Microbiología Clínica
membrana interna, el atb entra, pero la
Resistencia en Bacilos
Gram (-)
• Existen mecanismos transmisibles,
significa que pueden transferirse de una
bacteria a otra que es sensible,
convirtiéndola en resistente
• Pueden ser transmitidos a través de
transposones o plásmidos
BETALACTAMICOS
• Penicilinas
• Cefalosporinas
• Monobactames
• Carbapenemes
MECANISMOS DE RESISTENCIA
CLASIFICACIÓN DE BETALACTAMASA
BETALACTAMASAS
• Perdida de porinas o impermeabilidad: el
atb no logra entrar, ya que la bacteria
puede achicar el poro, o puede dejar de
producir porinas. Las porinas se utilizan
para que la bacteria elimine desechos,
existen muchas porinas especificas por
donde entra el atb y otras donde salen
los desechos, otra opción es reducir la
cantidad de porinas, lo que genera es que
ingreso menos antibiótico por lo tanto es
menos efectivo, como última opción es
que la bacteria aumente el tamaño de la
porina, lo que genera que se tape el poro
• Mecanismos de expulsión: canal que
atraviesa la membrana externa hasta la
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Catalina Bravo A.
bacteria es expulsada, no sola
completamente de la bacteria, pero si la
cantidad suficiente para que el atb no
sea efectivo
• Alteración del sitio blanco: cambio de PBP
por PBP-2A, cumple la función de
transpeptidación dentro de la bacteria,
pero el atb no es capaz de reconocerlo
• Estos 3 tipos de mecanismos de
resistencia no son codificados por
elementos genéticos móviles, si no que
están codificados en el genoma
bacteriano, no cambia la estructura
química del atb
• Inactivación enzimática: la bacteria
produce una enzima que cambia la
estructura química del atb, lo transforma
en una sustancia inocua. La enzima más
conocida es la betalactamasa que actúa
sobre los betalactámicos, las
betalactamasas son transmisibles por
elementos genéticos móviles
• Fenotípica (Bush): considera el espectro
de hidrolisis y la respuesta a inhibidores,
características inhibitorias de la bacteria
• Estructural (Ambler): considera la
secuencia genética de la enzima, en este
caso la Betalactamasa.
• Se codifican en el ADN bacteriano y
también el plasmidio
• Dentro del plasmidio están los
transposones (genes saltarines)
• Los plásmidos se pueden transmitir a
través de la conjugación
• Causa más frecuente e importante de
resistencia a los antibióticos
betalactámicos
• Grupo heterogéneo y numeroso de
enzimas
• Codificadas a nivel cromosomal o
plasmidial.
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DOS SITIOS ACTIVOS:
• Residuo serina (grupos A - C - D): en el
sitio catalítico de la enzima hay una
serina
• Ion zinc (grupo B): de tipo metalo,
necesitan un cofactor
• Presentes en la mayoría de las
enterobacterales y BNF
• Expresión constitutiva o inducible
BETALACTAMASAS PLASMIDIALES
• Numerosas en enterobacterales
• Se caracterizan por su transmisibilidad
• Se pueden agrupar en: TEM-1, TEM-2,
SHV-1, CTX-M, OXA-1 se encuentran
ampliamente distribuidos
• Betalactamasas de espectro ampliado
también son conocidas como
Betalactamasas de espectro reducido, sin
embargo, las de espectro reducido actúan
sobre un grupo reducido de atn
betalactámicos, como por ejemplo la
penicilinasa que actúa sobre la Penicilina
• Las de espectro ampliado como la TEM-2
o la SHV-1 que actúan sobre
betalactámicos como Penicilina,
Amoxicilina o Ampicilina
• Las BLEA no se estudian en
Enterobacterales No fermentadores,
porque un porcentaje importante de
Enterobacterales fermentadores y no
Fermentadores tienen BLEA cromosomal
o plasmidial
• BLEA están las TEM-1 Y TEM-2 y en
BLLEE está la mutación TEM-3
BETALACTAMASAS CROMOSOMALES
• AmpC (Grupo C) constitutiva en E. Coli y
Shigella, ocasionalmente hiperproductoras
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Catalina Bravo A.
• Amp C inducible en Enterobacter,
Citrobacter freundii, Serratia, Morganella
morganii, Providencia
• SHV-1 en Klebsiella
• Cefuroximasas (grupo 2e) inducibles en
Proteus y C. diversus
• También se encuentra en la mayoría de
las Pseudomonas aeruginosas
BETALACTAMASAS DE ESPECTRO
EXTENDIDO (BLEE)
• Surgen de una mutación de las enzimas
de tipo BLEA
• Amplio su espectro de acción ya que no
solo es resistente a Penicilinas y
Cefalosporinas de 1era generación sino
que también las de 2da, 3ra y 4ta
generación incluido los monobactamicos
(aztrreonam)
• La creación de los carbapenémicos es a
partir de esta resistencia y se usan en el
tratamiento a estos pacientes
• Inhibidas por ácido clavulánico
• Pertenecen principalmente al grupo 2be
de Bush-Jacoby-Medeiros, y algunas al
grupo 2d
• Primer reporte pocos años después de
introducidas las cefalosporinas de III
generación (1983)
• Numerosas (más de 200)
• Derivadas principalmente de TEM, SHV y
CTX-M
• Menos frecuente PER, OXA (VEB, BES,
TLA, IBC)
• Cefixitina sensible a las BLEE
• Están principalmente en Escherichia coli,
Klebsiella pneumonia y oxytoca y Proteus.
LA IMPORTANCIA CLÍNICA,
TERAPÉUTICA Y EPIDEMIOLÓGICA DE
DETECTAR BLEE
• Las BLEE pueden transportar genes de
virulencia, que aumentan su peligrosidad
causando infecciones más severas de
inicio en la comunidad.
• Se han observados fallas terapéuticas con
betalactamicos+inhibidor, quinolonas y
aminoglucósidos inclusive cuando se
encuentran en el rango de sensibilidad,
Microbiología Clínica Catalina Bravo A.

