Ejemplo para la verificación del método de Listeria monocytogenes según la norma UNE-EN ISO

11290-2:2018 - Microbiología de la cadena alimentaria Método horizontal para la detección y el

recuento de Listeria monocytogenes y Listeria spp. Parte 2: Método de recuento
Campo de aplicación según la norma (suponemos que también es el alcance validado y se ha
seguido la norma ISO 17468):
El documento resulta aplicable para:

- productos destinados al consumo humano y a la alimentación de los animales; y

- muestras ambientales recogidas del área de producción de alimentos y de manipulación de
alimentos.

Según Anexo E (informativo)

En los estudios se utilizaron los siguientes tipos de alimentos:
Salmón ahumado en frío, categoría a la que pertenece: Productos de pescadería listos
para comer, listos para recalentar
muestras ambientales, categoría a la que pertenece: Muestras ambientales (producción de
alimentos para consumo humano o animal)
ensaladas listas para consumir categoría a la que pertenece: Fruta y productos frescos
fórmulas alimenticias infantiles en polvo categoría a la que pertenece: Fórmulas infantiles y
cereales infantiles
queso categoría a la que pertenece: Leche y productos, lácteos sometidos a tratamiento
térmico.
CATEGORÍAS ALIMENTOS

Categoría 1 Categoría 2 Categoría 3 Categoría 4 Categoría 5

Productos Lecha y Carne cruda y Productos Productos de
lácteos y leche productos productos cárnicos listos aves de corral
cruda lácteos cárnicos listos para comer, crudos y listos
sometidos a para cocinar (a listos para para cocinar
tratamiento excepción de recalentar
térmico las aves de
corral)
Categoría 6 Categoría 7 Categoría 8 Categoría 9 Categoría 10
Productos Huevos y Pescado y Productos de Fruta y
cárnicos de productos marisco crudo u pescadería productos
aves de corral derivados del listo para listos para frescos
listos para huevo cocinar (sin comer, listos
comer, listos procesar) para recalentar
para recalentar
Categoría 11 Categoría 12 Categoría 13 Categoría 14 Categoría 15
Frutas, Verdura y Fórmulas Chocolate, Alimentos de
verduras y hortalizas, infantiles y productos de múltiples
hortalizas semillas, frutos cereales panadería y componentes o
transformadas secos, fruta y infantiles pastelería, componentes de
cereales secos confitería comidas

OTRAS GATEGORÍAS

Alimentos para mascotas y Muestras ambientales Muestras de producción

alimentos para animales (producción de alimentos primaria
para consumo humano o
ambiental)
Seleccionar tipo y número de muestras sobre las que realizar la verificación
del método
Número de muestras
Alcance de validación Verificación de
Verificación de
la Total
alimentos
implementación

Gama amplia de alimentos

1 ≥5 ≥6
≥ 5 categorías

Gama limitada de alimentos

1 (Nalimentos) ≤ 4 (Nalimentos + 1) ≤ 5
categorías Nalimentos
≥ 5 alimentos
+
Gama amplia de alimentos +
1 1 muestra de cada una ≥ 6 + Notras
otras categorías (Notras)
de las Notras categorías
adicionales
(Nalimentos) ≤ 4
Gama limitada de alimentos +
(Nalimentos) + otras categorías 1 1 muestra de cada (Nalimentos + Notras + 1) ≤ 8
(Notras) una de las categorías
adicionales
Solo categorías adicionales
1 (Notras) ≤ 3 (Notras + 1) ≤ 4
(Notras)
 Alcance de la validación Alcance del Laboratorio
Método de referencia validado “gama “gama limitada de alimentos” +
limitada de alimentos y otras “muestras ambientales”
categorías”

