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LOS LABORATORIOS DE
ALIMENTOS
MP-DAMR-LMI/R01
DIRECTORIO UJAT
DR. JOSÉ MANUEL PIÑA GUTIERREZ
Rector
DIRECTORIO DAMR
M.T.E. SANDRA AGUILAR HERNÁNDEZ
Directora
PRESENTACIÓN.......................................................................................................................1
OBJETIVO.................................................................................................................................3
NORMAS DE SEGURIDAD E HIGIENE EN EL LABORATORIO.............................................4
MEDIDAS EN CASO DE ACCIDENTE......................................................................................7
PRACTICA 1. PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MATERIALES Y MEDIOS DE
CULTIVOS.................................................................................................................................9
PRÁCTICA 2. PREPARACIÓN, FIJACIÓN Y COLORACIÓN SIMPLE DE FROTIS..............16
PRACTICA 3. MÉTODO PARA LA CUENTA DE MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS
................................................................................................................................................................ 20
PRACTICA 4. RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES.................................25
PRACTICA 5. EFECTO DEL PH Y LA TEMPERATURA EN EL CRECIMIENTO
MICROBIANO..........................................................................................................................31
PRÁCTICA 6. TÉCNICAS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS Y LEVADURAS
................................................................................................................................................................ 34
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PRESENTACIÓN
MICROBIOLOG
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OBJETIVO
Estimado usuario, te recomendamos que antes de iniciar con tus actividades dentro
de los laboratorios y talleres conozcas el “Lineamiento Interno para el Uso y
Mantenimiento de los Laboratorios y Talleres del Programa Educativo de Ingeniería
en Alimentos” el cuál te guiará sobre las actitudes, responsabilidades y
procedimientos que deberás seguir antes, durante y al finalizar tus actividades en el
laboratorio. De igual forma te sugerimos tomes en cuenta las precauciones o
medidas generales que te presentamos a continuación con objeto de que adquieras
una actitud de prudencia frente a riesgos que puedan presentarse en el laboratorio:
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zona afectada con agua en abundancia por lo menos durante 15 minutos, quitando al
mismo tiempo la ropa y el calzado contaminado. Antes de volver a utilizar la ropa se
recomienda lavarla. En caso de contacto con los ojos, lavar inmediatamente con
abundante agua por lo menos durante 15 minutos.
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INTRODUCCIÓN
Los microorganismos son susceptibles a los cambios de condiciones ambientales y
en la medida en que se han podido adaptar a estos cambios, se han distribuido en
una gran diversidad de hábitats incluyendo los de condiciones extremas sobre todo
de tipo físico- químico.
OBJETIVO
Que el alumno conozca los principios generales de las técnicas de
esterilización de los materiales y medios de cultivos.
PROCEDIMIENTO
Preparación del material de vidrio y medios de cultivos:
1. Lavar perfectamente las cajas de Petri y pipetas con escobillón y detergente.
Enjaguar con abundante agua corriente.
2. Escurrir el exceso de agua y enjaguar con agua destilada con una piseta por las
paredes interiores. Dejar escurrir el material sobre una toalla.
3. Una vez seco el material, se procederá a envolver las cajas de Petri y pipetas con
papel de estraza. Para los tubos y matraces se elaborarán tapones de algodón y
gasa, procurando que ajusten con holgura, sobre los que finalmente se les
colocará un capuchón de papel.
4.Preparar 20 mL de caldo nutritivo (CN) en un matraz Erlenmeyer de 250 mL y
ajustar el pH a 6.5-7.0 en un potenciómetro, agregando con una pipeta Pasteur
poco a poco solución de HCI 0.1 M o solución de NaOH 0.1 M, en caso de que el
pH sea más alcalino o ácido respectivamente. Vaciar 5 mL en cuatro tubos de
cultivo con tapón de baquelita que deberán cerrar sin llegar al tope.
5. Preparar 120 mL de agar nutritivo (AN), calentar la mezcla en una parrilla con
agitación constante hasta ebullición, durante 1 minuto (cuidar que no se
proyecte) y vaciar enseguida 5 mL de medio en tres tubos con tapón de rosca.
