Manual de Bacteriologia y Micologia Enero 2024

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE
MÉXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES

CUAUTITILÁN
PROYECTO PAPIME: PE207817
MANUAL DE PRÁCTICAS DE
BACTERIOLOGÍA Y MICOLOGÍA
MARCO ANTONIO MUÑOZ GUZMÁN

JOSÉ ANTONIO LICEA VEGA
JUAN ANTONIO MONTARAZ CRESPO
EDNA MARIBEL LEGASPI NUEVO
SILVIANO TREJO NUÑEZ
MARCO ANTONIO MENDOZA SAAVEDRA
JAVIER ALEJANDRO BUENDÍA JIMÉNEZ
MARCOS JAVIER SÁNCHEZ PÉREZ
JUAN CARLOS DEL RÍO GARCÍA
MARIA DEL CARMEN ESPEJEL DEL MORAL
Manual de Prácticas de
Bacteriología y Micología FES-Cuautitlán,
UNAM
PARTICIPANTES DE LA PRIMERA REVISIÓN

(AGOSTO DE 2021)
FERNANDO CERÓN TÉLLEZ

JOSÉ LUIS GUTIÉRREZ HERNÁNDEZ
EDNA MARIBEL LEGASPI NUEVO
MARÍA DEL CARMEN LILI MUÑOZ RIVERA
BERNARDO SAID SALVADOR ARÁMBULA
SILVIANO TREJO NUÑEZ
CARLOS ZAVALA PANIAGUA
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Índice
Reglamento general para los laboratorios del Dpto. de Ciencias Biológicas. 4
Reglamento específico del Laboratorio de Bacteriología y Micología. 6
Práctica 1: Bioseguridad y manejo de residuos biológico-infecciosos. 7
Práctica 2: Esterilización. 15
Práctica 3: Toma y envío de muestras para estudios bacteriológicos. 22
Práctica 4: Preparación de medios de cultivo para bacterias. 33
Práctica 5: Técnicas de siembra para el aislamiento de bacterias y 42

determinación de su morfología colonial.
Practica 6: Técnicas de tinción para bacterias. 56
Práctica 7: Pruebas primarias de identificación bacteriana. 70
Práctica 8: Identificación bioquímica de enterobacterias. 85
Práctica 9: Identificación rápida de bacterias (API 20E®) y evaluación de 108

la sensibilidad a antimicrobianos.
Práctica 10: Aislamiento de bacterias esporuladas. 126
Práctica 11: Identificación de levaduras y dermatofitos de importancia 137

veterinaria.
Práctica 12: Identificación de hongos filamentosos contaminantes 156
productores de micotoxinas.
Práctica 13: Determinación de micotoxinas en granos y alimentos para 170
animales.
Práctica 14: Evaluación de desinfectantes en diferentes superficies. 180
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UNAM
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN
REGLAMENTO ESPECÍFICO DEL LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA Y

MICOLOGÍA
1.- La asistencia será tomada a los 10 minutos de la hora señalada para el inicio de la
sesión práctica, una vez concluida la toma de asistencia, no se permitirá la entrada a
ningún alumno. No hay retardos.
2.- El alumno está obligado a asistir a un mínimo del 80% de las prácticas, el
incumplimiento de este punto será causa de baja del alumno en el laboratorio.
3.- Todos los alumnos deberán lavarse las manos al inicio y al final de cada sesión, se
recomienda traer las uñas recortadas.
4.- Se prohíbe el uso de cualquier función de teléfonos celulares durante las sesiones
prácticas, por lo que estos deberán permanecer en modo silencio y guardados desde inicio
de cada sesión. Solo en las sesiones de repaso, se permitirá el uso de la cámara
fotográfica.
5.- Los alumnos con cabello largo deberán ingresar al laboratorio con el cabello recogido
hacia atrás o con una cofia, Se prohíbe el uso de gorras, sombreros, boinas u otros
similares dentro del laboratorio.
6.- Los alumnos deberán traer durante toda su permanencia en el laboratorio bata blanca,
larga, completamente abotonada y limpia.
7.- Quedan prohibidas las manifestaciones de afecto entre parejas dentro del laboratorio.
8.- Queda prohibida la entrada con mascotas al laboratorio.
9.- El incumplimiento de cualquiera de los incisos señalados en el reglamento general o

