Prácticas de Laboratorio de Cultivo de Tejidos

Actividad 12. Subcultivo de células adherentes

Experimentación in vitro
BT2004B
Grupo 457
Equipo 2

Profesores:
Dra. María Cecilia Zampedri
M. en C. Alfonso David Ríos Pérez
Dra. Nadia Mireya Murillo Melo

Cruz Soto Ilse Marifer A01782554

Dávila Cortés Juan Pablo A01657140
Flores Domínguez Herminio Ernesto A01661420
González Becerril Martha Aída A01660926
Nuñez Urdaneta Alejandra Inés A01656961
Trejo Ruiz Yael A01656956
Subcultivo de células adherentes

Introducción

El pase es el procedimiento de recolección de células de un cultivo, la transferencia de las

células a uno o más recipientes de cultivo con medio de crecimiento fresco y el uso de esas
células para iniciar nuevos cultivos. También se conoce como subcultivo. De ahí que el
"número de pases", se refiere al número de veces que se han pasado las células en cultivo.
Las células aumentan su número a medida que se dividen en cultivo, eventualmente llenando
el recipiente de cultivo y/o agotando los nutrientes en el medio de cultivo. El estado en el que
se llena el recipiente de cultivo se denomina "confluente". Cuando las células entran en
contacto entre sí, el crecimiento se reduce considerablemente o se detiene por completo. Si el
estado de confluencia se prolonga, las células cambian su fenotipo a características anormales
o las células pueden morir. Para mantener las células en cultivo, es necesario pasarlas. Para
continuar cultivando, manteniendo el estado de las células tanto como sea posible, es esencial
pasar/subcultivar antes de llegar a la máxima confluencia.

Práctica
Material biológico: Caja con Células.
Medios de cultivo: Medio DMEM suplementado

Objetivo

Lograr el pase de células en alta confluencia para resembrar y mantener la línea celular.

Metodología

1. Usar técnicas de asepsia de operador. (Lavarse manos, quitar accesorios)

2. Usar técnicas asépticas de entorno. (Limpiar mesa de trabajo, campana con alcohol al 70%
y todo el material que va a entrar a campana)
3. Permitir que tu medio, PBS y tripsina estén a temperatura ambiente.
4. Sacar las células de la incubadora y revisar en microscopio la confluencia de tu cultivo.
5. Rociar con etanol al 70% la caja antes de entrar a campana.
6. Retirar el medio viejo de las cajas con las células con pipeta. (Inclina ligeramente la caja
para poder remover el medio)
7. Agregar de 1 mL de PBS a las cajas sin medio.
8. Mover con cuidado, intentando lavar de la superficie los restos de medio
9. Retirar el PBS de la caja de células.
10.Repetir el lavado con PBS.
11.Agregar 500 microlitros de tripsina y mover hasta cubrir completamente la superficie
donde están adheridas las células.
12.Meter a la incubadora que se encuentra a 37°C por 5 minutos.
13.Retirar de incubadora y observar en el microscopio, las células deben estar flotando y
verse con morfología redonda
14.En caso de que no estén flotando, dar unos ligeros golpes con la mesa para que terminen
de despegarse y volver a mirar en microscopio, en caso de que muchas sigan adheridas meter
2 minutos más en la incubadora volver a dar golpecitos y mirar en microscopio. NO
EXCEDER DE ESTE TIEMPO.
15.Limpiar con etanol al 70% la caja antes de volver a entrar a la campana.
16.Inactivar la tripsina con el doble de medio DMEM es decir con 1 mL de medio.
17.Pasar células tripsinizadas a tubo falcon de 15 mL estériles.
18.Centrifugar el tubo con células a 300 G por 7 minutos para obtener un pellet de células.
19.Regresar el tubo a campana y decantar el sobrenadante
20.Agregar al tubo con pellet 500 µL de medio suplementado nuevo
21.Resuspender el pellet con tu pipeta de manera suave.
22.Tomar 500 uL de células y colocarlos en la caja o en el pozo (en caso de ser caja
multipozos) donde se va a sembrar y agregar 1 ml de medio nuevo de tal manera que quede
completamente cubierta la superficie
23.Revisar en el microscopio que se vean flotando las células
24.Rótula la caja o placa con el nombre fecha y número de pase en la parte lateral
25.Meter a la incubadora a 37°C.
26.Acudir el viernes al menos un miembro del equipo a revisar células, y desechar

Figura 1: “Diagrama de flujo de los pasos realizados”

Actividad:

Contesta las siguientes preguntas.

1. ¿Cuál es la función de la tripsina? ¿Qué otro método existe para la separación de las
células?
La principal función de la tripsina es despegar las células adherentes del recipiente, otro
método que existe para la separación de células es Separación Inmunomagnética, esta técnica
se basa en el uso de anticuerpos unidos a la superficie de unas esferas
formadas por un material superparamagnético (solo son magnéticos en presencia de un
campo magnético) recubierto de un polímero. Los anticuerpos se unen de manera específica a
un antígeno presente en la superficie de un tipo celular concreto y, mediante un simple imán,
se pueden separar las células que se han unido a los anticuerpos de las demás.

2. ¿Cómo se determina el momento para realizar un subcultivo o pase?

El momento para realizar el subcultivo o pase se determina principalmente por el número de
confluencia que tiene el cultivo, ya que tendría que tener un aproximado del 80%

3. ¿Por qué se hace un lavado con PBS después de usar la tripsina?

4. ¿A qué se debe el cambio morfológico que presentan las células posterior a la

tripsinización?
El cambio morfológico observado en las células se debe principalmente a la descomposición
proteolítica de las células que están unidas a la superficie del recipiente que las contiene, esto
permite que las células se desprendan y degrade proteínas de unión entre ellas ocasionando
un estrés celular y por lo tanto un cambio morfológico.

5. ¿Cuál es el número máximo de pases que puede tener una línea celular? ¿De qué
depende?
El número de pases puede estar entre 40 y 60 pases y depende del tipo celular y su capacidad
de proliferación, asi como también, de otros factores como las condiciones del cultivo y la
acumulación de mutaciones en las células, en general, es importante realizar pruebas para
detectar la salud de la proliferación de las células.

Realiza las siguientes actividades.

1. Elabora un diagrama de flujo con los pasos que realizaste, indica los puntos cruciales para
que se realice exitosamente el subcultivo.

2. Explica si fue exitoso o no tu subcultivo justifica tu respuesta y apoya con fotografías. Si

no fue exitoso que recomendaciones harías