Enjuagar inmediatamente la pipeta para evitar que se solidifique el agar. El resto
se esteriliza en la autoclave.
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3. Cerca del mechero, etiquetar 3 cajas con AN, 3 cajas con PDA y 3 con MM. Los
medios de cultivo se vacían en las cajas de Petri (aproximadamente 25-30 mL)
en zona aséptica cerca del mechero o en campana de flujo laminar.
4. Dejar que solidifiquen los medios (por lo menos 30 minutos) y posteriormente
envolver las cajas cuidadosamente con papel estraza o acomodarlas en forma
invertida en bolsa de plástico limpias.
5. Guardarlas en refrigeración hasta 24 horas antes de utilizarlas.
RESULTADOS
A. Hacer la descripción morfológica de las colonias obtenidas en las cajas con
diferentes medios de cultivo (AN, PDA y MM) y con los distintos tratamientos en
relación a la caja control.
B. Reportar el crecimiento en forma cualitativa: (-) no hay crecimiento, (+) poco
crecimiento, (++) crecimiento regular y (+++) crecimiento abundante.
MEDIO DE CULTIVO
AGAR NUTRITIVO
MINIMO DE SALES
PAPA DEXTROSA
AGAR
CUESTIONARIO
1. ¿Cuáles son los métodos de esterilización más utilizados en Microbiología? ¿En
qué tipo de materiales se aplica cada uno?
2. Explique cuáles son las diferencias entre los procesos de esterilización,
desinfección y asepsia. ¿Cómo se relacionan estos procedimientos con la
pasteurización?
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INTRODUCCIÓN
Debido al pequeño tamaño de la mayoría de los microorganismos, se requiere de un
microscopio óptico, ya sea de campo claro o de campo oscuro para hacer la
descripción morfológica de éstos. El microscopio de uso más común es el de campo
claro, en el que la observación de células vivas es limitada debido a que las células
son incoloras y permiten el paso de una gran cantidad de luz.
Los frotis de cultivos líquidos se deberán fijar con alcohol para evitar residuos del
medio, que al quemarse darán interferencias en las observaciones y los de colonias
de medios sólidos se fijan generalmente con calor. Después de la fijación, los frotis
son teñidos con diferentes colorantes sintéticos derivados de anilina. Los colorantes
más utilizados son sales formadas por iones coloridos cargados conocidos como
cromóforos. Por ejemplo: Cloruro de Azul de metileno → Azul de metileno* + Cl
(cromóforo).
OBJETIVOS
Que el alumno aprenda las técnicas de preparación de frotis, de fijación y
coloración más utilizadas en el estudio microscópico de cultivos bacterianos,
obtenidos de medios sólidos y líquidos. Que identifique las principales formas
bacterianas y la importancia de las tinciones simples en la caracterización
morfológica de estos microorganismos.
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PROCEDIMIENTO
El profesor proporcionará a los alumnos cultivos líquidos y sólidos de: Escherichla
coli, Streptococcus sp., Staphylococcus sp., Badllus subtilis, Klebsi'ella sp. y
Pseudomonas fluorescens. El estudiante preparará frotis de cada cepa obtenida de
cultivo sólido y otros de cultivo líquido, los cuales fijará y teñirá con azul de metileno.
El profesor explicará los principios de manejo del microscopio y la forma de ajustar la
iluminación.
Preparación de frotis:
1. Lavar perfectamente los portaobjetos, secarlos con papel y etiquetarlos (Figura 1).
2. Prender el mechero y esterilizar el asa en la flama del mechero hasta que se
ponga al rojo vivo.
3. Dejar enfriar el asa para evitar que al tomar la muestra los microorganismos sean
destruidos. Después acercar al mechero el tubo de cultivo, quitarle el tapón y
flamear rápidamente la boca del mismo. Introducir el asa en el tubo de cultivo y
tomar cuidadosamente la muestra.