en el presente reglamento específico se sancionará, a juicio de los profesores de
laboratorio, con el retiro del alumno de la sesión y la respectiva cancelación de la
asistencia, en caso de que el alumno no quiera acatar la sanción, procederá la suspensión
inmediata de la sesión práctica.
Revisado y aprobado: 28 de julio de 2017.
PROFESORES DEL CLAUSTRO
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UNAM
Práctica 1: Bioseguridad y manejo de residuos

biológico-infecciosos.
Objetivo
Dar a conocer a los estudiantes de la asignatura Bacteriología y

Micología de la carrera de Médico Veterinario Zootecnista, las
medidas de bioseguridad y manejo de residuos biológico-infecciosos
que deberán observarse durante las prácticas del curso.
Introducción
La bioseguridad se puede entender como el conjunto de medidas y

normas destinadas a proteger el medio ambiente y la salud de
estudiantes, profesores y laboratoristas involucrados en el desarrollo
de las Prácticas de Bacteriología y Micología Veterinaria (PBMV)
frente a riesgos físicos, químicos o biológicos. Por otra parte, dada la
naturaleza de las actividades a realizar durante las PBMV se generan
residuos peligrosos biológico-infecciosos (RPBI), cuyo manejo debe
estar apegado a las normas oficiales vigentes y hecho claramente del
conocimiento de todos los involucrados para su estricto cumplimiento.
Competencias esperadas
Que el estudiante conozca y aplique el manejo básico de residuos

biológico-infecciosos observando los conceptos de bioseguridad para
la preservación del medio ambiente, su salud y la de sus compañeros.
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Normas de Bioseguridad
Las normas y recomendaciones que a continuación se enlistan han

sido extraídas y/o adaptadas del Reglamento para los Laboratorios de
la FES-Cuautitlán, así como de manuales similares al presente
elaborados por otras Facultades de la UNAM y otras universidades del
país.
1.- Todos los involucrados en las PBMV deben conocer la ubicación y

operación de los equipos de seguridad, por ejemplo: extintor,
regadera, manta de seguridad.
2.- Todos los involucrados en las PBMV deberán portar bata blanca
limpia de manga larga y abotonada completamente.
3.- El cabello largo debe recogerse hacia atrás de modo que no

interfiera con el trabajo.
4.- Las sandalias y zapatos abiertos deben evitarse para proteger los
pies.
5.- No es recomendable usar lentes de contacto durante las prácticas,

ya que absorben los solventes produciendo irritación en los ojos.
6.- Está totalmente prohibido fumar e ingerir alimentos o bebidas

durante las prácticas.
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7.- Queda prohibido pipetear con la boca; si se requiere, debe

solicitarse el accesorio correspondiente.
8.- Al inicio y al final de cada práctica debe limpiarse la superficie de

la mesa con una solución desinfectante (alcohol etílico al 70% o
cloruro de benzalconio al 1%, entre otros).
9.- La mesa de trabajo debe mantenerse libre de libros, mochilas,

celulares o cualquier otro objeto no necesario para el desarrollo de la
práctica.
10.- Debe evitarse el contacto de las manos con la boca durante el

desarrollo de la práctica.
11.- Debe desecharse todo material de vidrio quebrado o estrellado.
12.- Debe informarse inmediatamente a los profesores de la práctica

en casos de cortaduras, quemaduras o derrame de cultivos.
13.- Al inicio y al final de la práctica deben lavarse las manos con agua
y jabón.
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Manejo de Residuos Peligrosos Biológico-Infecciosos (RPBI)
En 2003 la Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales

(SEMARNAT) conjuntamente con la Secretaría de Salud (SSA)
emitieron la Norma Oficial Mexicana “NOM-087-SEMARNAT-SSA1-
2002, Protección ambiental - Salud ambiental - Residuos peligrosos
biológico-infecciosos - Clasificación y especificaciones de manejo”. En
se especifica que, para que un residuo sea considerado como RPBI,
debe contener agentes biológicos capaces de producir infección.
También se establece la clasificación de estos residuos, así como las
especificaciones para su manejo. Esta Norma es un instrumento legal
de observancia obligatoria para establecimientos que generen este
tipo de residuos. Entre los residuos biológico-infecciosos considerados
en la norma se incluyen los siguientes: a) sangre; b) los cultivos y
cepas de agentes biológicos-infecciosos; c) los utensilios desechables
usados para contener, transferir, inocular y mezclar cultivos de
agentes biológico-infecciosos; d) las muestras para análisis
microbiológico excluyendo orina y excremento a menos que
provengan de un caso clínico infectocontagioso, en cuyo caso se
desinfectarán con hipoclorito de sodio al 1% antes de ser desechadas;
y e) los objetos punzocortantes como lancetas, agujas, hojas de
bisturí, etc.
De la NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002 se desprenden las

especificaciones relevantes a las PBMV:
14.- Si durante el desarrollo de una práctica se obtienen muestras

biológicas, deben usarse guantes de látex desechables y cubrebocas.
15.- Las muestras biológicas deben recolectarse o depositarse en

recipientes sólidos con cierres adecuados para evitar derrames.
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UNAM
16.- Si ocurre algún derrame de muestra biológica, debe desinfectarse

el área con hipoclorito de sodio al 1% o alcohol etílico al 70%.
17- Agujas o lancetas usadas deben colocarse en contenedores

rígidos ex profeso, marcados con el símbolo que se muestra en la
figura 1 y con la leyenda “Residuos Peligrosos Biológicos-Infecciosos”.
18.- Cualquier otro material potencialmente contaminado debe

depositarse en bolsas rojas de RPBI.
Figura 1.- Símbolo universal para identificación

de riesgo biológico-infeccioso.
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UNAM
Tomado de la Guía de Cumplimiento de la Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002.
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Autoevaluación
1.- Identifica tres escenarios del desempeño profesional de un MVZ

donde sea relevante atender las medidas de bioseguridad.
2.- ¿Qué es un residuo peligroso biológico-infeccioso?
3.- ¿Por qué es necesario durante la práctica portar una bata blanca
limpia y abotonada?
4.- ¿Qué instituciones del gobierno federal regulan el manejo de

residuos peligrosos biológico-infecciosos?
5.- ¿Qué instrumento legal regula la disposición de los residuos

biológico-infecciosos?
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UNAM
Referencias
1.- Reglamento General para los Laboratorios. FES-Cuautitlán,

Departamento de Ciencias Biológicas, 2022.
2.- Programa Académico de la asignatura de Microbiología y

Parasitología. Bacteriología. Departamento de Microbiología y
Parasitología Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma
de México, 2013.
3.- Manual de Prácticas de Laboratorio de Bacteriología y Micología.

Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad Autónoma
del Estado de México, 2013.
4.- Guía de Cumplimiento de la Norma Oficial Mexicana NOM-087-

