la detección de alto rendimiento de mezclas de polímeros 2.2. Las propiedades fisicoquímicas de las fases a granel.
formadores de ATPS. Este método se basa en la difusión de diferentes soluciones
a través de tres microcanales: uno para el polímero presente en la fase superior, Muchas de las aplicaciones que se analizan a continuación implican la
otro para el polímero/sal. manipulación de ATPS en escalas de micro a nanolitros. Como uno esperaría

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Figura 1. La evolución de las tecnologías basadas en ATPS. Las aplicaciones de los ATPS se remontan al menos a la década de 1950, cuando se utilizaron por primera vez para
la purificación de materiales biológicos. Los avances en la caracterización y aplicación de estos materiales se han acelerado desde principios de la década de 2000, dando lugar a
muchas tecnologías nuevas. Las imágenes se reproducen bajo licencias CC0.
Para estas escalas, es importante considerar propiedades del material como
la viscosidad y la hidrofobicidad del fluido, así como la densidad (es decir, la
gravedad específica) y la osmolaridad al implementar o evaluar nuevas
aplicaciones ATPS.
2.2.1. Viscosidad
La viscosidad es un parámetro importante en el proceso de separación de
fases porque determina el tiempo de sedimentación de las fases después de
la emulsión,[36,37] así como la dinámica de fluidos de las gotas con
micromodelos.[38] Para los ATPS polímero­polímero (p. ej., el sistema PEG­
dextrano), la viscosidad de las fases aumenta con el contenido de polímero y
el peso molecular, lo que implica que esta propiedad no puede manipularse
independientemente de las densidades del fluido, los volúmenes relativos de
fase en equilibrio y afinidad por los materiales divididos.[36,39] Para cualquier
ATPS que contenga un polímero, la viscosidad de todo el sistema aumentará
en función del contenido de polímero. Sin embargo, si consideramos las
viscosidades de las fases individualmente como una función del contenido
creciente de dextrano para el sistema PEG­dextrano, la viscosidad de la fase
rica en dextrano aumentará proporcionalmente a la longitud de la línea de
unión a medida que aumenta el contenido de dextrano, mientras que la La
viscosidad de la fase rica en PEG permanecerá casi constante. De manera
similar, si consideramos una serie de ATPS de PEG­dextrano formados a
partir de pesos moleculares variables de dextrano para un peso molecular
constante de PEG y un contenido total de polímero constante, la viscosidad
de la fase rica en dextrano aumentará en relación con la viscosidad de la fase
rica en PEG como aumenta el peso molecular del dextrano.
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2.2.2. Densidad
Los ATPS pueden separar mezclas de partículas por diferencias de densidad
mediante la formación de tres interfaces estables: aire/fase superior, fase
superior/fase inferior y fase inferior/contenedor.
Las densidades de las fases individuales pueden modularse mediante la
alteración de las concentraciones de los polímeros o de los tensioactivos,[2]
así como mediante la adición de sales (por ejemplo, bromuro de cesio),[40]
líquidos iónicos,[41] solutos paramagnéticos (por ejemplo, Mn(II)Cl2), [42] y
cosolutos (por ejemplo, D2O).[2] Además, se pueden seleccionar polímeros
separadores de fases para optimizar las diferencias en las densidades de los
polímeros entre las fases o para crear sistemas multifásicos con más de una
interfaz líquido­líquido.[2,42,43] En el sistema PEG­dextrano comúnmente
utilizado, el La fase rica en dextrano es siempre más densa que la fase de
PEG. Sin embargo, en el sistema dextrano­Ficoll, la fase más densa puede
ser la fase rica en dextrano o la fase rica en Ficoll, dependiendo de las
concentraciones de polímero.
Para los ATPS de dextrano­Ficoll alejados del punto crítico de la curva binodal,
la fase rica en dextrano es más densa que la fase rica en Ficoll, mientras que
para las composiciones cercanas al punto crítico de la curva binodal, la fase
rica en Ficoll es la más densa de las dos fases.[5]
2.2.3. Osmolaridad
Las dos fases líquidas tienen la misma presión osmótica en equilibrio
independientemente del peso molecular del polímero.[5,44] En la práctica, no
es común ajustar la osmolaridad de los ATPS antes de su uso porque los
polímeros generalmente se disuelven en
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Figura 2. A) En abscisas se representa la fase inferior y en ordenadas la fase superior. La curva binodal divide las concentraciones de polímeros que forman
ATPS (por encima de la curva) de aquellas concentraciones que no forman ATPS (por debajo de la curva). Las líneas de unión conectan dos puntos en el
binodal que representan la concentración final de la fase inferior y superior. Los puntos 1, 2 y 3 representan tres composiciones de ATPS que se encuentran en
la misma línea de unión. El punto 1 indica la composición de la fase superior, el punto 2 tiene volúmenes iguales para las fases superior e inferior y el punto 3
indica la composición de la fase inferior. En el punto crítico, la composición y el volumen de las dos fases son iguales. B) Imágenes de soluciones de polímeros
supercríticos que forman dos fases (arriba), concentraciones de puntos casi críticos (centro) y soluciones de polímeros subcríticos (abajo) contenidas en tubos
de ensayo (izquierda) y obtenidas mediante microscopía de campo brillante. Barra de escala = 100 µm.

un amortiguador fisiológico. Sin embargo, es posible ajustar la
presión osmótica o la tonicidad de un ATPS añadiendo sales o
azúcares. Por ejemplo, se ha demostrado que cuando una vesícula
de ATPS está encapsulada por una membrana semipermeable, la
separación de fases puede modularse mediante la adición de
osmolitos como la sacarosa a la solución externa. A medida que
aumenta la presión osmótica externa, la tensión interfacial también
aumenta, lo que lleva a la formación de vesículas.[45,46] Desde la
perspectiva de la separación de biomoléculas, la composición iónica
de un sistema polímero­polímero desempeña un papel importante
en la partición de materiales entre las fases. Esto ocurre debido a
diferencias de potencial electrostático entre las dos fases en equilibrio
resultantes de una distribución no uniforme de iones entre las fases.
Además, la presencia de sal modifica las fuerzas intramoleculares
entre el material de interés y los polímeros. Por ejemplo, la partición
de pectinasa en un sistema PEG­dextrano puede mejorarse mediante
la adición de bajas concentraciones de sales de sulfato.[47]
Finalmente, al agregar sales, se puede lograr la separación de fases
a concentraciones totales de polímero más bajas debido al efecto
entrópico de la adición de sales. En consecuencia, la curva binodal
se desplaza hacia el origen en el diagrama de fases.[48]
2.2.4. hidrofobicidad
La diferencia en hidrofobicidad entre dos polímeros formadores de
ATPS se correlaciona con su tendencia a separarse en fases en un
ATPS. Por ejemplo, el PEG es más compatible (y por lo tanto es
menos probable que se separe de fases) con polímeros de dextrano
modificados para contener cadenas laterales hidrófobas.[5] Otro
ejemplo es el sistema compuesto por el copolímero óxido de etileno/
óxido de propileno (EO­PO) y dextrano. EO–PO es ligeramente
más hidrofóbico que PEG, lo que lleva a una mayor diferencia de
hidrofobicidad entre la fase rica en EO­PO y la fase rica en dextrano
en comparación con el sistema PEG­dextrano.[49] En general, cuanto
mayor sea la diferencia en hidrofobicidad entre los dos polímeros de
interés, más probable será que el sistema se separe de fases.
La hidrofobicidad es también uno de los factores más importantes
que influyen en la partición de proteínas tanto en los ATPS polímero­
sal como polímero­polímero.[50] En un sistema PEG­dextrano, las
proteínas altamente hidrofóbicas tienen más probabilidades de
dividirse en la fase superior más hidrofóbica (es decir, la fase rica en
PEG) en lugar de la fase rica en dextrano. Por otro lado, las
proteínas hidrofílicas tienden a dividirse en la menos hidrofóbica de
las dos fases.[51] Las interacciones hidrófobas de materiales con
polímeros formadores de ATPS también pueden depender de las
propiedades superficiales de las biomoléculas. Por ejemplo, la
hidrofobicidad neta superficial del ARNt (ARN de transferencia) se
ha evaluado mediante partición dentro del sistema PEG­dextrano. A
medida que aumenta la diferencia de hidrofobicidad entre las fases
de PEG y dextrano, el coeficiente de partición del ARNt disminuye,
lo que indica una mayor afinidad por la fase de dextrano.[52] A
medida que la hidrofobicidad neta superficial del ARNt aumenta con
la temperatura, la partición cambia de la fase de dextrano a la fase
de PEG. Los ATPS también se han utilizado para evaluar la
hidrofobicidad neta superficial de las proteínas.[53,54] Finalmente,
además de los efectos de la hidrofobicidad de los ATPS en la
partición, también es importante considerar la interacción de las
fases fluidas con sustratos sólidos en función de la superficie.
química.[55] La química de la superficie del recipiente que contiene
el ATPS influirá en la humectabilidad de uno o ambos polímeros
formadores de fases. En el caso de las aplicaciones de micropatrones
en solución que se analizan más adelante, esto tiene el efecto de
reducir el ángulo de contacto de las gotas, es decir, las gotas tendrán tendencia a e

