Mónica Marrero Almeida

Máster en Biología Molecular

Semana 23 - 26

Módulo 3: La célula

ACTIVIDAD/CASO PRÁCTICO

La ATCC o American Type Culture Collection (https://www.atcc.org) es una

organización sin fines de lucro que recolecta, almacena y distribuye
microorganismos de referencia estándar, líneas celulares y otros materiales
para investigación y desarrollo.
En todo laboratorio de biología celular es esencial asegurar la calidad y
origen de las líneas celulares con las que trabajemos.
La actividad de este módulo consistirá en que accedáis al catálogo de
ATCC, y seleccionéis una línea celular con la que desearíais trabajar en el
futuro.
Debéis describir las características principales de la línea celular, y explicar
las condiciones óptimas de cultivo para ese tipo celular concreto.
Explicad el tipo de microscopio que utilizaríais para realizar el seguimiento
de la línea en cultivo.
INTRODUCCIÓN

Las células epiteliales de la mama, proceden de la glándula mamaria que es

un órgano que contienen todos los mamíferos, que su principal función es
sintetizar, secretar y proporcionar leche al recién nacido según su demanda
para garantizar su nutrición, protección y desarrollo óptimo. (Medina, 1996).

Su forma de secreción es de forma exocrina, ya que su producto (leche) se

vierte al exterior a través de conductos.

La mayoría de las células de la glándula mamaria provienen de una, la cual

se denomina como célula madre mamaria (CMM). Luego se diferencia, dando
como resultado con la mama en reposo de tejido epitelial ductal integrado en
un estroma fibroso. La pared de cada conducto está revestida por dos capas de
células epiteliales: una capa interior que encapsula el lumen ductal y que
contiene células epiteliales cuboidales, algunas de las cuales tienen el
potencial de diferenciarse aún más en células secretoras de leche (lactocitos)
durante la lactancia; y una capa exterior/basal de células mioepiteliales
contráctiles que rodean firmemente la capa luminal y tienen propiedades de
células de músculo liso. La capa basal se encuentra sobre la membrana basal,
y se cree que contiene poblaciones de CMM bipotenciales (Visvader, 2009).

Figura 1: C-F: Inmunofluorescencia de tejido mamario humano en etapa de lactancia.

C: Células mioepiteliales alveolares en verde mediante tinción de actina de músculo liso. D:
Lactocitos alveolares en verde mediante tinción de alfa-lactoalbúmina. E:
Células madre mamarias identificadas por tinción de citoqueratina 5 (verde) en la capa basal de
un grupo de alvéolos.
F: Células alveolares luminales polarizadas teñidas para EpCAM (verde).Los núcleos se
muestran en azul (tinción DAPI). La actina se muestra en rojo (tinción por faloidina).
Barras de escala: 20 lm. Fuente: Hassiotou F, Geddes D. (2013).
 Tiene 2 fases de desarrollo tanto en la estructura como en la función:

 Fase ductal: El brote epitelial mamario invade el estroma graso

entre la pubertad (mayor desarrollo) y el parto, sufriendo ramificaciones
repetidas.
 Fase secretora: Es la consecuencia del embarazo. Se caracteriza
por el relleno del estroma interductal.

Normalmente hay 2 glándulas mamarias una en cada mama. La presencia

de más de 2 pezones es politelia y más de 2 glándulas mamarias es polimastia.

Las patologías que afectan a las mamas pueden ser benignas y malignas.
La principal benigna es la mastitis (inflamación de la glándula mamaria por
obstrucción de los conductos) y el cáncer benigno es lipoma (grasa).
Y las patologías malignas por excelencia son los canceres los más frecuentes
son adenocarcinoma (lobulillar y ductal). Y otros son linfoma y angiosarcoma.

En mamíferos a la mama se le suele llamar ubre. Se encuentran a largo de

la línea lactífera en ambos sexos. En general, la mayoría de las glándulas son
pares a lo largo de esta línea, difiere según el número de crías que suele tener
cada especie. El número de pezones varía desde 2 (primates) a 16 (cerdos).

Los mamíferos macho habitualmente poseen glándulas y pezones

rudimentarios, con unas cuantas excepciones: los ratones no tienen pezones,
los caballos no tienen ni glándulas ni pezones y el murciélago de la fruta Dyak
tiene glándulas lactantes.

A. B.

Figura 2: Patologías de la glándula mamaria. A. Patología benigna: mastitis y B. Estadios de los

cánceres de mama. Fuente: A. Barranquero Gómez y Ferrando (2024) y B. Thafreitas (2013).
 La muestra escogida son células epiteliales mamarias normales, no
tumorigénica (MCF-12F, CRL-3599) aisladas de una donante blanca de 60
años, aneuploide y con sangre B+, adquirida mediante una mamoplastia de
reducción con enfermedad fibroquística de la mama con áreas de hiperplasia
intraductal.

La línea se produjo mediante cultivo a largo plazo en medio libre de suero

con baja concentración de Ca++. Y para transportarlo se congela en vapor de
nitrógeno líquido. La muestra viene libre de contaminación por micoplasmas.

Cuando se realiza la entrega del producto se debe desembalar y almacenar

de la siguiente forma:

1. Revisar todos los contenedores en busca de fugas o roturas.

2. Retirar las células congeladas del embalaje de hielo seco y colóquelas

inmediatamente a una temperatura inferior a -130 °C, preferiblemente en vapor
de nitrógeno líquido, hasta que estén listas para su uso.

