Detección de fenotipos de resistencia antibiótica en

Enterobacterias
Resistencia bacteriana
- NATURAL:
o También llamadas intrínsecas o insusceptibilidad (siempre fue y será resistente a ese ATB)
o Características inherentes
o Generalmente posee los genes expresados en su cromosoma bacteriano
o Desde que nace la bacteria
- ADQUIRIDA:
o Surge de fenómenos genéticos, principalmente mutaciones
o La bacteria inicialmente es susceptible a un ATB y se vuelve resistente
o Ocurre principalmente por presión selectiva, es cuando, por ejemplo, a una persona le dan un
tto de ATB de 7 días y la persona al 2 o 3 día deja de tomarlo, por lo tanto, la bacteria que era
inicialmente susceptible al ATB, como ha sido expuesta a este y este no logro eliminar a todas las
bacterias que estaban causando la infección, se seleccionan estas mutantes resistentes y algunas
bacterias que se volvieron resistente al ATB proliferaran.
o Son las que más se estudian, ya que tienen la capacidad de diseminarse (se encuentran en
elementos genéticos móviles, como los tramposones, plásmidos, cassettes genéticos e
integrones)
o En algunos casos este material genético extracromosomal, se puede integrar al cromosoma
bacteriano mediante la secuencia de integrones. Si ocurre esto puede haber el traspaso de una
célula madre a una célula
hija

Mecanismos de resistencia
- Tenemos a una bacteria sensible,
donde el ATB se une a su receptor
en la bacteria y ejerce su acción
(bactericida o bacteriostático)

Estrategias de resistencia:
1.- Mutación del receptor o del sitio blanco  al cambiar, el ATB no se podrá unir y no ejercerá su acción.
Ejemplo: Meticilino resistencia
2.- Modificación enzimática del ATB  están serán enzimas que hidrolizan las moléculas del ATB, esto
puede suceder en el citoplasma bacteriano, en algunos casos en el espacio periplasmico de los Gram –.
Aquí tenemos todas las BLEE, carbapenemasas, etc
3.- Impermeabilidad de mb  aquí los ATB entran por porinas, por lo que la bacteria puede mutar o
disminuir o eliminar la cantidad de porinas que está expresando
4.- Expulsión del ATB  el ATB entra normalmente, pero hay un sistema de expresión o bomba de flujo
que lo saca de la bacteria, antes de que este ejerza su acción
 En algunos casos estos mecanismos pueden estar combinados

Categoría de resistencias bacterianas

- Multiresistente (MRD)
o Resistente a 1 antibiotico de al menos 3 familias diferentes
- Extensivamente resistente (XDR)
o Susceptible a solo 1 o 2 familias de ATB
- Panresistente (PDR)
o Resistente a todos los ATB existentes

Estudio de susceptibilidad
- Por difusion en disco:
o Es uno de los que mas se utilizan, cuando no se hace automatizado
1) Se mide el diametro de halo (si no hay halo, este será de 6mm que es el diametro del disco de
ATB)
2) Cotejar con la CLSI del año
3) Revisar las resistencias intrínsecas
4) Informar si es: susceptible, intermedio o resistente

En el caso de las Enterobacterias tendremos:

1) Antibiograma de Primera linea (pacientes ambulatorios)
2) En el caso de haber multiresistencia se realiza un estudio ampliado (antibiograma completo) y un
estudio de BLEE
3) Realizar estudio de carbapenemasas

PRIMERA LINEA:
- Ampicilina
- Cefazolina
- Cefuroxima
- Ciprofloxacino
- Nitrofurantoina (solamente en el caso de ser una muestra de orina)
- Sulfametoxazol- trimetropim
- Gentamicina
 En pacientes hospitalizados, es recomendable agregar 2 cefalosporinas de 3 generacion y sacar un
ATB de la lista

SEGUNDA LINEA O AMPLIADO

- Ceftroaxona/ ceftazidima/ cefotaxima
- Cefepime
- Imipenem
- Meropenem
- Ertapenem
- Piperacilina- tazobactam
- Ampicilia- sulfactam
 - Amikacina

Test confirmatorio de BLEE

 Sospechamos de BLEE cuando es resistente a alguna cefalosporina de 3 generación o a 2, entonce si
yo observo alguna resistenca en esas en el antibiograma de primera o segunda linea, tendria que
hacer un confirmatorio de BLEE
 Se realiza con 2 cefalosporinas de 3 generación y sus combinaciones con Ac. Clavulanico, entonces
en el antibiograma tendres:
- Ceftazidima
- Ceftazidima- Ac clavulanico
- Cefotaxima
- Cefotaxima- Ac clavulanico
 Este test esta estandarizado según el CLSI solamente para las sgtes cepas:
o Escherichia coli
o Klebsiella pneumoniae
o Klebsiella oxytoca
o Proteus mirabilis

Existen muchas
betalactamasas, pero las que
nos van a importar seran las
cefalosporinasas de expectro
extendido (BLEE) y las
carbapenemasas (estas se
encuentran en distintos grupos
en la clasificacion de Amblet
hay de clase A o
serinocarbapenemasas, donde
la mas comun es la KPC; clase B
o metalobetalactamasas,
donde las mas frecuente son las
IMP, VIM y NDM; y tenemos las
de clase D o OXA, que igual son serinas, las cuales, se encuantran mas presentes en Acinetobacter y tambien en
algunas enterobacterias.
Las BLEE poseen un patron hidrolitico de los ATB en general.