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2.3. La interfaz ATPS
La interfaz entre las fases masivas de un ATPS tiene una tensión interfacial
muy baja en comparación con la interfaz de un sistema de petróleo y
agua. Por ejemplo, la tensión interfacial del sistema PEG­dextrano varía
de ≈1 a 100 µN m­1 , dependiendo de los pesos
moleculares y las concentraciones de los polímeros.[56,57] Las
formulaciones de ATPS cercanas a la curva binodal tienen tensiones
interfaciales más pequeñas en comparación con las formulaciones
supercríticas alejadas de la curva binodal.[5] También se ha observado
que la adsorción de partículas en la interfaz aumenta a medida que
aumentan las concentraciones supercríticas de polímeros formadores de
ATPS.[56,58] Cuando las partículas se adsorben en la interfaz entre las
dos fases acuosas, el área interfacial se reduce proporcionalmente a el
número de partículas adsorbidas. Por tanto, hay una pérdida de área
interfacial que conduce a una disminución de la energía libre. Por esta
razón, la tensión interfacial es un determinante importante del
comportamiento de partición de biomoléculas y células, ya que estos
materiales normalmente se distribuyen dentro de las fases masivas, pero
en algunos casos, pueden quedar atrapados en la interfaz si hay
suficiente tensión interfacial presente. .[58] Además, el peso molecular del
polímero, el contenido de sal y la temperatura desempeñan un papel en
la determinación de la tensión interfacial de un ATPS. Bamberger et al.
observaron que la tensión interfacial aumentaba proporcionalmente a la
concentración de fosfato. Sin embargo, la adición de NaCl tuvo menos
efecto sobre la tensión interfacial.[37,58] La tensión interfacial también se
ve afectada por la temperatura. En general, bajar la temperatura favorece
la separación de fases de sistemas de dos polímeros y sistemas de
polímero­sal, aumentando así la tensión interfacial. Sin embargo, Forciniti
et al. que la correlación entre la tensión interfacial y la temperatura es
menos clara que con el peso molecular del polímero.[60] Otros han
observado que el pH puede afectar la tensión interfacial de un ATPS,[61]
particularmente en el caso de ATPS de sal de polímero.[62]
2.4. Partición de moléculas y partículas
La partición de una amplia variedad de materiales está influenciada por
sus propiedades fisicoquímicas, como su carga electroquímica,[47] tamaño
(peso molecular),[63] afinidad bioespecífica,[64] e hidrofobicidad de la
superficie.[50] Como se indicó anteriormente, en un ATPS PEG­dex tran,
la mayoría de los materiales hidrófilos se distribuirán a la fase inferior rica
en dextrano, que es menos hidrófoba que la fase superior rica en PEG.
Por el contrario, las moléculas hidrófobas[65]
(p. ej., proteínas que contienen una gran cantidad de aminoácidos no
polares) se dividirán en la fase superior más hidrófoba, rica en PEG.
La elección de materiales formadores de ATPS en función de su
hidrofobicidad puede mejorar la separación de una proteína específica de
acuerdo con las interacciones hidrofóbicas de la proteína con los
materiales de separación de fases. [66,67] Debido a su versatilidad para
dividir una amplia gama de materiales ( en particular proteínas y células),
además de su bajo costo, escalabilidad, fácil implementación y respeto
al medio ambiente, los ATPS han comenzado a reemplazar las técnicas
tradicionales de extracción con solventes orgánicos.[3,68,69] Además, los
ATPS no causan desnaturalización efectos sobre biomoléculas o células.[70,71]
Además, debido a su baja tensión interfacial, se ha informado que los
ATPS previenen el daño a estructuras celulares frágiles y, en algunos
casos, pueden incluso estabilizar materiales biológicos sensibles.[5]
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En los últimos años, estas capacidades han permitido a los ATPS
superar los desafíos encontrados en la industria biotecnológica, además
de permitir el confinamiento de materiales en gotas poliméricas para la
aplicación emergente que analizaremos en detalle en las siguientes
secciones.[70] Un ejemplo de aplicación de la tecnología ATPS para la
purificación avanzada de biomoléculas es la separación y purificación de
proteínas de fusión Zera en el sistema PEG­fosfato. La extracción de
proteínas de fusión Zera se optimizó modulando el peso molecular de
PEG, la longitud de la línea de unión, el pH, la carga de muestra y la
concentración de sal para seleccionar las mejores condiciones de
extracción. Tras la optimización de este proceso, fue posible dividir de
manera confiable proteínas recombinantes de alto valor.[72] Otro ejemplo
es la partición de alfa­amilasas. Las alfa­amilasas son hidrolasas
utilizadas industrialmente para la fermentación, la producción de
alimentos, la producción farmacéutica, el procesamiento de textiles y el
procesamiento de papel.[73,74] Las alfa­amilasas generalmente interactúan
con la fase de PEG en los sistemas de PEG­fosfato. Sin embargo, cuando
se utilizan PEG de mayor peso molecular (por ejemplo, por encima de
8000 g mol­1 ), las proteínas se dividen en la fase de fosfato inferior.
Aunque las enzimas se pueden aislar en cualquiera de las fases, la
recuperación de la fase de PEG requiere un procesamiento adicional para
la separación del polímero. Por lo tanto, elegir un peso molecular de
polímero apropiado (es decir, PEG 8000) simplifica el proceso de extracción.[73,75]
La separación y purificación de anticuerpos monoclonales en ATPS es
otra aplicación industrial importante donde la implementación de ATPS
ha demostrado potencial como enfoque para la recuperación y purificación
a gran escala.[76–79] Azevedo et al. demostró que la integración de un
sistema PEG­citrato con técnicas de cromatografía tradicionales mejoraba
la recuperación de anticuerpos. Previo a la cromatografía, la concentración
de los anticuerpos en la fase rica en citrato proporcionó un proceso de
recuperación con 72% de pureza de proteína ([IgG]/[proteína total]) y 97%
de rendimiento (masa de IgG eluida/masa inicial de IgG). La integración
con la extracción cromatográfica permitió la recolección de una solución
de proteína 100 % pura con un rendimiento del 90 %.[78] Este mismo
grupo desarrolló un método que integraba un sistema PEG­dextrano con
cromatografía de intercambio catiónico para la purificación de IgG. El
sistema PEG­dextrano recuperó el 82 % de la IgG con hasta un 96 % de
pureza de proteína. Después de la integración con extracción
cromatográfica, el proceso general dio como resultado una pureza de
proteína del 100 % y un rendimiento del 75 %.[79] Posteriormente, este
proceso se adaptó para la separación de microfluidos a fin de reducir el
tiempo de operación sin afectar la extracción de anticuerpos.[80]
3. Aplicaciones emergentes de los ATPS
Aunque la mayoría de las aplicaciones que involucran ATPS se centran
en el uso de volúmenes relativamente grandes de las dos fases (mL a L)
para la purificación de materiales biológicos, aquí nos centraremos en
cómo se han aplicado las propiedades de los materiales y los principios
de partición en microlitros para escala de nanolitros para desarrollar
ensayos biomoleculares y basados en células avanzados.
3.1. Micropatrón celular e ingeniería de microtejidos con ATPS
Las últimas dos décadas de ingeniería de tejidos se han centrado en el
desarrollo de nuevas estrategias para restaurar tejidos dañados.
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y/o órganos y comprender las interacciones entre células homotípicas y
heterotípicas implicadas en la formación y función de los tejidos.[81] El
análisis de las interacciones complejas célula­célula, célula­matriz extracelular
(MEC) y célula­entorno es crucial para comprender estos fenómenos. Una
variedad de enfoques de biopatrones para la fabricación de cultivos celulares
organizados espacialmente que incluyen, entre otros, impresión por
microcontacto,[82] patrones microfluídicos,[83] patrones basados en
esténciles,[84] bioimpresión basada en inyección de tinta,[85] y La bioimpresión
asistida por láser[86] ha ofrecido la posibilidad de explorar con mayor
profundidad las complejidades de cómo las células interactúan entre sí y su
entorno extracelular. Recientemente, se han desarrollado nuevas técnicas de
modelado basadas en ATPS como una alternativa a estos enfoques para el
modelado versátil de células sin contacto.
3.1.1. Micropatrones celulares para análisis de
crecimiento y diferenciación.
Utilizando técnicas de modelado basadas en ATPS, es posible colocar
células con precisión directamente sobre varios sustratos sin la necesidad de
modelar selectivamente o procesar el sustrato de antemano. Este método
utiliza polímeros formadores de ATPS (p. ej., PEG y dextrano), de modo que
gotitas de nanolitros a microlitros de células que contienen dextrano se
dispensan sobre un sustrato recubierto con una solución de PEG.[8,87] A
diferencia de otras técnicas que se basan en energía eléctrica o térmica, el
micropatrón ATPS aprovecha el rango óptimo de tensiones interfaciales
exhibidas en la interfaz entre polímeros de separación de fases para confinar
con precisión las células en las configuraciones deseadas sin la aplicación
de fuerzas duras que puedan dañar las células o dañar el sustrato.
Además, este enfoque es fácil de implementar y puede realizarse utilizando
herramientas de laboratorio sencillas, como micropipetas.[8]
Para realizar este enfoque, primero se disuelven bajas concentraciones
de polímeros de separación de fases en un medio de cultivo celular. Luego,
las islas o colonias de células se entregan a un sustrato dispensando gotitas
de dextrano que contienen células en una solución de PEG (Figura 3A).[8] El
mecanismo de patrón interfacial impulsado por la tensión confina las células
dentro de las gotitas de dextrano más densas en la superficie del sustrato,
pero permite que las células se adhieran a la superficie del sustrato con una
viabilidad de ≈98 a 100% en relación con los controles.[88,89 ] Una vez que
las células se adhieren al sustrato, los polímeros se eliminan fácilmente
enjuagando con medios de cultivo celular nuevos, dejando islas de células
modeladas. Informes recientes destacan el uso de esta técnica para crear
biomodelos de queratinocitos en colonias para mejorar el contacto y la
viabilidad entre células en comparación con las células sin patrón, lo que
puede tener aplicaciones futuras en la cicatrización de heridas y la
regeneración del tejido cutáneo.[89] Además de analizar el crecimiento y la
diferenciación de colonias, se han empleado estrategias similares para
modelar partículas y biomoléculas sobre monocapas celulares preexistentes.
Esta estrategia se ha utilizado para entregar materiales genéticos, enzimas e
incluso partículas flotantes, como microburbujas utilizadas para la
sonoporación, a las superficies de monocapas celulares sumergidas en PEG.
[70,90]
La tensión interfacial entre PEG y dextrano también se ha utilizado para
modelar zonas de exclusión celular depositando una fase de PEG cargada
de células encima de gotas de dextrano sin células modeladas para excluir
las células a medida que se asientan alrededor de la interfaz de las gotas de
dextrano (Figura 3B). ). Las zonas de exclusión celular tienen
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se ha aplicado para evaluar la migración celular, las tasas de proliferación y
la capacidad de cicatrización de heridas.[8,91] Por ejemplo, Tavana et al.
utilizaron patrones de exclusión celular para desarrollar un nuevo ensayo de
migración celular sin raspaduras, con formato de 96 pocillos y de alto
rendimiento.[91] Para lograr esto, se imprimieron y deshidrataron gotitas de
dextrano de un solo microlitro en la superficie de placas de micropocillos
estándar. Luego se añadió a los pocillos una fase de PEG cargada de células,
que rehidrató las regiones modeladas con dextrano para formar gotitas que excluyen células.
Esto generó áreas circulares bien definidas y libres de células dentro de una
monocapa sin necesidad de instrumentos especializados ni modificación del
sustrato subyacente, superando algunas de las limitaciones de los ensayos
convencionales de migración celular y cicatrización de heridas.
3.1.2. Micropatrones celulares para diseñar interacciones entre
células de mamíferos
El uso de sistemas de cocultivo con interacciones heterocelulares complejas
puede permitir un análisis fisiológicamente más relevante de las interacciones
entre células. Al combinar aún más zonas de exclusión celular e islas de
células, la tecnología de micropatrones ATPS permite el modelado de
múltiples tipos de células para generar cocultivos (Figura 3C). Por ejemplo,
Frampton et al. demostraron que los cocultivos de hepatocitos y fibroblastos
mostraban una mayor producción de albúmina que los monocultivos de
hepatocitos, lo que era indicativo de una función mejorada de las células
hepáticas.[8]
También se han generado patrones multiplexados de cocultivos combinando
la eyección acústica de gotas (ADE) y patrones de exclusión celular. Este
método utiliza presión de radiación acústica para expulsar gotas uniformes
de dextrano cargadas de células. Luego se añade a los cultivos una solución
de PEG que contiene células adicionales. El ADE de ATPS se ha aplicado
para estudiar el crecimiento del cáncer mediante el modelado de cocultivos
de células de cáncer de mama MDA MB 231 (confinadas en gotitas de
dextrano) y células HEK 293 (aplicadas en PEG) para investigar los efectos
de la señalización CXCL12/CXCR4 (una vía que media en el cáncer).
metástasis, proliferación celular y migración).[92]
También ha habido un interés cada vez mayor en la generación de
ambientes heterocelulares para la investigación con células madre, lo que ha
llevado al desarrollo de muchas técnicas de modelado celular específicas
para las células madre .[93–95] Sin embargo, el éxito de estas técnicas
depende de qué tan bien funcionen. imitan interacciones microambientales y
efectos reguladores sobre el destino celular. Los métodos de creación de
patrones convencionales se basan en materiales adhesivos para facilitar la
adhesión de un segundo tipo de células a una capa de células existente,[96]
pero el posicionamiento de esta segunda capa puede ser un desafío.[71]
Además, algunas de las técnicas utilizadas para la creación de patrones de
célula a célula requieren contacto físico, lo que puede dañar sustratos
delicados como las capas de células. Para abordar estas limitaciones, se
utilizaron ATPS para modelar espacialmente un tipo de células en una capa
de células existente (Figura 3D). En este caso, se dispensó una gotita de
dextrano cargada de células sobre una capa existente de células recubiertas
con PEG. Usando esta técnica, fue posible conservar la viabilidad de las
células impresas y la capa de células preexistente después del biopatrón de
cocultivo. Además, este estudio reveló una diferenciación neuronal mejorada
de células madre embrionarias de ratón impresas en células estromales PA6.
[71,88] La utilidad de la tecnología de micropatrones ATPS se demostró aún
más mediante grupos de patrones.
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Figura 3. Descripción general de las técnicas de micropatrones de células ATPS. A) Micropatrones de islas. Se dispensan gotitas de dextrano cargadas de células sobre una placa
recubierta con PEG. Las células están confinadas dentro de las gotitas, lo que da como resultado la formación de islas de células adherentes como se muestra en las imágenes de
la derecha (línea celular HEK001, barra de escala = 100 y 200 µm). Adaptado con autorización.[89] Copyright 2017, MRS Avances. B) Micropatrón de exclusión. Se dispensa una
fase de PEG cargada de células sobre una placa que contiene gotitas de dextrano, lo que da como resultado la formación de zonas de exclusión. Las imágenes de la derecha
muestran zonas de exclusión y migración de células de cáncer de mama MDA MB­231 (línea celular MDA MB­231, barra de escala = 1 mm). Adaptado con autorización.[91]
Copyright 2011, Materiales funcionales avanzados. C) Micropatrones de cocultivo. Se pipetean gotitas de dextrano cargadas de células sobre placas de cultivo de tejidos estándar.
Luego se añade lentamente PEG cargado de células a la placa, lo que da como resultado la formación de cocultivos después de la unión de las células a la placa. Las imágenes
de la derecha muestran cocultivos de células HEPG2 C3A y fibroblastos NIH 3T3. Adaptado con autorización.[8] Copyright 2013, JOVE. D) Las islas de células madre (mESC) se
pueden imprimir en una capa estromal PA6 utilizando la técnica de micropatrón de islas ATPS para mejorar la diferenciación neuronal. Las imágenes de la derecha muestran
imágenes de campo brillante y fluorescencia de mESC impresas. Las células mESC diferenciadas se tiñen con el marcador de diferenciación TuJI beta tubulina clase III específico
de neurona. (Barra de escala = 250 y 500 µm). Adaptado con autorización.[72] Copyright 2011, Materiales avanzados.