• Su detección permite al clínico un

abordaje terapéutico que se ajusta a las
características del paciente,
• Están ampliamente diseminadas en Chile
E. coli (> 30%) Klebsiella (> 70%)
MÉTODOS DE DETECCIÓN BLEE

TAMIZAJE
COMBINACIÓN DE DISCOS
• Difusión en discos de cefpodoximo
(ambulatorios), ceftazidima, cefotaxima
(hospitalizados) o aztreonam
• Siempre debe ser unas cefalosporinas de
3ra generación
• Cuando una es resistente o intermedio se
sospecha de BLEE, cuando es muy cerca
del punto de corte (sensibilidad
disminuida) también se debe sospechar.
• Cuando la diferencia es mayor o igual a 5
es una cepa BLEE, cualquiera de las
parejas puede dar por si sola o ambas al
mismo tiempo
• Si es BLEE positivo se informa cepa
resistente a betalactámicos,
Cefalosporinas de 1er, 2da, 3er y 4ta
generación, incluido monobactam.
• Dilución (1ug/ml ctx, caz, azt, ctr)

CONFIRMATORIOS
AMP C
• Combinación de discos
(cefalosporina/clavulánico) • Estudiadas desde 1970
• Microdilución en caldo • Betalactamasas del grupo C
• ceftazidima / ceftazidima + ác. clavulánico • La mayoría son cefalosporinasas, pueden
actuar sobre carbapenémicos.
• cefotaxima / cefotaxima + ác. Clavulánico
• Epsilometría (E-test) • Inducibles y no inducibles
• Métodos automatizados (Vitek - • (+++) cefoxitina y carbapenémicos
MicroScan) • (+) cefalosporinas de tercera
• Sinergia doble-disco (caz - amox/clav - • Se estudia Amp C cuando se tiene una
ctx) cepa resistente o intermedio a
• BLEE-NDP cefalosporinas de 3era
• Generalmente cromosomales, pero desde
SOSPECHA INICIAL DE BLEE 1980 se han descrito de ubicación
plasmidial (ACT1, CMY2, FOX5)
• Grado variable de expresión
• Resistencia depende de la expresión
• Se encuentran principalmente en
Citrobacter, Enterobacter, Serratia,
klebsiella aerogenes principalmente.
(Grupo KES)