El medio base que se suele utilizar para este tipo de células es el medio
Eagle modificado por Dulbecco y base Ham’s F12 con agua ultrapura. Se
revuelve para disolver y homogeneizar. Se ajusta el pH a 7.1 – 7.3. Se
esteriliza por filtración mediante un filtro de 0.22 µm. Se puede completar con
un medio de crecimiento completo con el medio base más el factor de
crecimiento epidérmico. Se debe incubar a 37ºC y con una atmósfera de 95%
aire y 5% CO2.

Para la manipulación de la línea celular MCF-12F y asegurar su nivel de

viabilidad, hay que descongelar el vial e iniciar el cultivo lo antes posible al
recibirlo. Si a su llegada es necesario seguir almacenando el cultivo congelado,
debe almacenarse en fase de vapor de nitrógeno líquido y no a -70°C. El
almacenamiento a -70°C provocará la pérdida de viabilidad. Para ello hay que
seguir los siguientes pasos:

1. Descongelar el vial agitándolo suavemente en un baño de agua a 37°C.

Para reducir la posibilidad de contaminación, mantenga la junta tórica y la tapa
fuera del agua. La descongelación debe ser rápida (aproximadamente 2
minutos).

2. Retirar el vial del baño de agua tan pronto como se descongele el

contenido y descontamine sumergiéndolo o rociándolo con etanol al 70%.
Todas las operaciones a partir de este momento deben realizarse bajo estrictas
condiciones de asepsia.
 3. Se recomienda retirar inmediatamente el agente crioprotector. Centrifugar
la suspensión celular. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento
celular en una cantidad adecuada de medio de crecimiento fresco.

4. Transferir las células a un recipiente de tamaño adecuado. Es importante

evitar una alcalinidad excesiva del medio durante la recuperación de las
células. Se sugiere que, antes de agregar el contenido del vial, el recipiente de
cultivo que contiene el medio de crecimiento se coloque en la incubadora
durante al menos 15 minutos para permitir que el medio alcance su pH normal
(7,0 a 7,6).

5. Incubar el cultivo a 37°C en una incubadora adecuada. Se

recomienda una atmósfera de aire con un 5% de CO 2 si se utiliza el medio
anteriormente descrito.

Para realizar un subcultivo se utilizan los siguientes pasos:

1. Retirar y desechar el medio de cultivo anterior.

2. Enjuagar brevemente la capa de células con solución de tripsina al 0.25%

(p/v)-EDTA 0,53 mM para eliminar todos los rastros de suero que contiene
inhibidor de tripsina.

3. Agregar la solución de tripsina-EDTA al matraz y observe las células bajo

un microscopio invertido (se usa para la observación de cultivos celulares tanto
en suspensión como adherentes y se denominan invertidos porque en ellos el
cuerpo, el ocular y el objetivo están localizados debajo de la platina, mientras
que el especimen es iluminado desde arriba) hasta que la capa de células se
disperse (generalmente dentro de 5 a 15 minutos).

Importante: Para evitar la formación de grumos, no agitar las células

golpeando o agitando el matraz mientras espera que las células se
desprendan. Las células que sean difíciles de desprender se pueden colocar a
37°C para facilitar su dispersión.

4. Agregue de 6,0 a 8,0 ml de medio de crecimiento completo y aspirar las

células pipeteando suavemente.

5. Para eliminar la solución de tripsina-EDTA, transferir la suspensión celular

al tubo de centrífuga. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en
medio de crecimiento fresco. Agregar las alícuotas apropiadas de suspensión
celular a nuevos recipientes de cultivo.

6. Incubar los cultivos a 37°C. Dura alrededor de 20 horas para que crezca
la población y poder usarla para el ensayo que estemos haciendo en ese
momento.
 Normalmente la proporción de subcultivos que se recomienda es 1:2. Y su
renovación cada 2 o 3 días.

Para preservar la muestra celular se debe hacer en un medio de crecimiento

completo suplementado con 5% (v/v) de DMSO.

Los volúmenes utilizados en este protocolo son para matraces de 75 cm 2;

Reducir o aumentar proporcionalmente la cantidad de medio de disociación
para recipientes de cultivo de otros tamaños.

BIBLIOGRAFÍA
Colaboradores de Wikipedia. (2023, 29 septiembre). Glándula mamaria. Wikipedia, la

Enciclopedia Libre. https://es.wikipedia.org/wiki/Gl%C3%A1ndula_mamaria

Hassiotou F, Geddes D. Anatomy of the human mammary gland: Current status of

knowledge. Clin Anat. 2013 Jan;26(1):29-48. doi: 10.1002/ca.22165. Epub 2012 Sep
19. PMID: 22997014.

MCF-12F - CRL-3599 | ATCC. (s. f.). https://www.atcc.org/products/crl-3599

Medina D. 1996 . La glándula mamaria: Un órgano único para el estudio del desarrollo
y la tumorigénesis . J Glándula Mamaria Biol Neopasia 1 : 5 – 19 .

Visvader JE . 2009 . Mantenerse al tanto de la jerarquía epitelial mamaria y la

tumorigénesis mamaria . Genes Dev 23 : 2563 – 2577 .

Figura 2:

A. Barranquero Gómez, M., & Ferrando, N. (2024, 17 enero). ¿Qué es la

mastitis o inflamación del tejido mamario durante la lactancia? Reproducción

Asistida ORG. https://www.reproduccionasistida.org/mastitis-lactancia/

B. Thafreitas. (2013, 1 noviembre). Patología de glándula mamaria.

Danapatob2013. https://danapatob2013.wordpress.com/2013/11/01/patologia-de-

glandula-mamaria/