SEMARNAT-SSA1-2002.
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UNAM
Práctica 2: Esterilización.
Objetivos
El alumno conocerá los métodos de esterilización más utilizados en los

laboratorios microbiológicos.
Aplicará el método de esterilización con calor húmedo para materiales

que se utilizan en Bacteriología y Micología.
Introducción
La esterilización es un término absoluto (no existen grados) que implica

la destrucción o remoción de todas las formas de vida microbiana,
vegetativas o en su fase de resistencia. Se dice que algo está estéril
cuando la ausencia de microorganismos viables (esencialmente
protozoos, hongos, bacterias y virus) es total. La muerte celular se
entiende como la pérdida irreversible de la capacidad de crecer y
multiplicarse, refiriéndose en la práctica bacteriológica a la incapacidad
de formar colonias. A esto también se le puede denominar como
pérdida de la viabilidad. Existen métodos físicos y químicos para lograr
la esterilización de materiales, los más comunes se enlistan en el
cuadro 1.
En esta práctica nos centraremos en el método de calor húmedo

utilizando una autoclave.
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UNAM
MÉTODO PRINCIPIO USOS

Esterilización del asa
Flama directa Calor seco
bacteriológica.
Vidriería refractaria,
Horno Pasteur Calor seco
Instrumental quirúrgico.
Medios de cultivo, vidriería
Autoclave Calor húmedo en general, instrumental
quirúrgico.
Filtros (membrana, Separación física de Líquidos generalmente
asbesto, vidrio, etc.) microorganismos termolábiles
Exposición a radiación Material de plástico
Radiación gamma
ionizante termolábil, suturas, etc.
Áreas y superficies,
Exposición a radiación no
Radiación ultravioleta campanas de flujo,
ionizante
líquidos.
Material plástico termolábil,
Esterilización química Óxido de etileno
suturas, etc.
Cuadro 1.- Principales métodos empleados para la esterilización de materiales.
Esterilización por calor
El calor es el medio físico más sencillo y seguro para esterilizar

materiales. El calor rompe membranas celulares, daña ácidos
nucleicos e inactiva por coagulación los componentes proteínicos,
principalmente enzimas esenciales para el funcionamiento celular. La
incineración de microorganismos producida por la llama de un
mechero es un procedimiento sencillo y eficaz, que se utiliza
comúnmente para esterilizar asas de inoculación empleadas para
sembrar los cultivos.
En la esterilización por calor hay que diferenciar básicamente dos

tipos: calor seco y calor húmedo. La esterilización con calor seco utiliza
una atmósfera de aire caliente, que se consigue con el horno Pasteur.
Las constantes más comunes para la esterilización por calor seco son
temperaturas de 160 a 180°C y una exposición de un mínimo de dos
horas. Se emplea para material de cristalería refractaria e instrumental
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UNAM
metálico. No se usa este método para medios de cultivo y líquidos en

general.
Por otra parte, la esterilización con calor húmedo emplea un sistema

que trabaja con vapor de agua a presión denominado autoclave.
Existen en el mercado diferentes modelos de autoclaves, algunos
simples como una olla de presión para poca cantidad de material y
otros más tecnificados para mayores cantidades. Debido a que el agua
a 100°C no basta para destruir las esporas bacterianas, las autoclaves
producen una atmósfera de presión de vapor de agua (15 lb/in2) para
generar temperaturas de 121°C, es por ello que, se debe eliminar
totalmente el aire de la autoclave para lograr la presión requerida. La
ventaja del vapor de agua es su alta penetrabilidad en los materiales
sometidos al proceso, lo cual hace que sea muy eficiente y rápido. Las
constantes más comúnmente empleadas en el laboratorio
bacteriológico son: 121°C, 15 lb/in2, 15 minutos. Se utiliza este sistema
principalmente para esterilizar material de cristalería refractaria o no
refractaria, medios de cultivo termoestables y material plástico que
soporte estas temperaturas. La validación del sistema utilizando calor
húmedo se consigue mediante la determinación de la inactivación de
esporas resistentes al calor, por ejemplo, Geobacillus
stearothermophilus y Clostridium thermosaccharolyticum. El uso de
indicadores químicos como los tubos de Browne también está
indicado. La cinta testigo es una tira parecida al masking tape con un
indicador que cambia de color con el calor. Esta cinta solo indica
visualmente que el proceso se ha llevado a cabo, pero no garantiza
directamente la esterilidad.
Que el alumno sea capaz de preparar adecuadamente el material