Categorías de Cat 1 - Leche y productos, Cat 1 Leche y productos

alimentos lácteos sometidos a tratamiento lácteos sometidos a tratamiento
ensayados térmico. térmico.
durante la
Cat 2 – Productos de pescadería Cat 3 – Fruta y productos
validación
listos para comer, listos para frescos
recalentar
Otras categorías - Muestras
Cat 3 – Frutas y productos ambientales (producción de
frescos alimentos para consumo
humano o animal)
Cat 4 - fórmulas alimenticias
infantiles en polvo categoría a la
que pertenece: Fórmulas
infantiles y cereales infantiles
Otras categorías Otras categorías: Muestras
ensayadas durante la ambientales (producción de
validación alimentos para consumo humano
o animal)
Alimentos ensayados Cat 1 - Leche y productos, Verificación de la
durante la validación lácteos sometidos a tratamiento implementación
térmico. Requesón
Método cuantitativo: seleccionar
Cat 2 – Productos de pescadería cualquier alimento que pertenezca
listos para comer, listos para al alcance del laboratorio
recalentar Salmón ahumado en
Muestra que se selecciona:
frío
Cat 1 - Requesón
Cat 3 – Frutas y productos
frescos mezcla de espinacas Verificación de artículos
frescas y lechiga iceberg
Método cuantitativo:
Cat 4 - fórmulas alimenticias
1 alimento difícil de las categorías
infantiles en polvo categoría a la
alimentos
que pertenece: fórmulas
alimenticias infantiles en polvo 1 muestra difícil de las otras
categorías
Otras categorías: Muestras
ambientales (producción de Muestra que se seleccionan:
alimentos para consumo humano
o animal) - almohadillas de gasa Cat 1 – Nata
sumergidas en diluyente Cat 3 – Zumo de zanahoria
Otras categorías – agua de
procesos
Método Características del Verificación de la Verificación de
desempeño implementación alimentos

Desviación estándar de
reproducibilidad  n/a
Cuantitativo intralaboratorio (sIR)

Sesgo estimado (eBias) n/a 

Diseño experimental para la determinación de la desviación estándar de
reproducibilidad intralaboratorio
- Verificación de la implementación
- Tipo de muestra: leche cruda de vaca de
diferentes orígenes. Si fuera leche cruda, se
podrían considerar muestras de leche de
diferentes especies animal
- Número de muestras que se requieren: al
menos 10 de diferentes procedencias y con
diferentes niveles de contaminación
(representativos del rango de contaminación
natural)
- Cada muestra se separa en dos porciones
que se analizar en condiciones diferentes
- Condición A: técnico 1, día 1, medio de
cultivo 1, incubador 1
- Condición B: técnico 2, día 1, medio de
cultivo 2, incubador 1
- Si el nivel esperado de contaminación es
menor de 10 ufc/g, se contaminan
artificialmente

Ejemplo de resultados obtenidos:

Valor esperado
Diferencia
Número de de Resultado Resultad Log10 Log10 Diferencia
cuadrática
muestra contaminación A oB Resultado A Resultado B (yiA-yiB)
(yiA-yiB)2
(cfu / g) (cfu / g) (cfu / g) (cfu / g) (cfu / g)
1 30 < 40 (10) < 40 (30) #¡VALOR! #¡VALOR! ---- ---
2 300 110 182 2,041 2,260 0,2187 0,0478
3 300 410 620 2,613 2,792 0,1796 0,0323
4 600 640 330 2,806 2,519 0,2877 0,0828
5 600 690 570 2,839 2,756 0,0830 0,0069
6 600 780 640 2,892 2,806 0,0859 0,0074
7 600 620 1300 2,792 3,114 0,3216 0,1034
8 600 870 1500 2,940 3,176 0,2366 0,0560
9 6000 8600 6400 3,934 3,806 0,1283 0,0165
10 6000 16000 5000 4,204 3,699 0,5051 0,2552
11 6000 > 15000 13400 #¡VALOR! 4,127 #¡VALOR! #¡VALOR!
12 30000 20000 32000 4,301 4,505 0,2041 0,0417
sIR 0,180245115

Valores de sR obtenidos en el estudio de validación

Valores de sR obtenidos del estudio de validación
Nivel bajo de Nivel intermedio Nivel alto de Valores medios
de tres niveles de
 Valores de sR obtenidos del estudio de validación
inoculación de inoculación inoculación
inoculación
(110 -200) cfu/g (600 – 1800) cfu/g (6800 – 26000) cfu/g
Salmón ahumado
en frío 0,18 0,19 0,19 0,19

Almohadillas de
gasa sumergidas 0,19 0,19 0,13 0,17
en diluyente
Mezcla de
espinacas
frescas y lechiga 0,13 0,09 0,11 0,11
iceberg
Fórmulas
alimenticias
infantiles en 0,25 0,10 0,07 0,14
polvo
Queso (requesón
o queso artificial) 0,11 0,17 0,10 0,13

Valor mínimo 0,11

Límite de aceptabilidad:
- Si en el estudio de validación se ha determinado un único valor de desviación típica
de reproducibilidad (sR) para todos los tipos de alimentos, y en todo el intervalo de
medida, la desviación típica de reproducibilidad intralaboratorio (sIR) del método
verificado deberá ser ≤ 2 x desviación estándar de reproducibilidad (sR)
interlaboratorios.
- Si en el estudio de validación se han determinado valores diferentes de desviación
típica de reproducibilidad en función de los alimentos y de los niveles dentro de un
intervalo, la desviación típica de reproducibilidad intralaboratorio (sIR) del método
verificado deberá ser ≤ 2 x el valor medio más bajo de la desviación típica de la
reproducibilidad interlaboratorios (sR) de los alimentos utilizados en el estudio
de validación.

