Universidad de la Frontera

Facultad de Ingeniería y Ciencias

Dpto. de Ciencias Químicas y Recursos Naturales

Laboratorio 2
Cuantificación y visualización de pigmentos
en muestra de Ligustrum sinense

Valentina Fernandez1, Daniel Thompson1

1
Carrera de Bioquímica. Universidad de la Frontera.
Docente: Dra. Marjorie Reyes Diaz

Jueves 12 de octubre de 2023

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Introducción

Los pigmentos fotosintéticos corresponden a moléculas las cuales absorben energía lumínica, y
la transmiten al centro de reacción fotosintética (Lackie, 2013).

Dentro de estos tenemos a los carotenos, pigmentos que al absorber longitudes de onda cercanas
a los 450 nm presentan tonalidades amarillas, rojas y naranjas (Herrero & Cifuentes, 2012). Y a
su vez, dentro de estos pigmentos encontramos a las xantofilas, de color amarillo parduzco
(Canniffe & Hitchcock, 2021), y a los betacarotenos, de un color anaranjado intenso
(Ngamwonglumlert & Devahastin, 2019). Los carotenos, además de absorber la radiación solar,
tienen una función fotoprotectora, al absorber la luz azul fototóxica, y antioxidativa, al impedir la
formación de ROS (Burri, 2013. Sutherland et al., 2022). Estas son moléculas poliénicas
compuestas generalmente por una estructura de 8 isoprenos (Maoka, 2020).

Asimismo, uno de los pigmentos más importantes por su rol fotosintético corresponden a las
clorofilas, moléculas derivadas del tetrapirrol, el cual posee una cadena hidrófoba de fitol (Singh
et al., 2020. Roca et al., 2016).

Pueden presentarse tanto como en la clorofila A, como en la clorofila B, siendo que la clorofila
A posee un máximo de absorbancia a los 430, y 630 nm aproximadamente. Mientras que la
clorofila B posee máximos de absorbancia a los 450 y 640 nm aproximadamente (Guidi et al.,
2017).

Objetivo general.

El siguiente práctico tuvo como objetivo la cuantificación de estos pigmentos, mediante

espectroscopia, y la visualización de estos a través del desarrollo de una TLC.
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Metodología
Realización de TLC
1. Se prepararon dos muestras de Ligustrum sinense, correspondientes a una hoja verde, y
otra amarilla, las cuales se pulverizaron empleando nitrógeno líquido, y molturando con
mortero.
2. Se homogeneizaron las muestras con 4 ml de etanol 96%, y fueron trasvasadas a tubos
eppendorf.
3. Se preparó la fase móvil, la cual consistió en una solución de hexano, acetona y
cloroformo 3:1:1.
4. En una lámina de sílice marcada, se depositó ambas gotas de las muestras mencionadas.
Dicha lámina luego fue ubicada en un vaso precipitado, conteniendo la fase móvil, de tal
manera que la fase móvil no sobrepase la marca indicada.
5. Se registraron los datos de la TLC.

Cuantificación de pigmentos
1. Se masaron 0,2-0,3 g de hojas para posteriormente ser molidas con la ayuda de un
mortero y pistón.
2. Al polvo resultante se le agregó 4 ml de etanol al 96%
3. Se maceró y se homogeneizó en 6 tubos eppendorf marcados como V(1,2,3) y A(1,2,3).
4. Las muestras en tubos eppendorf fueron centrifugadas a 10.000 rpm por 5 minutos.
5. Tras ser el sobrenadante trasvasado a otros tubos se midió la absorbancia por triplicado,
en el espectrofotómetro a 665, 649 y 470 nm.
6. Se diluyeron 2 tratamientos, correspondientes a la lectura a 665 nm de hoja verde, y 470
nm de hoja amarilla.
7. Se determinó la concentración de clorofila a, clorofila b, y carotenoides, por peso de
gramo fresco. Además, se validó mediante un test students.
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Resultados
En la TLC realizada en el práctico se pudo observar una separación de los compuestos,
apreciándose 4 compuestos separados correspondientes a la muestra de hoja amarilla, y 3
respecto a la muestra de hoja verde. Se marcó y calculó la distancia que recorrieron los
pigmentos desde el origen hasta la línea de solvente.

Imagen 1: Corrida de los pigmentos en TLC

Obteniéndose los siguientes resultados:
Tabla 1. Resultados de distancia de pigmentos desde el origen.
Muestra A (Hoja Amarilla) Muestra B (Hoja Verde)
Código Color Distancia desde Código Color Distancia desde
pigmento pigmento el origen (mm) pigmento pigmento el origen (mm)
A Amarillo 36 mm A Verde claro 21 mm
B Amarillo 50 mm B Verde 35 mm
C Verde claro 5,6 mm C Naranjo 80 mm
D Amarillo 80 mm
También se obtuvo la relación entre la distancia recorrida por los pigmentos y la distancia
recorrida por la fase móvil. Obteniendo los siguientes resultados:
Tabla 2. Resultados cálculo de Rf.
Muestra A Muestra B
Código pigmento Valor Rf Código pigmento Valor Rf
A 0,45 A 0,2625
B 0,625 B 0,4375
C 0,7 C 1
D 1
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Posteriormente, se obtuvieron las absorbancias de los 6 tubos eppendorf (3 de hoja amarilla y 3

de hoja verde).
Tabla 3: Resultados de absorbancia.
Hoja Verde Hoja Amarilla
A665 A648 A470 A665 A649 A470