de células alimentadoras con espaciado predefinido en hidrogeles y 3.1.3. Micropatrones celulares para diseñar microambientes
monocapas celulares. Este estudio permitió la producción de alto de crecimiento microbiano
rendimiento de microambientes de células madre embrionarias y pudo
identificar las funciones de diferentes células alimentadoras en la De manera similar a los cocultivos de mamíferos, se han explorado
diferenciación de células madre. plataformas de cocultivo in vitro controladas y estandarizadas para estudiar
Esta breve sinopsis del patrón celular basado en ATPS destaca su las interacciones entre tipos de células microbianas o entre células
potencial en la investigación de células madre y aplicaciones de ingeniería eucariotas y procariotas. Un desafío en el desarrollo de estos sistemas ha
de tejidos. En términos de investigación con células madre, esta tecnología sido superar las condiciones de crecimiento incompatibles entre estos tipos
de microimpresión suave y sin contacto será útil para determinar las de células.[98] Otros desafíos incluyen equilibrar la cinética de crecimiento
condiciones óptimas para dirigir el destino de las células madre hacia entre especies microbianas y/o células de mamíferos cuando se utilizan
linajes particulares. La capacidad de generar entornos heterocelulares células microbianas competentes para la replicación y promover la dinámica
también permitirá un análisis fisiológicamente más realista de la proliferación que ocurre durante la colonización microbiana natural, como la formación
y migración celular. Finalmente, la creación de patrones de alto rendimiento de biopelículas y la detección de quórum. Al depositar y cultivar bacterias
de construcciones celulares complejas algún día podría usarse como una dentro de los ATPS, es posible superar algunas de estas limitaciones, ya
herramienta para optimizar las interacciones microambientales y producir que las bacterias vivas capaces de replicarse se pueden depositar en
tejidos cultivados en laboratorio más representativos para el modelado ubicaciones precisas en un formato que permita la transmisión directa.
fisiológico de diversas enfermedades, como se describirá con más detalle en la Sección 3.1.4.

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Señalización intercelular mediada por factor soluble y célula­célula.