Betalolactamasas de espectro extendido (BLEE)

- Son enzimas que tienen como caracteristica, hidrolizar a las cefalosporinas de amplio espectro y
monobactamicos (Aztreonam), pero no alcanzan a hidrolizar a los carbapenemicos
- Son inhibidas por inhibidores de las B-lactamasas
 - en el perfil tipico, encontraremos que será
resistente a Ampicilina
- La potencia hidrolitica de las BLEE, llega
hasta las cefalosporinas de 4 generación,
pero no llega a los carbapenemicos, y si es
que se encuentran resistentes, es quizas por
que haya un mecanismo combinado, donde
puede que tenga una BLEE, la cual, le
confiere la resistencia hasta las cefalosporinas de 4 generacion y puede ser resistente a los
carbapenemicos por otro mecanismo, como el cierre de porinas (impermeabilidad de la mb) o por
bombas de expulsion
TEST CONFIRMATORIO DE BLEE

- Se considera + cuando tengamos para cualquira

de las 2 cefalosporinas combinadas con Ac
clavulanico un aumento en el halo de 5 o mas
mm.
- Se utilizan 2 para aumentar la sencibilidad de la
tecnica
- Generalmente el aumento de halo lo
observamos en las 2 combinaciones con Ac
clavulanico, pero en el caso de tener a una de las 2 con un aumento mayor o igual de 5 mm en la
combinacion con Ac clavulanico, igual seria +
- Ejemplo:
o Ceftazidima sola: halo de 16 mm
o Ceftazidima + Ac clavulanico: halo de 21 mm
Si ocurre esto, el test se
 Prueba +
considera POSITIVO igual,
- En el caso de que me diera al reves: aunque solo una combinación
o Cefotaxima: 20 mm nos de +
o Cefotaxima + Ac clavulanico: 23mm
 Prueba –
E.coli  no posee resistencia intrinseca a
los beta lactamicos
K. pneumoniae  posee resistencia
intrinseca a la Ampicilina y a la Ticarcilina
(penicilinas semisinteticas)
P. mirabilis  no posee resitencia
intrinseca a las penicilinas ni
cefalosporinas
Todas las otras bacterias poseen
resistencia a las cefalosporinas de
primera y segunda generación
Amp C no es inhibible por Ac. Clavulánico,
entonces si nosotros hicieramos un test de
BLEE para estas bacterias, nos podria dar
un falso negativo, ya que, no
observaremos aumento del halo, es por
esto que no estandarizado el test de BLEE
para estas bacterias, debido a que, posee
un mecanismo de resistencia distinto.
En este caso Amp C confiere una
resistencia a las cefalosporinas de 1 y 2
generación.

¿Cuándo hablamos de resistencia

a Carbapenemicos?
- En general, cuando las bacterias son resistentes a los carbapenémicos el ATB que primero cae es el
Ertapenem, ya que, es una molecula grande que no se utiliza para el tto de los BNF (no difunde bien por
la mb debido a su tamaño); luego viene el Meropenem y el último al que se vuelven resistente es el
Imipenem

Betalactamasas tipo Carbapenemasas

- Estas comprenden distintos tipos de enzimas, según la clasificacion de Amblet:
o Carbapenemasas de clase A y D (oxacilinas)  poseen serinas
o Carbapenemasas de clase B (metalobetalactamasas)  necesitqan zinc para poder ejercer su
actividad enzimatica
- Estas hidrolizaran carbapenemicos y e su gran mayoria, hidrolizaran tambien a casi todos los beta-
lactamicos (penicilinas, cefalosporinas, etc)
- En general si a una bacteria se le confirma que tiene una carbapenemasa, deberiamos informar a todos
los B-lactaicos como resistentes
- CLASIFICACION:
o METALOBETALACTAMASAS
(MBL O clase B) los mas
frecuentes son el VIM, NDM y
IMP; estas enzimas se
encuentran mas presentes en
BNF que en Enterobacterias; son
sensibles a Aztreonam; posee 2
inhibidores: EDTA (es un
quelante, el cua, captura el zinc
que nesecita esta enzima para
ejercer su funcion, y asi esta no puede ejercer su accion), y el Ac. Dipicolinico
o Enzimas tipo serinas de clase A  la mas comun es la KPC y la GES; se encuentran mas en
Enterobacterias, peor tambien se pueden encontrar en BNF; Posee resistencia a las
cefalosporinas de 3 y 4 generacion y al Aztreonam; serán inhibidas por el acido fenil boronico
 o Enzimas de tipo serinas clase D (oxacilinasas)  poseen distintos numeros y por eso se llaman
OXA; se encuentran principalmente en Acinetobacter, y tambien tienen presencia en algunas
Enterobacterias; NO poseen inhibidors, por lo que, resulta complicado identificarlas
fenotipicamente en el lab; ni tampoco poseen un perfil de hidrolisis definido, ya que, dependera
de que OXA sea; no son tan prebalentes