1,142 1,001 1,023 0,576 0,392 0,63

1,072 0,794 1,027 0,635 0,223 0,633
0,796 0,689 1,037 0,652 0,359 0,628
Además, se determinó la concentración de la clorofila a, b y carotenoides a través de las
siguientes fórmulas:
● Ca= (13,95 × A665) - (6,88 × A649)
● Cb= (24,96 × A649) - (7,32 × A665)
● Cx+c= ((1000 × A470) - (2,05 × Ca) - (114,8 × Cb)) / 245
Tabla 4: Resultados de la clorofila a, b y carotenoides en hojas verdes y amarillas.
Hoja Amarilla Hoja Verde
Ca Cb Cx+c Ca Cb Cx+c
1,5472 ug/ml 5,588 ug/ml 2,95 ug/ml 9,044 ug/ml 16,625 ug/ml -3,674 ug/ml
2,20125 ug/ml 0,92 ug/ml 4,034 ug/ml 9,492 ug/ml 11,947 ug/ml -1,497 ug/ml
2,574 ug/ml 4,18 ug/ml 3,113 ug/ml 6,364 ug/ml 14,825 ug/ml -2,767 ug/ml

Tabla 6: Resultados del promedio de la clorofila a, clorofila b y carotenoides en las hojas

amarillas y verdes.
Clorofila a Clorofila b Carotenoides
Hoja Amarilla 3,512 ug/g 5,937 ug/g 11,218 ug/g
Hoja Verde 41,5 ug/g 24,109 ug/g -4,41 ug/g
Y por último, se validaron los datos gracias a la prueba test student, denotando que no hay
diferencias significativas.
Tabla 7: resultados test students.
Clorofila a Hojas Amarillas- Clorofila b Hojas Amarillas- Carotenoides Hoja Amarillas-
Hojas Verdes. Hojas Verdes Hojas Verdes

0,001870 0,0024680 0,0005502

Discusión
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Tras la comparación con los rf de literatura (Quach et al., 2004. Lumbessy et al., 2021), se
determinó que en la muestra de hojas amarillas, el punto A corresponde a clorofila a. Y los
puntos C, y D, corresponden a contaminación. Por otro lado, en la muestra de hojas verdes, se
determinó que los puntos A, y B, corresponden a clorofila b y a, respectivamente.

Tabla 8: Comparación de los resultados obtenidos de Rf experimentales con los de literatura.

Muestra A Rf Rf literatura Identificación
(Hojas experimental
amarillas)
A 0,45 0,42 Quach et al., 2004 Clorofila a
B 0,625 Quach et al., 2004 Contaminación
C 0,7 Quach et al., 2004 Contaminación
D 1 0,95 Quach et al., 2004 Betacaroteno
Muestra B Rf Rf literatura Identificación
(Hojas experimental
verdes)
A 0,2625 0,32 Quach et al., 2004 Clorofila b
B 0,4375 0,42 Quach et al., 2004 Clorofila a
C 1 0,95 Quach et al., 2004 Betacaroteno
Esta información se vio corroborada por la cuantificación de pigmentos, pudiéndose verificar la
mayor presencia de clorofila a, en hojas verdes, que en hojas amarillas.

Liu et al. (2018), y Zeng et al. (2021) llevaron a cabo un análisis de la concentración de clorofila
a y b, y obtuvieron valores significativamente más altos que los valores experimentales, con
diferencias del orden de 10^-3. Esto, posiblemente, se deba al uso de metodologías diferentes
para la cuantificación, pues Liu et al. (2018) emplean fórmulas distintas a las utilizadas en el
estudio presente, y Zeng et al. (2021) emplean la metodología de Raman para la cuantificación.

En hojas verdes, es notable que, a pesar de que TLC se presume una mayor presencia de
betacarotenos, estos no muestran una concentración significativa en la cuantificación
espectroscópica. Esto puede explicarse por el hecho de que en el cálculo de la concentración se
resta la contribución de la clorofila a y b, cuyas concentraciones son considerablemente mayores,
considerándose dicha concentración no relevante en comparación al de clorofilas. Asimismo, en
hojas amarillas se aprecia una menor cantidad betacaroteno que en hojas verdes, a pesar de
apreciarse espectroscópicamente una mayor concentración de carotenoides. Explicándose esto, a
la posible presencia de carotenoides que no se pudieron apreciar en la TLC. Esto, pudiendo haber
ocurrido debido al uso de una fase móvil no adecuada para la apreciación de xantofilas; siendo
que tanto como Quach et al. (2004), y Lumbessy et al. (2021) emplearon fases móviles distintas
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a la experimental, y apreciando xantofilas en la TLC; pudiendo ser la fase móvil empleada no

adecuada para la separación de xantofilas en la muestra.

Se trató la muestra con nitrógeno líquido en orden de homogeneizar la muestra, y se empleó

etanol para la separación de los compuestos en la muestra. Se midió la absorbancia a las
respectivas ondas, en orden de cuantificar los pigmentos. Asimismo, se realizó una TLC, en
orden de corroborar gráficamente los datos.

Conclusiones

Las concentraciones de pigmentos fotosintéticos experimentales coinciden con los análisis de

TLC. Sin embargo, nuestras cuantificaciones difieren significativamente de los valores
encontrados en la literatura debido al uso de diferentes metodologías. Además, en las hojas
amarillas, detectamos concentraciones de carotenoides que no se reflejaron en la TLC,
posiblemente tratándose de xantofilas que no se desplazaron adecuadamente, debido a la
composición de la fase móvil.

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