Además, la tensión interfacial entre las fases en un ATPS ayuda a mantener el
confinamiento físico de las células bacterianas dentro de la fase de gotitas,
evitando así el crecimiento excesivo.
Mientras tanto, pequeñas moléculas y metabolitos pueden difundirse libremente
a través de la interfaz para mitigar el agotamiento de nutrientes y la acumulación
excesiva de desechos. Este delicado equilibrio de los parámetros del
microambiente del cocultivo es difícil de replicar utilizando técnicas convencionales
de cocultivo de microbios y mamíferos.[99­101]
Yaguchi et al. demostró que los ATPS basados en polímeros pueden usarse
para modelar microbios vivos en un ambiente completamente acuoso .[102]
Utilizando un ATPS de PEG­dextrano, se modelaron múltiples especies de
bacterias en colonias adyacentes sin entremezclarse.
Como se describió anteriormente para las células de mamíferos, esto se logró
suspendiendo las bacterias en soluciones separadas de dextrano antes de su
deposición directa mediante micropipeta sobre un sustrato cubierto con PEG.
Este mismo estudio demostró que las colonias bacterianas pueden modelarse
para formar biopelículas confinadas sobre una biopelícula preformada más
grande (Figura 4A). Las biopelículas bacterianas modeladas se desarrollaron y
maduraron dentro de los límites de las gotitas de dextrano en el transcurso de
dos días, siendo el tamaño de la biopelícula madura proporcional al volumen de
la gotita de dextrano inicial. Para demostrar la transferencia de resistencia a los
antibióticos entre colonias de bacterias, los autores también crearon cultivos
modelados que constan de dos biopelículas superpuestas de dos cepas
diferentes de Escherichia coli. Se modelaron colonias circulares de una cepa de
E. coli MG1655/pLacCherry sensible a la ampicilina sobre una capa de biopelícula
preexistente que consistía en una cepa de E. coli productora de lactamasa y
resistente a la ampicilina (MG1655/pAmCyan). La presencia de ampicilina causó
b un daño significativamente menor a las colonias de pLacCherry sembradas
sobre la biopelícula pAmCyan, en comparación con colonias similares sembradas
sobre una biopelícula de E. coli MG1655 de tipo salvaje , o células cultivadas en Figura 4. Aplicaciones de ATPS en cultivo microbiano. A) Se pueden modelar colonias
bacterianas utilizando un ATPS de PEG­dextrano para administrar células directamente
poliestireno de cultivo de tejidos. Este estudio recapituló los beneficios
sobre una biopelícula bacteriana preexistente, formando dos colonias distintas pero
comensalistas conferidos por una especie a otra en comunidades microbianas
interconectadas. Adaptado con autorización.[102] Copyright 2012, Biomacromoléculas.
complejas que se encuentran en la naturaleza.[103­105] B) Aquí, mCherry que expresa E. coli forma una biopelícula estable sobre una
monocapa de células epiteliales mamarias humanas (MCF10a). E. coli que expresa
invasina (inv+) de Yersinia pseudotuberculosis puede invadir las células MCF10a
La técnica de modelar y confinar colonias de bacterias para formar biopelículas subyacentes y provocar la muerte celular, lo que demuestra una interacción microbio­
célula de mamífero directa y localizada. C) La presencia de una bacteria depredadora
estables puede extenderse al estudio de las interacciones entre bacterias y
células de mamíferos. Las bacterias cultivadas pueden suspenderse en el medio Gram negativa, Bdellovibrio bacteriovorus, reduce significativamente la densidad de
inv+E. coli, que a su vez rescata a la célula MCF10a subyacente de la muerte celular
de dextrano y modelarse directamente sobre una monocapa epitelial sumergida causada por la invasión de E. coli . Adaptado con permiso .[106] Copyright 2013,
en medio PEG (Figura 4B).[106] Dwidar et al.
Este sistema proporciona confinamiento físico de las células bacterianas, lo que
resuelve los problemas antes mencionados relacionados con la cinética de fue notablemente menor en comparación con las placas de control, lo que sugiere
crecimiento y la disponibilidad de nutrientes. En este sistema, las células que B. bacteriovorus podría moverse desde las regiones circundantes a las gotas
bacterianas todavía pueden hacer contacto físico con la monocapa epitelial, lo de dextrano cargadas de bacterias para depredar a las células bacterianas
que puede permitir un análisis detallado de la virulencia bacteriana y los efectos patógenas (Figura 4C). Además, la autorización de INV+
de los factores secretados en las células de mamíferos. Utilizando esta plataforma las colonias de bacterias restauraron la salud y la integridad de la monocapa
como ensayo antimicrobiano funcional, Dwidar et al. demostró el rescate de una epitelial, lo que sugiere que B. bacteriovorus puede ser un agente biológico
monocapa epitelial de mamíferos de bacterias que expresan invasinas por parte prometedor en la lucha contra la infección bacteriana resistente a los antibióticos.
de Bdellovibrio bacteriovorus, un depredador específico de las bacterias [107,108] El uso de la plataforma de cocultivo ATPS como ensayo funcional es
gramnegativas. E. coli MG1655/pINVCherry, una cepa que expresa el gen invasin un método interesante desarrollo en este campo, ya que brinda a los
(inv+) de Yersinia pseudotuberculosis , fue capaz de invadir la monocapa epitelial investigadores la capacidad de estudiar las interacciones entre microbios y
mediante asociación con receptores de 1­integrina en las células epiteliales, lo células de mamíferos en un mayor nivel de complejidad.
b directamente.
que llevó al deterioro de la integridad de las células MFC10a
debajo de la colonia bacteriana. Cuando se cultiva en presencia de B.
bacteriovorus, la supervivencia de E. coli 3.1.4. Autoensamblaje de construcciones de células y tejidos en ATPS

MG1655/pINVCherry, junto con otras dos especies bacterianas (Shigella. boydii Si bien los avances en las técnicas de cultivo celular durante la última década
KACC 10792 y Pseudomonas sp. DSM 50906) han mejorado enormemente nuestra capacidad para analizar complejos

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Las funciones y comportamientos celulares, aspectos de la arquitectura
del tejido nativo, el transporte de masa y la interacción célula­célula
pueden perderse en el cultivo 2D, incluso en formatos algo más complejos,
como los creados mediante el biopatrón ATPS. Se han propuesto
modelos simples de microtejidos en 3D como plataformas alternativas
para la detección de fármacos y el desarrollo de ensayos in vitro, y el
ensamblaje de microtejidos basado en ATPS ha ofrecido avances para
la fabricación de construcciones autoensambladas ricas en células.[109–
111] Técnicas comunes de cultivo en 3D Por lo general, se dividen en
dos categorías: cultivo agregado, que se basa en las propiedades de
autoensamblaje espontáneo de ciertos tipos de células para formar
estructuras tridimensionales como esferoides, o cultivo basado en
andamios, que utiliza un hidrogel u otro material de andamiaje para
actuar. como soporte estructural para la adhesión celular y el crecimiento 3D. medio líquido, lo que puede ser problemático para los métodos de gota
En los últimos años, se ha revelado que las capacidades de partición
de los ATPS tienen una utilidad única en la ingeniería de microtejidos 3D.
mirando. El cultivo agregado se logra convencionalmente promoviendo
la agrupación celular mediante la suspensión de células en gotas
colgantes, agitación mecánica uniforme continua mediante matraces
giratorios o cultivo en suspensión orbital rotatorio y placas especialmente
diseñadas y de baja adherencia.[110,112–116] Sin embargo, estas
técnicas pueden ser de bajo rendimiento, costosos, técnicamente
complejos, generar agregados no uniformes y/o requerir equipo especializado.
Para abordar estas limitaciones, el grupo Tavana desarrolló una nueva
técnica de cultivo agregado de alto rendimiento facilitada por ATPS
(Figura 5A). un volumen mayor de una solución de fase superior en una
placa de fondo redondo recubierta de plurónico. Este formato permite que
las células que se encuentran en una proximidad estrecha y controlable
entre sí se agreguen en esferoides sin el riesgo de evaporación de su
colgante. Aunque inicialmente

Figura 5. Descripción general de la ingeniería de microtejidos facilitada por ATPS. A) Cultivo agregado a microescala no adherente. Las placas de fondo redondo no tratadas
están recubiertas con 1% de plurónico para evitar la adhesión celular. Luego se dispensa una solución de suspensión celular rica en la fase inferior (dextrano 500 kDa) en un
conjunto de solución de la fase superior (PEG 35 kDa), que atrapa las células dentro de la gotita de la fase inferior, lo que da como resultado la formación de agregados como se
muestra a la derecha (MDA). ­Línea celular MB­157; barra de escala = 200 µm). Adaptado con autorización.[119] Copyright 2015, JOVE. B,C) Cultivo agregado a micro y macroescala.
B) Cuando la fase inferior de un ATPS alcanza una concentración crítica en la que la fuerza de flotación que actúa sobre las células es mayor que la fuerza gravitacional que
empuja a las células en la dirección opuesta, las células pueden quedar atrapadas en la interfaz entre las dos soluciones de ATPS. Los agregados de MCF­7 a microescala se
forman en el vértice de una gota cuando las células suben a la interfaz (línea celular MCF­7; barra de escala = 400 µm). Adaptado con autorización.[120] Copyright 2015, Han et
al. C) En la macroescala, las células suspendidas en una solución de fase superior se sedimentan y se recolectan en la interfaz del ATPS, con una incubación a más largo plazo
que da como resultado una mayor agregación y formación de microtejidos (línea celular MCF­10 A; barra de escala = 5 mm). Adaptado con autorización.[121] Copyright 2015,
Materiales funcionales avanzados. (D) Cultivo celular de hidrogel basado en andamio a microescala. Las células combinadas con un hidrogel formador de andamio y una
solución formadora de fase inferior se dispensan en un conjunto de solución de fase superior para evitar la evaporación del hidrogel. El hidrogel se reticula (p. ej., calentando
colágeno tipo I) para formar un andamio (verde) alrededor de las células. Adaptado con autorización.[125] Copyright 2014, Biomateriales.