Tinción simple:
1. Cubrir el frotis con 2 gotas de azul de metileno durante 30 segundos a 1 minuto.
2. Eliminar el exceso de colorante con lavado suave al agua corriente o con la ayuda
de la piceta con agua destilada.
3. Dejar secar el aire.
Observación al microscopio:
1. Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda.
2. Ajustar el haz de luz en el centro del campo de observación, siguiendo las
indicaciones del profesor.
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RESULTADOS
1. Reportar las observaciones de forma, agrupación y tamaño relativo de cada uno
de los microorganismos en el cuadro de resultados.
2. Comparar sus observaciones con las reportadas en la literatura.
INTRODUCCIÓN
Los mohos y levaduras están ampliamente distribuidos en la naturaleza y se pueden
encontrar formando parte de la flora normal de un alimento, o como agentes
contaminantes y en los equipos sanitizados inadecuadamente, provocando el
deterioro fisicoquímico de éstos, debido a la utilización en su metabolismo de los
carbohidratos, ácidos orgánicos, proteínas y lípidos originando mal olor, alterando el
sabor y el color en la superficie de los productos contaminados. Además los mohos y
levaduras pueden sintetizar metabolitos tóxicos termoresistentes, capaces de
soportar algunas sustancias químicas, así como la irradiación y presentan capacidad
para alterar sustratos desfavorables, permitiendo el crecimiento de bacterias
patógenas.
Es de gran importancia cuantificar los mohos y levaduras en los alimentos, puesto
que al establecer la cuenta de estos microorganismos, permite su utilización como un
indicador de prácticas sanitarias inadecuadas durante la producción y el
almacenamiento de los productos, así como el uso de materia prima inadecuada.
OBJETIVO
Determinar el número de mohos y levaduras viables presentes en productos
destinados al consumo humano por medio de la cuenta en placa a 25 ± 1°C.
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IMPORTANTE:
Todo el material e instrumentos que tengan contacto con las muestras bajo estudio,
deben esterilizarse mediante horno, durante 2 h de 170 a 175°C o por 1h a 180°C o
autoclave, durante 15 minutos como mínimo a 121 ± 1,0°C.
PROCEDIMIENTO
Preparación de soluciones:
a) Solución fosfato de potasio.
Preparación de la muestra:
La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en la NOM-110-
SSA1-1994. Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis
Microbiológico.
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RESULTADOS
Considerar las cuentas de placas con 10 a 150 colonias como las adecuadas para el
informe. Multiplicar por el inverso de la dilución, tomando en consideración los
criterios de la NOM-092-SSA1-1994. Método para la Cuenta de Bacterias Aerobias
en Placa, para la expresión de resultados.
Informe de la prueba:
Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o ml) de mohos en
agar papa - dextrosa acidificado, incubadas a 25 ± 1°C durante 5 días.
Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o ml) de levaduras en
agar papa-dextrosa acidificado, incubadas a 25 ± 1°C durante 5 días.
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INTRODUCCIÓN
El grupo coliforme abarca aquellos géneros de bacterias Gram negativas, oxidasa
negativa, catalasa positiva, que fermentan la lactosa con producción de ácido y gas.
Incluye los géneros Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella y Escherichia, los tres
primeros son denominados coliformes totales, debido a que fermentan la lactosa con
producción de ácido y gas a 35 °C. El género Escherichia es capaz de fermentar la
lactosa con formación de ácido y gas a 44.5 °C, razón por la que se denomina
coliforme fecal. Pero, algunos géneros, incluidos Enterobacter y Klebsiella, pueden
dar falsos positivos en esta prueba, por esa razón, en la actualidad se tiende a
identificar directamente la presencia de Escherichia coli, el indicador prototípico de
contaminación fecal.
IMPORTANTE:
Los reactivos que se mencionan, deben ser grado analítico y cuando se indique agua
debe entenderse como agua destilada.
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Todo el material e instrumentos que tengan contacto con las muestras bajo estudio
debe esterilizarse mediante: horno, durante 2 h a 170 - 175°C, o 1 h a 180°C; o en
autoclave, durante 15 minutos como mínimo a 121 ± 1.0°C.