DETECCION FENOTIPICA DE CARBAPENEMASA

Existen distintos metodos para su deteccion:
1) Rapid carbaNP
→ Metodo fenotípico colorimetrico
→ Posee una buena sensibilidad y especificidad
→ Aquí se produce un cambio de color
→ El fundamento y procedimiento:
o El posillo B es un blanco y en el posillo C, voy a estandarizar con el blanco,
la concentracion bacteriana de la cepa que yo quiera estudiar (cepa
pura), por lo tanto iré comparando la turbidez a la que yo quiera llegar
con el blanco, luego de eso vamos a trasbacijar al posillo E (posillo D es
un control), el cual contiene: Imipenem (carbapenemico, cuya hidrolisis se va a estudiar) y
Zinc (para que pueda ejercer su accion la MBL, en el caso de estar presente)
→ Contiene un indicador de Ph (rojo metilo)
→ Un vez realizado el procedimeinto, incubare en la estufa por 30 min; en algunos casos se observara
este cambio de color de rojo a amarillo (se considera +), en el caso de que no haya cambio de color
se deja incubar nuevamente por 2 hrs más
→ Su principio es medir la capacidad hidrolitica de la bacteria, mediante el cambio de color
2) Test de sinergia con inhibidores
 Tendremos el carbapenémico solo, en este
caso el Meropenem y el Meropenem con el
ácido borónico, y cuando observemos un
aumento del halo de 5 o más mm será + y
sospecharemos de una carbapenemasa de
clase A o serina
→ En el otro tenemos un disco de
Meropenem solo y uno de Meropenem con
Ácido dipicolinico, eh igual si vemos una
diferencia de 5 o más mm, podremos
sospechar de una Metalobetalactamasa
3) Blue Carba
→ Es similar al Carba NP, donde también hay un cambio de color de azul a naranja
Entonces nosotros utilizamos estas pruebas fenotípicas, colorimétricas (blue Carba y Carba NP), que nos
van a decir que la bacteria posee una Carbapenemasa, y luego nosotros tenemos que hacer un test de
sinergia con inhibidores (nombre comercial es Rosco), donde compararemos los halos del carbapenémico
solo, v/s el carbapenémico + los inhibidores, y observando el aumento del halo sospecharemos de qué
tipo de carbapenemasa es.
Tener en cuenta:
- Las especies de Morganella, Providencia y Proteus (bacterias deaminadoras), pueden tener CIM
elevadas a Imipenem por otros mecanismos no relacionados con la producción de carbapenemasas,
por lo que, se sugiere buscar la producción de carbapenemasas en estos generos a partir de una CMI
de 4 ug/ml para Imipenem o de 2ug/ml para Ertapenem y Meropenem.
- Entonces cuando tengamos esa prueba positiva, buscando con esa CMI, lo informamos como un
organismo con posible producción de carbapenemasas
- Lo que nos quiere decir, es que en el caso de que estas cepas posean resistencia a Imipenem o tengan
una CMI aumentada, no se asocia a resistencia por la presencia de carbapenemasas, ya que, se vuelven
resistentes por otros mecanismos. Generalmente se van a informar estas bacterias como resistentes a
Imipenem o la otra opción es no informarlo, ya que, si un clínico ve que esta resistente al Imipenem
pensara que posee carbapenemasas, pero ya sabemos que eso está dado por otros mecanismos

4) E-test
→ Tendremos al Imipenem solo arriba, y abajo tendremos al Imipenem con un inhibidor,
que en este caso será el EDTA.
→ Al interpretarlo, tendremos al Imipenem solo con una CMI de 64 ug/ml y en el
Imipenem con EDTA notamos como la CIM baja mucho, el cual es de 1 o menos de 1
ug/ml
→ Entonces si es que observamos en el carbapenémico combinado con EDTA una
disminución de 3 veces la dilución de ATB, lo consideraremos como POSITIVO para la
presencia de ese tipo de enzima
→ Su desventaja, es que ha presentado falsos positivos en Pseudomonas y Acinotobacter,
por lo que sería más útil para Enterobacterias
5) Agar cromogénico para la detección de carbapenemasas
→ Se utilizan principalmente para vigilancia, en
algunos casos de pacientes que llevan mucho
tiempo en la UCI, o pacientes que son contacto
(que están en la misma sala, que un paciente que
ha tenido el aislamiento por una bacteria con
carbapenemasa), se les toman isopados rectales
para busca bacterias que puedan tener
carbapenemasa y se siembran en estos agares
6) Test inmunocromatográfico
→ Es un test muy simpre y económico, además de
domorarse 15 minutos
→ Estos test detectan distintas enzimas, y a la
vez pueden presentarse más de una enzima
→ Ejemplo:
El primero está presente la enzima NDM