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Presentada en un formato de 96 pocillos, su técnica se ha adaptado desde
entonces a placas de 384 pocillos para la detección avanzada de fármacos
Hay muchas técnicas disponibles para la detección de biomoléculas en muestras
oncológicos de alto rendimiento utilizando modelos de microtejidos tumorales en 3D.[111]
Otras estrategias de microtejidos incluyen el trabajo de Han et al. utilizando
manipulación de densidad de fase basada en ATPS (Figura 5B).[120]
Al cambiar la concentración de polímero de la solución de la fase inferior rica en
dextrano, se podría aumentar la densidad de la fase. Por lo tanto, la mayor
densidad del líquido de la fase inferior aumentó la fuerza de flotación que actúa
sobre las células menos densas, lo que provocó que las células quedaran
atrapadas en la interfaz del ATPS debido a las fuerzas opuestas de tensión
interfacial y flotabilidad. En otro estudio basado en un concepto similar, las células
se combinaron con la solución de fase superior rica en PEG y cayeron hacia la
interfaz debido a una fuerza gravitacional mayor en relación con la fuerza de
flotación (Figura 5C).[121 ] Las fuerzas que actúan sobre las células en la interfaz
del ATPS fueron suficientes para promover la agregación a macroescala para
formar construcciones similares a la piel. Es importante señalar, sin embargo,
que, como lo han sugerido estudios anteriores, la concentración de polímeros y
las propiedades de superficie específicas del tipo de célula pueden afectar el
comportamiento de partición celular.[ 120,122] Sería necesario caracterizar el
ATPS y el tipo de célula antes de generar ensayos basados en agregados.
especialmente en los casos en los que líneas celulares o fuentes celulares
primarias contienen poblaciones mixtas que pueden tener diferentes propiedades
superficiales y sensibilidades a las condiciones de crecimiento.
Los ATPS proporcionan una plataforma útil para el confinamiento celular,
pero no siempre dan como resultado propiedades de agregación deseables
según el tipo de célula de interés. Los comportamientos celulares como la
remodelación de la ECM también pueden ser difíciles de observar o evaluar en
los formatos de agregados compactados. Por lo tanto, los ensayos funcionales
dirigidos a las interacciones célula­matriz (p. ej., ensayos de contractilidad
mecánica) se han realizado comúnmente usando colágeno tipo I u otros
hidrogeles para encerrar las células antes de entrecruzarlas en una estructura.
[123,124] Una debilidad clave de la fabricación a base de hidrogel Sin embargo,
las construcciones de microtejidos implican las limitaciones de los sistemas de
pequeño volumen a base de líquidos. Se requieren grandes cantidades de
material de hidrogel y células para evitar la evaporación y los efectos indeseables
de tensión interfacial entre líquidos y aire, lo cual es costoso, de bajo rendimiento
y produce cultivos innecesariamente espesos con peores propiedades de
transporte de masa.
Como los ATPS permiten la manipulación de sistemas líquidos y el aislamiento
de la fase inferior del aire mediante la fase superior, el grupo de Takayama evitó
la evaporación y la tensión interfacial combinando colágeno tipo I con una fase
inferior rica en dextrano y atrapándola dentro de otra solución acuosa ( Figura
5D).[125,126] Una investigación adicional realizada por nuestro laboratorio reveló
que también se podría aplicar una metodología similar basada en ATPS a
Matrigel, un hidrogel termosensible basado en ECM.[127]
Si bien es incompatible con el ATPS de dextrano de 500 kDa y PEG de 35 kDa
de uso común debido a la formación inmediata de precipitado cuando se combina
con Matrigel, la hidroxipropilmetilcelulosa (fase superior) y un dextrano de 10 kDa
de bajo peso molecular (fase inferior) actúan como un ATPS eficaz para la
formación. de ≈60–
Discos finos de 110 µm en formato de placa de 96 pocillos. Queda una amplia
gama de materiales potenciales con capacidades de formación de ATPS que
pueden ser útiles para futuras aplicaciones de cultivo 3D que aún no se han
explorado. En la actualidad, la simplicidad y la rentabilidad de los ATPS han
facilitado enfoques prometedores para ensayos de microtejidos 3D accesibles y
de alto rendimiento que tienen el potencial de ofrecer modelos más representativos
de diversos tejidos.
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3.2. Microarrays de solución para análisis bioquímicos
complejas, que pueden estar libres de etiquetas (p. ej., análisis basado en
espectrometría de masas) o pueden incluir enfoques basados en etiquetas (o
inmunométricos).[128,129] Sin embargo, la mayoría de las técnicas Los métodos
de detección existentes que se utilizan clínicamente se basan en el ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), que utiliza anticuerpos de captura
y detección para medir la concentración de analitos de interés en una muestra
biológica. ELISA es la técnica estándar de oro para los inmunoensayos clínicos
y es capaz de detectar una variedad de patologías que van desde cáncer hasta
enfermedades autoinmunitarias con alta sensibilidad y especificidad.[130–132]
Sin embargo, las plataformas ELISA convencionales pueden sufrir reacciones
cruzadas entre anticuerpos mezclados en una solución común, que conduce a
lecturas falsas positivas o falsas negativas. Esto puede dar como resultado un
diagnóstico y tratamiento inexactos de los pacientes y también puede complicar
la validación de paneles de múltiples biomarcadores y el desarrollo posterior de
ensayos clínicamente aplicables.[133] Para abordar este inconveniente, se han
desarrollado estrategias basadas en ATPS para eliminar posibles reacciones
cruzadas de anticuerpos en paneles multiplex confinando con precisión los
anticuerpos en ubicaciones específicas. Frampton y cols. desarrolló un método,
denominado ATPS­ELISA, que previene reacciones cruzadas de anticuerpos, al
tiempo que utiliza volúmenes más bajos de anticuerpos y muestras de pacientes
que el ELISA convencional. Este método aprovecha un sistema PEG­dextrano
para facilitar la deposición de soluciones de anticuerpos de detección contenidas
en gotas de dextrano sobre regiones de anticuerpos de captura previamente
modeladas (Figura 6A). Este procedimiento sigue el flujo de trabajo ELISA
estándar y es compatible con reactivos ELISA y herramientas de laboratorio
disponibles comercialmente, como multipipetas portátiles. Al igual que con las
técnicas descritas anteriormente para el micropatrón de células en solución, las
gotas de dextrano más densas se hunden dentro de una solución de PEG común
y permanecen en contacto con la placa de ensayo durante la incubación. La
tensión interfacial entre las soluciones de PEG­dextrano y la interfaz de PEG­
dextrano­placa de ensayo garantiza la formación de gotitas de dextrano estables
que permanecen en su lugar y evita la dispersión difusa de los anticuerpos de
detección. En este estudio, la estabilidad de las gotas se mejoró aún más
mediante el uso de una placa de ensayo personalizable con microindentaciones
diseñadas para aumentar el área de superficie en contacto con las gotas de
dextrano. Esta estrategia proporcionó la detección de cuatro biomarcadores
asociados con la enfermedad de injerto contra huésped aguda sin reacción
cruzada de anticuerpos debido a la difusión, lo que permitió un análisis
simplificado de los biomarcadores séricos.[28]
Aunque el flujo de trabajo ELISA tipo sándwich descrito anteriormente es el
método más utilizado para la detección de biomarcadores en muestras biológicas,
es difícil mejorarlo en términos de automatización y rendimiento. Para superar
estos obstáculos, se desarrolló una técnica para micropatrones basados en
ATPS de una plataforma AlphaLISA basada en cuentas homogéneas (Figura
6B). Esta elección de un ensayo homogéneo ofrece la posibilidad de aumentar el
rendimiento, una reducción del tiempo total del ensayo mediante la eliminación
de pasos de lavado y una sensibilidad y rango dinámico superiores del ensayo.
[134] Sin embargo, en su formato estándar, esta técnica normalmente sólo
permite la detección de una sola proteína. De manera similar al procedimiento
ATPS ELISA, AlphaLISA se multiplexó con el uso de un sistema PEG­dextrano
para dividir el anticuerpo conjugado con perlas.
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Figura 6. Técnicas de inmunoensayo basadas en ATPS. A) ELISA sándwich multiplexado con ATPS. Los anticuerpos de captura se aplican a la placa ELISA. La colocalización
de anticuerpos de detección sobre anticuerpos de captura se realiza utilizando un sistema PEG­dextrano. Este sistema confina los anticuerpos en gotas de dextrano, evitando
reacciones cruzadas. Se generan curvas estándar para hasta cuatro biomarcadores (como lo muestra el HGF analizado mediante ATPS­ELISA y en comparación con ELISA
tipo sándwich convencional). Adaptado con autorización.[28] Copyright 2014, Frampton et al. B) AlphaLISA multiplexada con ATPS. Los complejos anticuerpo­perla están
confinados en gotitas de dextrano, lo que elimina las reacciones cruzadas de anticuerpos. Las placas personalizadas permiten el análisis de hasta cuatro biomarcadores.
Adaptado con permiso .[135] Copyright 2014, Tecnología. C) ATPS + ensayo de flujo lateral. Los analitos se enriquecen antes de su introducción en la tira de flujo lateral para
aumentar la sensibilidad total del ensayo. Adaptado con autorización.[142] Copyright 2014, Biotecnología y Bioingeniería.

reactivos dentro de matrices con micropatrones de gotitas de dextrano, presencia de un reactivo sustrato apropiado. Según los autores, este
lo que evita reacciones cruzadas no específicas entre los reactivos para método simplifica el procedimiento ATPS­ELISA y reduce los posibles
mejorar la detección de proteínas multiplex. En este estudio se analizaron errores del usuario debido a una colocación más sencilla de las gotas.
sobrenadantes de plasma humano y de cultivos celulares.[135] También abre la posibilidad de automatizar el proceso de fabricación de
Recientemente, estos procedimientos ELISA basados en ATPS se la matriz de anticuerpos. En este estudio se analizaron los sobrenadantes
mejoraron aún más para facilitar la operación a los usuarios finales y de cultivos celulares y se compararon los valores del límite de detección
reducir los pasos de pipeteo. Esto se logró deshidratando el ATPS (LOD) y de la relación señal­ruido (S/N) con el ATPS­ELISA anterior.
durante la preparación y luego rehidratándolo con una solución que Los resultados mostraron un LOD comparable entre los métodos y una
contenía el analito. En este ensayo simplificado, primero se inmovilizaron S/N más baja utilizando la técnica ATPS deshidratada.[136]
soluciones de anticuerpos de captura en la superficie de la microplaca Los ATPS también se han aplicado para mejorar la sensibilidad del
mediante deshidratación en presencia de lioprotectores. inmunoensayo de flujo lateral (LFA) utilizando una estrategia similar a la
Luego, las placas se prepararon mediante la aplicación de una capa de empleada en ATPS­ELISA para confinar biomoléculas (Figura 6C ).[137]
separación que contenía lioprotectores adicionales y dextrano, antes de LFA es un sistema de diagnóstico en papel que se utiliza comúnmente
aplicar una capa adicional que contenía lioprotectores, dextrano y para detectar biomarcadores de enfermedades y agentes infecciosos
anticuerpos de detección conjugados con peroxidasa de rábano picante como la bacteria Chlamydia trachomatis.[138]
(HRP). Después del secado completo, las micromatrices de anticuerpos La infección por clamidia se considera la enfermedad de transmisión
se rehidrataron en una solución de PEG que contenía los analitos diana. sexual más común en todo el mundo y puede causar secuelas graves,
Los analitos se difundieron desde la fase de PEG hacia las gotitas de como enfermedad inflamatoria pélvica en las mujeres y daño permanente
dex tran que contenían los anticuerpos de captura inmovilizados y los al sistema reproductivo si no se trata. Por esta razón, existe una demanda
anticuerpos de detección confinados en dextrano para formar complejos urgente de dispositivos de bajo costo, rápidos y fáciles de usar que
de anticuerpo de captura, analito y anticuerpo de detección que podrían permitan la detección temprana de esta enfermedad.[139] El
detectarse mediante el desarrollo de quimioluminiscencia en la fase de PEG. inmunoensayo de flujo lateral mejorado