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AMP C PLASMIDIAL
• La bacteria es mucho más resistente que
una Amp C cromosomal
• Tiene variaciones en el promotor
• Ausencia de AmpR
MECANISMOS DE EXPRESION DE LAS
BETALACTAMASAS AMPC
• Constitutivo: el gen esta presente pero no
se expresa, significa que esta sensible
• Inducible: cefoxitin induce al gen AmpC
por eso se genera el achatamiento, se
informan resistentes
• Desreprimido o Hiperproductor: resistente
a cefoxitin por si solo, se hidroliza las
cefalosporinas de 3era generación
ÁCIDO BORÓNICO
• Inhibe a las AmpC
• Se realiza un test de doble disco
cefotaxima o ceftazidima mas el ácido
boronico.
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Catalina Bravo A.
TEST DE INHIBICION CON CLOXACILINA
CARBAPENEMASAS
• Dentro de las β-lactamasas, las que
representan mayor riesgo son las
carbapenemasas
• Hasta la década de los 90 las
carbapenemasas eran cromosomales y
específicas según la especie; sin embargo,
actualmente se han identificado en
elementos genético móviles los cuales han
permitido la diseminación interespecie.
• América Latina no es la excepción a esta
problemática, dado que varias de las
carbapenemasas que se han reportado en
otros continentes también se han
identificado en esta región.
• Según la clasificación clásica de Ambler y
Bush, las carbapenemasas están divididas
en clases A, D y B
• Clase A la más importante es la KPC que
está presente en todos los
enterobacterales fermentadores y no
fermentadores
• Las de Clase D también tienen
importancia sobre todo la OXA 48, se
encuentra en los enterobacterales
• Las de tipo metalo la más importante es
la NDM, la segunda más diseminada
después de KPC y tiene un gran perfil
hidrolítico
Microbiología Clínica
¿QUÉ SON LAS CARBAPENEMASAS?
• Son enzimas presentes en bacterias Gram
negativas que inactivan los
carbapenémicos y en general, a todos los
antibióticos betalactámicos.
• Existen dos familias de carbapenemasas:
las de tipo serin betalactamasas (KPC y
SME) y las metalobetalactamasas (VIM,
IMP, y NDM) con diferencias moleculares
entre las dos familias pero ambas
inactivan los carbapenémicos y en general
los antibióticos betalactámicos, a
excepción de aztreonam en las
metalobetalactamas.
• La producción y diseminación de
carbapenemasas se produce por medio de
plásmidos, por lo que el riesgo de
diseminación entre especies es muy alto.
• Las de tipo serin son capaces de
hidrolizar todo, incluyendo betalactámicos,
carbapenemicos, todas las cefalosporinas
• En cambio, las de tipo metalo hidrolizan lo
mismo excepto al Aztreonam o
monobactam
CARBAPENEMASAS CLASE A TIPO SERIN
• Algunas son codificadas en el cromosoma
(NmcA, Sme, IMI-1, SFC-1) Plasmidios
(KPC, IMI-2, derivados GES).
• KPC-2 identificado en EE. UU en 1996
• Un solo Clon de K. pneumoniae (tipo de
secuencia ST-258) se identificó
ampliamente en todo el mundo y que
está asociado a un transposon Tn 4401
• Se pueden inhibir con ácido fenil boronico
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Catalina Bravo A.
CARBAPENEMASAS CLASE B TIPO
METALO
• Son en su mayoría, del tipo integrón
Verona, que codifica para métalo β-
lactamasas (VIM), y del tipo IMP y más
recientemente la NDM-1 (métalo β-
lactamasa-1 Nueva Delhi).
• La primera MBL fue la IMP-1 encontrada
en una Serratia marcescens en Japón en
1991. Desde entonces las MBLs se han
descrito en todo el mundo.
• La NDM-1 se descubrió en Suecia en el
año 2008 en un paciente Indio que
previamente estuvo hospitalizado en
Nueva Delhi. Son ahora el centro de
atención en todo el mundo
• Necesitan de un cofactor
• Se inhibe con Ertapenem
ESTUDIO FENOTIPICO DE KPC
TEST DE HODGE
• No actúa bien con las carbapenemasas de
tipo Serin pero no con las metalo
• Se realiza un Mc Farland 0,5 de una
Escherichia coli ATCC25922, cepa KPCC,
que es sensible a todos los antibióticos
• Se realiza el césped
• Se coloca en medio un disco de un
carbapenémico y sobre la placa se
colocan las cepas en estudio sin tocar el
disco en forma de X
• Se incuba
• Cuando se produce una invaginación del
halo
• Hidroliza al atb y lo rompe
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TRITON TEST DE HODGE • Si es resistente al atb pero no es por

carbapenemasa, se vería un halo ya que el
• Se diferencia con la técnica anterior, que atb está con su estructura química inicial
al AMH se le agrega Triton x-100 y se y no fue hidrolizado
realiza la prueba