El material de vidrio puede sustituirse por material desechable que cumpla con las
especificaciones deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por las
esterilizaciones repetidas y éste debe ser químicamente inerte.
PROCEDIMIENTO
Preparación de soluciones diluyentes:
a) Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada).
Disolver 34 g de fosfato monopotásico en 500 mL de agua y ajustar el pH a
7.2 con solución de hidróxido de sodio 1 N. Llevar con agua destilada a un
litro.
Esterilizar a 121± 1.0°C durante 15 minutos. Conservar en refrigeración
(solución concentrada).
Tomar 1.25 mL de la solución concentrada y llevar a un litro con agua
(solución de trabajo).
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se requiera.
Esterilizar durante 15 minutos a 121± 1.0°C.
Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de
trabajo deben ser iguales a los iniciales.
b) Agua peptonada.
Disolver 1 g de peptona y 8.5 g NaCl en un litro de agua destilada.
Ajustar el pH a 7 con hidróxido de sodio 1 N.
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL o en cualquier volumen múltiplo de
nueve según se requiera.
Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1.0°C.
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RESULTADOS
a) Placas que contienen entre 15 y 150 colonias características: separar las
placas que contienen el número antes mencionado de colonias características
en dos diluciones consecutivas. Contar las colonias presentes. Calcular el
número de coliformes por mililitro o por gramo de producto, multiplicando el
número de colonias por el inverso de la dilución correspondiente, tomando los
criterios de la NOM-092-SSA1-1994. Método para la Cuenta de Bacterias
Aerobias en Placa.
b) Placas que contienen menos de 15 colonias características: si cada una de las
placas tiene menos de 15 colonias características, reportar el número obtenido
seguido de la dilución correspondiente.
Informe de la prueba:
UFC/g o mL en placa de agar rojo violeta bilis, incubados a 35°C durante 24 ± 2 h.
En caso de emplear diluciones y no observar crecimiento, informar utilizando como
referencia la dilución más baja utilizada, por ejemplo dilución 10-1.
En caso de no observar crecimiento en la muestra sin diluir se informa: "no desarrollo
de coliformes por mL".
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INTRODUCCIÓN
Los microorganismos están continuamente afectados por su ambiente, ya que éste
ejerce una influencia profunda en su desarrollo al igual que sobre las demás formas
de vida. Los factores del medio se pueden clasificar en tres grupos:
OBJETIVO
Que el estudiante conozca el efecto del pH y la temperatura como parámetros
de control del crecimiento microbiano. Que el alumno comprenda la
importancia de estos factores fisicoquímicos en la selección de poblaciones
PROCEDIMIENTO
El profesor proporcionará cultivos líquidos, una suspensión de esporas de Aspergillus
nigery, Penicillium roqueforti. Cada uno de los tubos y cajas deberán etiquetarse con
el nombre del microorganismo que se inoculará.
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Efecto de la Temperatura:
1. En tres cajas de Petri con PDA divididas en dos secciones, inocular 0.1 mL. de la
suspensión de esporas de hongos en cada sección.
2. Incubar una caja de Petri a 15°C, otra a 30°C y la última a 45°C en forma
invertida durante 72 horas y hacer las observaciones macroscópicas.
3. Incubar nuevamente las cajas y realizar observaciones en microscopio
estereoscópico después de una semana.
4. En seis tubos de caldo microinoculación ajustado a pH 7.0, inocular dos con cada
una de las cepas bacterianas.
5. Incubar dos tubos en estufa a 15°C, otros dos a 30°C y los dos últimos a 45°C
durante 24-48 horas. Medir la D.O.
RESULTADOS
A. Reportar los resultados en los cuadros 8, 9 y 10 de acuerdo al siguiente
convenio: no hay crecimiento (-), crece un poco (+), mayor crecimiento (++),
crecimiento abundante (++).
B. Comparar sus resultados con los reportados en la bibliografía de cada una de las
cepas.