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diseñado para el diagnóstico de clamidia utilizó una solución de muestra para
rehidratar un sistema de PEG­fosfato deshidratado, concentrando C.
trachomatis dentro del papel LFA. El dispositivo de diagnóstico fue diseñado
para integrar un ATPS de sal de PEG con LFA estándar aplicando las muestras
de C. trachomatis a la región de formación de ATPS del dispositivo donde se
concentraron, lo que tuvo el efecto de mejorar la sensibilidad del ensayo al
enriquecer los analitos objetivo presentes. en la muestra original. En este
procedimiento, una vez que las muestras concentradas alcanzaron la sección
estándar de LFA, la detección del objetivo (p. ej., C. trachomatis) mejoró
significativamente en comparación con la versión de solo LFA, con una mejora
diez veces mayor en la sensibilidad. El mismo grupo desarrolló otros enfoques
de diagnóstico a pequeña escala combinando ATPS con LFA, mejorando la
detección de biomoléculas como proteínas[140,141] y virus.[142,143]
Se han aplicado estrategias similares para detectar la contaminación de
los alimentos por toxinas naturales, por ejemplo micotoxinas.[144] La pérdida
anual de productos alimenticios debido a la contaminación por micotoxinas es
considerable; se estima que hasta el 25% de los cultivos alimentarios del
mundo contienen algún nivel de contaminación por micotoxinas.
Esto da como resultado un desperdicio estimado de mil millones de toneladas
métricas de alimentos por año que se consideran no aptos para el consumo
humano debido a la probable presencia de micotoxinas que pueden causar
problemas de salud graves, incluidos cáncer, hepatoxicidad, neurotoxicidad e
inmunosupresión.[145] Debido al impacto de la contaminación por micotoxinas
en el sector de producción de alimentos, la detección rápida de micotoxinas
en muestras de alimentos es extremadamente importante.
Las tecnologías tradicionales desarrolladas para mejorar la detección de
micotoxinas suelen utilizar disolventes orgánicos y procedimientos complejos
de varios pasos. Para mejorar las capacidades de detección de micotoxinas,
se desarrolló una extracción en un solo paso utilizando un sistema de citrato
de PEG. El método consiste en concentrar y extraer tres micotoxinas diferentes
del pienso crudo. Primero se mezclan vigorosamente las muestras con la
solución de extracción de citrato de PEG. Después de la extracción, las fases
de ATPS se separan mediante centrifugación, lo que conduce a la partición
de la micotoxina en la fase superior rica en PEG. Luego se recoge la fase rica
en PEG y se diluye con una solución de anticuerpo antimicotoxina marcada
con HRP.
Esta solución se inserta en un canal de microfluidos, previamente recubierto
con conjugado micotoxina­BSA y bloqueado con una solución de albúmina
sérica bovina (BSA). Finalmente, se inyecta una solución de luminol más
peróxido de hidrógeno en el microcanal para generar una señal de
quimioluminiscencia que puede detectarse mediante microscopía.[146]
Otro ejemplo de la utilidad de los ATPS en el desarrollo de inmunoensayos
se refiere al marcador de diagnóstico del cáncer de próstata comúnmente
utilizado, el antígeno prostático específico (PSA). La detección de PSA mejoró
al dividir las isoformas de PSA en ATPS. IsoPSA, anteriormente conocido
como PSA/SIA, es un análisis de sangre que detecta cada isoforma de PSA
dividida entre las dos fases acuosas. El PSA total en ambas fases se mide
mediante un ELISA clínico de PSA convencional. Con base en el coeficiente
de partición, se puede generar un índice estructural compuesto de la población
de isoformas de PSA.[147,148] Según un estudio prospectivo multicéntrico
reciente, IsoPSA ha demostrado ser más sensible y específico que la prueba
estándar de oro actual de PSA, con potencial para reducir las biopsias
innecesarias y disminuir el riesgo de sobredetección y sobretratamiento de
cánceres de próstata no letales.[148]
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3.3. Microfluidos
Las plataformas de microfluidos, como la tecnología LFA descrita anteriormente,
el sistema de determinación binodal de microfluidos descrito en la Sección 2.1
(Figura 7A) y los sistemas de microcanales que se describen a continuación,
son herramientas interesantes para la biotecnología porque permiten la
manipulación precisa de pequeños volúmenes de disolventes, reactivos y
células, que pueden reducir los costos de los ensayos, mejorar el rendimiento
y la calidad del análisis y conservar muestras raras o costosas. También se
promocionan para estos dispositivos ventajas como tiempos de reacción
cortos, portabilidad, versatilidad en el diseño a través de la creación rápida de
prototipos e integración con otras tecnologías miniaturizadas .[29,149,150]
Recientemente, la comunidad de investigación de microfluidos ha comenzado
a explorar cómo se puede utilizar ATPS para mejorar aún más las capacidades
de los dispositivos de microfluidos.
3.3.1. Dispositivos de microfluidos continuos
Los dispositivos de microfluidos de flujo continuo se refieren a dispositivos
que generan corrientes de fluido laminares dentro de microcanales que
permiten la separación continua de pequeños volúmenes de muestra. El flujo
laminar forma una interfaz estable entre las soluciones de polímeros, a través
de la cual se segregan biomoléculas o células.[151]
Los dispositivos de microfluidos de flujo continuo que incorporan ATPS se
han utilizado principalmente para el enriquecimiento de biomoléculas y células
(Figura 7B, C). Uno de los primeros estudios para integrar ATPS con
microfluidos utilizó un canal de flujo laminar convencional diseñado para
separar leucocitos y eritrocitos de la sangre completa con mucha mayor
eficiencia en comparación con los procedimientos por lotes convencionales.
Utilizando un ATPS compuesto de PEG y dex tran, fue posible recuperar
simultáneamente eritrocitos en la fase de dextrano y leucocitos en la fase de
PEG.[69,152] Este fenómeno puede explicarse por la repulsión de la carga
negativa en la membrana de los leucocitos de la fase de dextrano cargada
negativamente y por la afinidad de la cadena de azúcar en la superficie de los
eritrocitos por el dextrano. Tsukamoto et al. Además, demostró la eficacia de
esta técnica ATPS basada en microfluidos. Pudieron recuperar hasta el 99 %
de los eritrocitos y el 96 % de los leucocitos (células Jurkat), en comparación
con la recuperación del 97 % de los eritrocitos y el 15 % de los leucocitos
utilizando un enfoque por lotes ATPS convencional.[152] Además, SooHoo y
Walker utilizaron un sistema microfluídico de PEG­dextrano para separar
ambos tipos de células simultáneamente. Su enfoque resultó en hasta un 9,13­
aumento de veces en la concentración de leucocitos sobre el control (sin
ATPS).[69] Además de la purificación de células en ATPS, los ATPS de
microfluidos también han permitido la creación de micropatrones de diferentes
poblaciones de células con una contaminación cruzada mínima entre las
poblaciones de células, así como la administración química selectiva dentro
de los canales de microfluidos (Figura 7D). Este enfoque permitió un modelado
celular más preciso en dispositivos de microfluidos y un tratamiento químico
más localizado para las células que crecen dentro de microcanales en
comparación con el patrón de flujo laminar convencional.[153]
La recolección y el enriquecimiento de moléculas dentro de dispositivos
microfluídicos también se pueden mejorar mediante los efectos de partición
de los ATPS. Al integrar ATPS con microfluidos, a menudo se mejora la
eficiencia de la separación de biomoléculas basada en ATPS. Esto se puede
lograr aumentando la superficie
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Figura 7. Aplicaciones de ATPS en sistemas de microfluidos continuos y de gotas. A) Análisis binodal. Esquema de un dispositivo microfluídico de análisis binodal ATPS y curvas
binodales asociadas. Adaptado con autorización.[12] Copyright 2014, Journal of Chromatography A. B) Partición de biomoléculas.
Imágenes representativas de un dispositivo de microfluidos que muestran IgG marcada con FITC en una fase rica en detergente entrando en una fase rica en PEG al final del
microcanal. Adaptado con autorización.[157] Copyright 2011, Journal of Chromatography A. C) Partición celular. Diagrama de un dispositivo de microfluidos utilizado para la
extracción de células en comparación con los datos del método convencional a la derecha. Adaptado con autorización.[152] Copyright 2009, Analista. D) Patrón de celda de flujo
laminar. Diagrama de un dispositivo de microfluidos utilizado para administrar tripsina de forma selectiva a una población de células que crece dentro de un microcanal, como se
muestra a la derecha. Adaptado con autorización.[153] Copyright 2011, Microdispositivos biomédicos. E) Generación pasiva de gotas en un dispositivo de microfluidos. Adaptado
con autorización.[162] Copyright 2016, laboratorio en un chip. F,G) Microencapsulación utilizando ATPS. Diagramas de dispositivos de microfluidos utilizados para generar
microcápsulas de proteínas y células como se muestra a la derecha. F) Adaptado con autorización.[163] Copyright 2016, Angewandte Chemie. G) Adaptado con autorización.[164]
Derecho de copia 2010, Ciencias Químicas. H) Patrón de islas celulares. Diagrama de un dispositivo de microfluidos accionado por Braille utilizado para generar células que
contienen gotas de dextrano, como se muestra a la derecha. Adaptado con autorización.[153] Copyright 2011, Microdispositivos biomédicos.