CARBA NP
METODO MODIFICADO DE
• Utiliza una solución de rojo fenol a pH de
INACTIVACION DE CARBAPENEMICOS 7,8
• Se basa en la actividad hidrolítica que • En el primero tubo se coloca rojo fenol
tiene la carbapenemasa (100 ul)
• Se tiene 2ml de caldo soya estéril, este • En el segundo tubo se coloca el rojo fenol
se inocula con una cepa sospechosa, se le (100 ul) + el antibiótico (Imipenem)
agrega un disco de Meropenem • En el tubo que tiene el antibiótico se
• El caldo se incuba a 37°C en la estufa por coloca la bacteria, cuando la cepa es
4hrs productora de Carbapenemasas, esta
• Luego de la incubación, se hace un hidroliza el anillo betalactámico del
césped en MH con una cepa ATCC 25922 Imipenem, esto produce la liberación de
Escherichia coli (sensible a todos los iones de hidrogeno que van a acidificar el
antibióticos) medio, a pH 2
• Se saca el disco del caldo y se coloca
encima de la placa donde se realiza el
césped con cepa ATCC 25922
• Se ven los resultados al siguiente día
• Fundamento: si la cepa es productora de
Carbapenemasa, el antibiótico que está en
el disco es hidrolizado, su estructura
química se rompe
• Por lo tanto, al siguiente día, el disco de
Imipenem se ve resistente pero no
significa que sea así, si no que el disco
cuando fue hidrolizado ya no tiene
principio activo CARBA BLUE

• Utiliza azul de bromotimol a pH 7

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Microbiología Clínica
• Se agrega en 2 tubos eppendorf 1ml de
Carba Blue
• A uno de ellos se le agregan 6mg de
Imipenem en polvo (Solución A)
• La solución B solo tiene Carba Blue
• En 2 tubos nuevos se agregan 100μl de
la solución A y 100 μl de la solución B
• Se le agrega a ambos tubos 1 colonia con
sospecha de carbapenemasa y se coloca
en el vortex
• Se incuba a 37°C en la estufa por 2 hrs
• Si queda de color azul es negativo, si
cambia a color amarillo o anaranjado es
positivo
• El control positivo es una cepa conocida
de KPC o NDN
• El control negativo es una cepa resistente
pero no por carbapenemasas.
CHROMID CARBA
• Medio de cultivo cromogénico sólido
diseñado para detectar enterobacterias
resistentes a carbapenémicos, el cual
consiste en una base nutritiva combinada
con peptonas. Posee una mezcla de
antibióticos que favorece el crecimiento
selectivo de enterobacterias resistentes a
carbapenémicos, junto con tres sustratos
cromogénicos.
• Permite estudio de portadores cuando se
realiza vigilancia de otros pacientes, se
utiliza un hisopado rectal
• No crece microbiota
Catalina Bravo A.
Estas pruebas son solo para saber si la cepa es
productora de Carbapenemasa pero no para saber
de qué tipo o de que grupo es
TEST DE DOBLE DISCO
• Se utiliza para saber tipo de
carbapenemasas
• Se hace un césped con la cepa en
estudio (+ a carbapenemasa)
• Se colocan 3 discos de Meropenem, a uno
de los discos de se agregó ácido boronico,
a otro disco se le agrego EDTA
• Incubación a 37°C durante 18 a 24hrs
• Si hay inhibición en algún disco se asocia
a algún tipo de carbapenemasas, por
ejemplo, si hay inhibición con ácido
boronico hablamos de una
carbapenemasas de Clase A en cambio si
la inhibición es en el disco con EDTA es
una carbapenemasa de Clase B
• 5mm de diferencia al igual que la prueba
BLEE
INMUNOCROMATOGRAFIA
• Demora solo 15min
• Este permite ver varios tipos de
carbapenemasa, dependiendo del tipo de
enzima que tenga.
XPERT CARBA-R
• Técnica más cara
• Pero también distingue los tipos de
carbapenemasas
• Es un PCR
OXA 48
• Son sensibles a veces a carbapenémicos y
cefalosporinas de 3era generación
• No siempre el Carba Np o Carba Blue dan
positivo
• Si es así se utilizan otras técnicas como
la prueba de Hodge Triton, resistencia a
Termociclina, si aparece alguna positiva se
envía al ISP para su confirmación.