INTRODUCCIÓN
El cultivo de microorganismos es una actividad que requiere del conocimiento de
técnicas de siembra o inoculación y de aislamiento para transferirlos de un medio a
otro, o mantener su crecimiento y actividad. Es indispensable para realizar diversos
estudios morfológicos, de identificación, bioquímicos, de patogenicidad y ecológicos,
entre otros.
MICROBIOLOG
técnica de estría cruzada para producir colonias aisladas en cultivos sólidos y así,
obtener un cultivo puro o axénico, también conocido como cepa, que contiene un
solo tipo de microorganismo con la misma composición genética. Cuando la técnica
por estría se aplica para aislar un microorganismo de interés a partir de mezclas
donde se encuentra en pequeñas cantidades, generalmente se obtendrán las
bacterias dominantes. En este caso, se utilizan medios selectivos o de
enriquecimiento, los que contienen nutrientes especiales, antibióticos, altas
concentraciones de sales y/o condiciones de pH, luz o temperatura que
incrementarán la población del microorganismo de interés y se facilitará su
aislamiento.
OBJETIVOS
Que el alumno aplique diferentes técnicas de siembra y aislamiento de cultivos
de bacterias y levaduras en medios sólidos.
Comprobar la utilidad que tienen los medios de cultivos de uso general,
diferenciales y selectivos.
MATERIALES
4 cajas Petri con agar nutritivo (AN)
4 cajas Petri con agar eosina azul de metileno (EMB)
4 cajas Petri con agar papa dextrosa (PDA)
4 tubos con caldo nutritivo (CN)
4 tubos inclinados con AN
4 tubos inclinados con PDA
2 mecheros Fischer
2 asas de inoculación
1 piceta con agua destilada
1 incubadora a 30°C
1 refrigerador
2 pares de guantes de asbesto, escobillones, fibra, detergente y toallas de papel
estraza, algodón y gasa
1 autoclave con base, canastilla y válvula
2 balanzas analíticas
PROCEDIMIENTO
El profesor proporcionará cultivos puros (cepas) de bacterias Gram (+): Bacillus sp.,
Micrococcus sp., Gram (-): Escherichia coli y un cultivo de la levadura
Saccharomyces cerevisiae, así como una muestra problema (con al menos dos
microorganismos diferentes). Cada equipo de trabajo inoculará E. coli, una bacteria
Gram +, la levadura y un cultivo problema en una caja de cada medio.
Técnica de estría cruzada:
1. Dividir cada una de las cajas Petri por la parte de atrás en cuatro cuadrantes.
Esterilizar el asa con calor en el mechero.
2. Dejar enfriar el asa y tomar la muestra de una colonia.
3. Inocular la muestra haciendo 4 o 5 estrías simples muy juntas de lado a lado
sobre el primer cuadrante de la caja, cerrar la caja. Flamear el asa de inoculación
y hacer girar la caja Petri un cuarto de vuelta.
4. Abrir nuevamente la caja y con el asa de siembra esterilizada y fría, tocar la
superficie del de estrías recién hechas en un punto alejado del inicio. Hacer un
segundo grupo de estrías como en el caso anterior. Realizar el mismo
procedimiento en el tercer cuadrante y en el último cuadrante, sin flamear el asa
de siembra hará una estría más abierta (simple).
5. Las cajas con la base hacia arriba se incuban a 35°C durante 24-48 horas.
RESULTADOS
a) Reportar en el Cuadro 2, sus resultados de siembra de las cepas en cada medio
de cultivo.
b) Describir la morfología colonial representativa de cada cultivo microbiano de
acuerdo con los criterios indicados en los cuadros 3 a 6.
c) Verificar el tipo de microorganismos que corresponden a la muestra problema, en
comparación con los cultivos puros. Cuadro 2. Resultados de crecimiento (C) y
aislamiento (A) de cepas en medios de cultivo. (-) no hay crecimiento o no se
aisló; (+) hay crecimiento, sí se aisló.
AN
PDA
EMB