de la interfaz entre las dos fases disminuyendo el ancho de las
laminillas de fluido, ya sea ajustando el ancho del propio canal
microfluídico o ajustando la fracción del canal ocupada por una de
las fases (un efecto que se puede lograr ajustando la caudales
relativos de las fases o por diseño de las entradas del canal).[154]
Aprovechando las distancias de difusión cortas de los canales de
microfluidos y las condiciones suaves de los ATPS, se ha logrado
la separación/purificación de proteínas (p. ej., beta­galactosidasa
y BSA[155,156]) a través de una corriente laminar de fluidos
basados en ATPS que separan fases. Debido a la característica
hidrofóbica de algunas proteínas (p. ej., proteínas de membrana),
su purificación es un desafío y requiere solubilización con detergente
para extraerlas de las células. Al combinar sistemas bifásicos de
detergente/polímero con microfluidos, es posible separar las
proteínas de la membrana de manera más eficiente y con menos
desnaturalización.[157] Además, la purificación de fármacos
proteicos, como los anticuerpos monoclonales, se ha realizado en
dispositivos de microfluidos que incorporan ATPS. Este enfoque
tiene un potencial significativo en la industria de la biotecnología
porque se puede ampliar fácilmente ajustando el número de canales debasada
realizar la separación y porque el proceso de producción puede
monitorearse y optimizarse fácilmente.[80]
Los procesos de separación como estos también pueden
combinarse fácilmente con modalidades de purificación adicionales.
Por ejemplo, el flujo electrocinético, que es una técnica que aplica
un campo eléctrico para separar moléculas, se puede utilizar junto
con la purificación basada en partición ATPS. Dado que muchas
biomoléculas están cargadas, es más rápido transportarlas mediante
electroextracción que mediante difusión. Por lo tanto, este enfoque
puede aumentar la partición de biomoléculas, aumentando el
rendimiento y la selectividad del método.[149] Se ha demostrado
que bajo la fuerza impulsora proporcionada por un campo eléctrico
externo, la partición de las moléculas de BSA aumenta y que la
transferencia de masa ya no está gobernada por la adsorción en la
interfaz, sino más bien por la movilidad electroforética y la partición
de las moléculas de BSA. moléculas a las fases en masa.[158]
También es posible realizar separaciones de biomoléculas en
dispositivos microfluídicos según al menos dos propiedades
diferentes de las muestras, por ejemplo, partición simultánea
en afinidad en un ATPS y separación electroforética.[156]
microfluidos.

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En general, la transferencia de protocolos de procesos macroscópicos
por lotes a plataformas de microfluidos basadas en ATPS ha sido
relativamente sencilla en comparación con otras tecnologías, lo que abre
posibilidades para muchas aplicaciones novedosas. Como ocurre con la
mayoría de los diseños de microfluidos, la mayoría de los sistemas de
microfluidos que integran ATPS no exhiben turbulencias significativas, lo
que significa que forman fácilmente corrientes laminares que se mezclan
principalmente por difusión. En el caso de flujos laminares de fluidos
basados en ATPS, la difusión de biomoléculas y partículas adquiere una
cualidad selectiva basada en efectos de partición.
Generalmente se puede conseguir un flujo laminar utilizando los
métodos convencionales habituales en el campo de la microfluídica. Sin
embargo, la estabilidad de los flujos laminares de ATPS en microcanales
es fundamental para muchas de las aplicaciones anteriores. Los diseños
menos complejos suelen implicar el uso de dos canales que se encuentran
en una unión para generar corrientes laminares. Para estabilizar los flujos
laminares de ATPS en dispositivos de microfluidos, a menudo es
necesario optimizar las geometrías de los canales y las viscosidades de
los fluidos. Otra estrategia para lograr una mayor estabilidad es modificar
el diseño de entrada y salida. Un diseño trifurcado puede compensar las
diferencias entre las relaciones de flujo de las entradas y salidas para
mejorar la estabilidad de las separaciones continuas de ATPS en
microcanales.[159] El resultado de las inestabilidades en los perfiles de
flujo de los fluidos a base de ATPS es la formación de gotas, lo cual es
útil para otras aplicaciones como se describe a continuación, pero puede
ser difícil de controlar y no es deseable para separaciones continuas. Sin
embargo, tras una optimización adecuada de las propiedades de flujo, es
posible recuperar las dos fases con una contaminación cruzada mínima
de los materiales de separación de fases.[29]
3.3.2. Microfluidos de gotas
Los sistemas de microfluidos de gotas permiten la generación y
manipulación de gotas de tamaño controlado dentro de microcanales.
Este enfoque, que se logra más comúnmente con sistemas de petróleo y
agua, se ha adaptado para bioensayos, encapsulación de células
individuales o de fármacos y análisis de alto rendimiento que involucran
microgotas de ATPS.[160–164]
Como se mencionó anteriormente, la formación de gotas de
microfluidos resulta de la inestabilidad entre los dos flujos inmiscibles.
Debido a la baja tensión interfacial de la mayoría de los ATPS, ha sido
difícil controlar la formación de gotas, ya que los dos fluidos inmiscibles
tienden a formar corrientes laminares a medida que fluyen a través de la
mayoría de las geometrías de microcanales. Algunos de los primeros
ejemplos de formación controlada de gotas de ATPS se lograron
utilizando altas concentraciones de PEG y sales.[165] Estos enfoques
produjeron ATPS que mostraban tensiones interfaciales mucho más altas
que las que normalmente se encuentran en los ATPS utilizados en
aplicaciones biotecnológicas, pero permitieron que las gotas se formaran
espontáneamente debido a la inestabilidad de Rayleigh. Aunque estos
estudios representaron un primer paso en el uso de ATPS para
microfluidos de gotas, los regímenes de flujo necesarios para formar
gotas generaron distribuciones de tamaño de gotas relativamente
amplias utilizando materiales que no eran tan propicios para aplicaciones Se han utilizado microcápsulas poliméricas basadas en materiales
que involucran células y biomoléculas sensibles como otros ATPS de uso común.
Los estudios posteriores se centraron en el uso de fuerzas externas
para generar las inestabilidades necesarias para la formación de gotas por utilizó un ATPS compuesto de Pluronic F127 y dextrano para producir
ATPS de baja tensión interfacial. Algunos de los primeros ejemplos de
esto incluyeron dispositivos que incorporaban discos de flexión
piezoeléctricos y actuadores impulsados por pantallas Braille que
mejoraron el control sobre el tamaño de las gotas, así como la frecuencia
de formación de las mismas.[160,166] Shum y sus colaboradores también
demostraron el efecto del ajuste los caudales y la frecuencia del
forzamiento externo en la tensión interfacial ultrabaja del sistema PEG/
K3PO4. Después de aplicar diferentes frecuencias (de 0,1 Hz a 50 kHz),
concluyeron que la tensión interfacial podría modificarse mediante
perturbaciones externas y que la frecuencia más efectiva para promover
la formación de gotas en su sistema era ≈4,5 Hz. También observaron
que la relación de caudales de las dos fases tiene una influencia
considerable en la morfología de los chorros. A medida que aumentaba
la relación entre el caudal de fluido interno y el caudal de fluido externo,
el chorro se hacía más espeso, requiriendo una mayor deformación de
la interfaz para promover la transición de un régimen de interfaz
corrugada a un régimen de gotas.[167] Además, el mismo grupo investigó
la influencia de las fluctuaciones inducidas por la bomba de jeringa en los
flujos de microfluidos ATPS. En este trabajo consideraron el mismo
sistema utilizado anteriormente (PEG/K3PO4). El motor paso a paso
dentro de la bomba de jeringa se utilizó como fuente de perturbación del
fluido inyectado en el microdispositivo. Concluyeron que la frecuencia de
las ondas sólo depende del caudal de la fase interna y que cada
ondulación es generada por un paso móvil del motor paso a paso, que
depende de muchos parámetros, incluidos los caudales y el diámetro
interno de la jeringa. . Los autores sugirieron que manipulando el caudal
de forma controlada, es factible controlar la deformación de la interfaz.
[168]
Recientemente, Moon et al. desarrolló un sistema de microfluidos
capaz de formar gotas de ATPS de forma pasiva, es decir, sin fuerzas
externas que perturben la interfaz de ATPS (Figura 7E).
Esta estrategia se basa en la aplicación de presiones hidrostáticas débiles
a través de puntas de pipeta llenas de líquido ATPS conectadas a las
entradas, promoviendo flujos de baja velocidad hacia una unión de
enfoque de flujo. En condiciones óptimas, fue posible formar gotitas muy
uniformes con una polidispersidad inferior al 3%. Luna y cols. También
demostró que el tamaño de las gotas a lo largo del canal de microfluidos
se puede controlar modulando el equilibrio ATPS, lo que no es posible
con los sistemas tradicionales de gotas de agua en aceite o aceite en
agua. Para lograr esto, introdujeron una entrada secundaria aguas abajo
de la unión de enfoque del flujo de PEG­dextrano, mediante la cual se
inyectó una concentración diferente de solución de PEG. La inyección
de una solución de PEG más concentrada a través de la entrada
secundaria disminuyó el volumen de la gota ya que el agua abandonó la
fase dispersa (dextrano) para reducir la concentración general de PEG
en la fase continua. Para aumentar el volumen de las gotas, el agua
podría ingresar a las gotas de la fase dex tran durante el proceso de
reequilibrio después de que se infundiera una solución de PEG menos
concentrada en una segunda unión cruzada.[162]
Las aplicaciones para la formación de gotitas de ATPS de microfluidos
incluyen la generación de microcápsulas con posibles aplicaciones de
administración de fármacos y células, así como la capacidad de realizar
micropatrones celulares dentro de dispositivos de microfluidos (Figura 7F­H).
similares a los que se sabe que forman ATPS para la administración de
fármacos, la ingeniería de tejidos y el análisis bioquímico .[170,171] Se