Resultado obtenido Valor límite Evaluación

0,18 2*0,11 = 0,22 CUMPLE

Diseño experimental para la desviación estimada (eBias)
Muestras seleccionadas:
Nata cruda: Muestra 1 nata pasterizada Pascual
Muestra 2 nata pasterizada artesanal
Muestra 3 nata pasterizada CLA
Zumo de zanahoria: Muestra 1 zumo de zanahoria fresco origen 1
Muestra 2 zumo de zanahoria fresco origen 2
Muestra 3 zumo de zanahoria fresco origen 1
Agua de proceso: Muestra 1 agua de proceso origen 1
Muestra 2 agua de proceso origen 1
Muestra 3 agua de proceso origen 1

Preparar 3 niveles de contaminación.

Límite de aceptabilidad: la diferencia absoluta entre los resultados del alimento contaminado
artificialmente en log10 ufc/Proción para análisis y la supensión de inóculo sea igual o inferior a 0,5
log10
 Resultados para la comparación
Resultad
Resultado Resultado
o
medio alimento Resultado eBias (diferencia
(log10
(log10 ufc/g o contaminado suspensión de absoluta)
ufc/g o
ml) artificialmente inóculo
ml)
(log10 porción para (log10 ufc/g o ml)
análisis)
Muestra 1
nata Pascual 1,87
porción 1
2,06 3,06 3,17 0,11
Muestra 1
nata Pascual 2,25
porción 2
Muestra 2
nata
3,16
artesanal
porción 1
3,11 4,11 4,05 0,06
Muestra 2
nata
3,06
artesanal
porción 2
Muestra 3
nata CLA 3,93
porción 1
3,99 4,99 5,29 0,3
Muestra 3
nata CLA 4,04
porción 2
Porción de análisis 10 g
 Resultados para la comparación
Resultad
Resultado Resultado
o
medio alimento Resultado eBias (diferencia
(log10
(log10 ufc/g o contaminado suspensión de absoluta)
ufc/g o
ml) artificialmente inóculo
ml)
(log10 porción para (log10 ufc/g o ml)
análisis)
Muestra 1
zumo de
zanahoria
1,87
fresco origen
1
porción 1
2,06 3,06 3,17 0,11
Muestra 1
zumo de
zanahoria
2,25
fresco origen
1
porción 2
Muestra 2
zumo de
zanahoria
3,16
fresco origen
2
porción 1
3,11 4,11 4,05 0,06
Muestra 2
zumo de
zanahoria
3,06
fresco origen
2
porción 2
Muestra 3
zumo de
zanahoria
3,93
fresco origen
3
porción 1
3,99 4,99 5,29 0,3
Muestra 3
zumo de
zanahoria
4,04
fresco origen
3
porción 2
Porción de análisis 10 g
 Resultados para la comparación
Resultad
Resultado Resultado
o
medio alimento Resultado eBias (diferencia
(log10
(log10 ufc/g o contaminado suspensión de absoluta)
ufc/g o
ml) artificialmente inóculo
ml)
(log10 porción para (log10 ufc/g o ml)
análisis)
Muestra 1
agua de
proceso 1,87
origen 1
porción 1
2,06 3,06 3,17 0,11
Muestra 1
agua de
proceso 2,25
origen 1
porción 2
Muestra 2
agua de
proceso 3,16
origen 2
porción 1
3,11 4,11 4,05 0,06
Muestra 2
agua de
proceso 3,06
origen 2
porción 2
Muestra 3
agua de
proceso 3,93
origen 3
porción 1
3,99 4,99 5,29 0,3
Muestra 3
agua de
proceso 4,04
origen 3
porción 2

Resultado obtenido Valor límite Evaluación

Nata CLA 0,3 0,50 CUMPLE

Zumo de zanahoria fresco 0,50 CUMPLE

origen 3

Muestra de agua de 0,50 CUMPLE

proceso origen 3