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Micropartículas de poli(lactida­co­glicolida) (PLGA). Cuando se
emulsiona PLGA en el sistema Pluronic F127­dextrano, se forma una
partícula única debido al autoensamblaje asistido por ATPS. Estas
micropartículas exhiben características anfifílicas que favorecen la
encapsulación de moléculas tanto hidrofóbicas como hidrofílicas.
Además, las propiedades de temperatura de solución crítica más baja
de Pluronic F127 confieren a las partículas propiedades de respuesta
a la temperatura. Ambas características hacen que estas microcápsulas
de PLGA sean muy adecuadas para aplicaciones biomédicas como la
administración de fármacos.[171] Aunque este proceso no tuvo lugar
dentro de un dispositivo de microfluidos, la generación de gotas de
microfluidos podría ofrecer potencial para mejorar la uniformidad de las
gotas. Por ejemplo, al aplicar la tecnología de microfluidos ATPS, fue
posible generar microcápsulas con un control preciso sobre la
morfología, la estructura interna y el tamaño, como se demostró
utilizando los sistemas PEGDA­dextrano y PEG­dextrano.[172,173 ]
Tanto el diámetro del núcleo como el espesor de la cubierta se pueden
modular ajustando los caudales de las fases del núcleo y de la cubierta.
Al aumentar el caudal de la fase externa de PEG, no solo se puede
reducir el diámetro total de la gota y la variación de tamaño, sino
también el tiempo de exposición a los rayos UV requerido para la
reticulación de la cubierta del polímero. Por lo tanto, los sistemas de
PEG­dextrano pueden permitir la producción de una amplia variedad
de microcápsulas a base de agua que pueden ajustarse para abordar
aplicaciones específicas.[174] Frampton y cols. demostró otra
aplicación más del sistema PEG­dex tran para administrar con precisión
células y biomoléculas utilizando dispositivos dispensadores de gotas
(Figura 7H). Las células se encapsularon dentro de gotitas de dextrano
y se introdujeron en la fase de PEG. Debido a las propiedades
interfaciales y de partición del ATPS, las células se modelaron en
colonias precisas dentro de canales de microfluidos cerrados.[153]
3.4. ATPS en biología sintética
El desarrollo y las pruebas de estructuras similares a células artificiales
pueden ofrecer potencialmente conocimientos sobre la función celular
y proporcionar nuevas modalidades para controlar y manipular sistemas
biológicos.[175­177] Como tal, el diseño de células artificiales y
materiales citomiméticos está emergiendo como una Tema principal de
la biología sintética. Muchos procesos que ocurren incluso en las
células vivas más complejas están influenciados por el confinamiento
o la microcompartimentación dentro de estructuras tanto rodeadas de
membrana como libres de membrana.[178] Se han aprovechado las
propiedades de separación de fases de los ATPS para imitar algunos
de estos compartimentos intracelulares, como los orgánulos y nucléolos
similares a líquidos.[30,45,179–181] Además, se ha comenzado a
investigar cómo se pueden encapsular las proteínas dentro de los
polimerosomas de ATPS. servir como herramientas útiles para la
prestación terapéutica y para la investigación fundamental.[182]
Algunos de los primeros ejemplos de esto incluyen estudios que
investigan el efecto de la microcompartimentación en reacciones
enzimáticas. Se ha demostrado que la compartimentación enzimática
en el sistema PEG­dextrano puede modelar el comportamiento de dos
enzimas secuenciales involucradas en la biosíntesis de purinas:
adenilosuccinato liasa (ASL) y 5­aminoimidazol­4­carboxamida
ribonucleótido transforma ylasa/inosina monofosfato ciclohidrolasa
(ATIC). Estas enzimas se dividieron en la fase rica en dextrano debido
a su mayor afinidad por el más hidrófilo de los dos polímeros.
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Aunque inicialmente se planteó la hipótesis de que la compartimentación
basada en ATPS aumentaba las velocidades de reacción de estas
enzimas, en este caso, la compartimentación en un ATPS no produjo
un aumento significativo en la velocidad de reacción. Los autores
razonaron que para mejorar las tasas metabólicas sería necesario
lograr una partición más fuerte de las enzimas en una de las fases
formadoras de compartimentos, lo que podría lograrse incluyendo otras
enzimas biosintéticas de purinas para interactuar con las dos enzimas
investigadas (ASL y ATIC). ) o promoviendo concentraciones más
altas de enzimas locales.[181] En otro modelo experimental, la tasa de
escisión del ARN aumentó aproximadamente 70 veces cuando la
ribozima se dividió en la fase rica en dextrano del sistema PEG­
dextrano. En este trabajo, la catálisis de ARN se mejoró variando el
volumen de la fase rica en dextrano, proporcionando en consecuencia
un enriquecimiento de ARN de 3000 veces. Los resultados mostraron
que la catálisis de ARN aumentó al disminuir el tamaño del
compartimento, es decir, el volumen de la fase rica en dextrano­PEG.
[179] Estos estudios proporcionan algunas de las primeras pruebas de
que los ATPS pueden utilizarse para modelar la compartimentación
biológica, lo que puede tener un impacto futuro en la generación de
estructuras similares a células sintéticas.
4. Resumen y perspectivas
Los ATPS han permitido una variedad de enfoques simples y rentables
que aprovechan la baja tensión interfacial entre las fases del polímero,
los efectos de partición y el alto grado de biocompatibilidad de muchos
polímeros que forman ATPS, proporcionando a los investigadores un
valioso conjunto de herramientas para el análisis a microescala. del
crecimiento celular y muchas otras aplicaciones de la biotecnología.
En términos de micropatrones, ATPS ofrece un alto grado de control
espacial y temporal sobre el posicionamiento de las células.
Además, el micropatrón ATPS se puede realizar utilizando equipos de
laboratorio sencillos, lo que lo hace altamente transferible a nuevos
usuarios. Los ATPS también se han mostrado muy prometedores en el
campo de la ingeniería de tejidos. Esta tecnología de microimpresión
suave y sin contacto permitirá a los investigadores generar
microambientes celulares que pueden usarse para recapitular estímulos
in vivo y estudiar interacciones homotípicas y heterotípicas con mayor
detalle. La combinación de ATPS con plataformas de microfluidos
también ha dado lugar al desarrollo de muchas aplicaciones novedosas.
Los ATPS se han utilizado para separar biomoléculas y células dentro
de microcanales, lo que requiere solo pequeños volúmenes de muestras
que pueden separarse y monitorearse continuamente. Además, la
formación de gotitas de ATPS en dispositivos microfluídicos ha
permitido la encapsulación de biomoléculas y células, lo que puede ser
útil para futuras aplicaciones de administración de fármacos y células.
Además, los ATPS se han aprovechado para mejorar la detección de
múltiples biomarcadores, abordando algunas limitaciones del ELISA
estándar de oro. ATPS­ELISA es compatible con reactivos ELISA
estándar, pero ofrece la principal ventaja de prevenir reacciones
cruzadas de anticuerpos. La transferencia de esta plataforma de
biomarcadores múltiples de un laboratorio a otro o de un laboratorio a
una clínica será posible gracias a la investigación de nuevos sistemas
capaces de analizar una gama más amplia de enfermedades.
Finalmente, durante la última década, la biología sintética ha crecido
significativamente y ha utilizado ATPS para imitar estructuras celulares.
Las propiedades de partición de ATPS se han utilizado para desarrollar modelos expe
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Figura 8. Áreas de crecimiento futuro para la investigación aplicada de ATPS. Se indican las necesidades tecnológicas y las consideraciones de diseño necesarias para permitir aplicaciones
futuras. Las imágenes se reproducen bajo licencias CC0.
compartimentación de orgánulos celulares, que ha contribuido a la
comprensión de los mecanismos fisicoquímicos de los procesos
biológicos fundamentales. Aunque las tecnologías ATPS tienen un
inmenso potencial para éstas y otras aplicaciones biotecnológicas,
todavía no han sido ampliamente explotadas en la industria debido a
la comprensión incompleta de las propiedades fisicoquímicas de
algunos de estos sistemas y sus interacciones con especímenes
biológicos. Figura 8
destaca varias áreas de crecimiento futuro dentro del campo,
indicando importantes barreras tecnológicas y consideraciones de
diseño que deben abordarse antes de que sea posible aprovechar
todo el potencial de los ATPS en biotecnología.
A medida que este campo madure y más estudios llenen los vacíos
en la caracterización y el desempeño de los materiales que forman
ATPS, es probable que los ATPS vean un uso más generalizado más
allá del laboratorio.
Agradecimientos
AGT desea agradecer el apoyo del Gobierno Provincial de Nueva Escocia (Beca de Doctorado
NSGS). RA desea reconocer las becas de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud
(CGS) y la Facultad de Ingeniería de la Universidad de Dalhousie (Exxon Mobil Canada Ltd.).
KRK desea reconocer las becas de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud
(CGS), la Fundación de Investigación en Salud de Nueva Escocia (Scotia Scholar) y el
Gobierno Provincial de Nueva Escocia (NSGS). Este trabajo fue apoyado por fondos del
Programa de Cátedras de Investigación de Canadá, la Fundación Canadiense para la
Innovación (Proyecto n.° 33533) y el Consejo de Investigación en Ingeniería y Ciencias
Naturales de Canadá (RGPIN­2016­04298).
Conflicto de intereses
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
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Palabras clave
sistema acuoso de dos fases, desarrollo de ensayos, micropatrones, ingeniería de microtejidos,
separación de fases
Recibido: 30 de agosto de 2017
Revisado: 30 de octubre de 2017
Publicado en línea:
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