que someterá a esterilización, para conservar su esterilidad al finalizar
el procedimiento.
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UNAM
Que el alumno aplique el proceso de esterilización al material de

uso rutinario en el laboratorio de bacteriología, utilizando eficazmente
una autoclave.
Procedimiento
Materiales por grupo:
✓ Olla autoclave.
✓ Cinta testigo.
✓ Ampolletas con esporas de Geobacillus stearothermophilus.
Materiales por equipo:
✓ Pipetas serológicas.
✓ Cajas de Petri.
✓ Matraz Erlenmeyer.
✓ Papel.
✓ Gasa y algodón.
✓ Hilo cáñamo.
✓ Marcador indeleble.
✓ Tijeras.
1.- Por equipo se les entregará material limpio para su preparación y

posterior esterilización en la autoclave.
2.- Siguiendo las instrucciones del profesor, se envolverán con papel

reciclado, cajas de Petri y pipetas.
3.- En el caso de los matraces, se elaborará una torunda de algodón

con gasa, algodón e hilo cáñamo y posteriormente se cubrirá la boca
del material con un capuchón de papel.
4.- Las pipetas serológicas de diferentes graduaciones se envolverán

completamente con tiras de papel.
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UNAM
5.- Todo el material será adecuadamente marcado con los datos del
equipo y grupo y se les colocará cinta testigo.
6.- El material se someterá a proceso de esterilización utilizando una

olla autoclave siguiendo los siguientes pasos:
a) Se verifica que la olla tenga agua hasta la marca correspondiente.
b) Se introduce en la camisa el material junto con una o varias

ampolletas con esporas de Geobacillus stearothermophilus, se coloca
dentro de la olla y se cierra haciendo coincidir las marcas de la tapa
con las de la olla.
c) Se calienta inicialmente la olla con la válvula de purgado abierta a

fin de eliminar todo el aire dentro de la misma, una vez que sale vapor
dejar un minuto y cerrar la válvula de purgado.
d) Vigilar minuto a minuto la elevación de la presión de la olla en el

baumanómetro de la misma, cuando llegue a la presión requerida (15
lb/pulgada2) estabilizar dicha presión bajando la intensidad de la flama.
Esta presión debe sostenerse durante 15 minutos. La temperatura que
alcanza la cámara de la olla bajo estas condiciones es de 121°C.
e) Terminado el proceso, se deja enfriar la olla hasta que la presión

baje completamente. El material se retira y se verifica si hubo cambio
de color de la cinta testigo.
f) Finalmente, el material se deja secar sobre una charola, aunque

también se puede llevar a cabo en un horno Pasteur para su posterior
utilización.
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Autoevaluación
1.- ¿Qué importancia tiene envolver el material previo a la

esterilización?
2.- ¿Por qué es necesario purgar la autoclave antes de elevar la

presión?
3.- ¿Por qué es necesario asegurar 15 lb/in2 de presión por 15

minutos cuando se esteriliza con calor húmedo?
4.- Escriba algunos ejemplos de materiales y soluciones que se

pueden esterilizar utilizando calor húmedo.
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UNAM
5.- ¿Qué utilizó como referencia de que el proceso de esterilización

se llevó adecuadamente?
Referencias
1. - Ryan KJ. Sterilization and Disinfection. 2004. Kenneth J. Ryan. The

McGraw-Hill companies, Inc.
2. - Ryan KJ and Ray CG. Sherris Medical Microbiology an Introduction

to Infectious Diseases. 2004. 4th Edition. The McGraw-Hill.
3. - Hans GS. 1997. Microbiología General. Ediciones Omega, S.A.
4. - Russell H & Ayliffe´s: Principles and Practice of Disinfection,

Preservation and Sterilization. Fifth Edition by Adam P. 2013. Blackwell
Publishing Ltd.
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UNAM
Práctica 3: Toma y envío de muestras para

estudios bacteriológicos.
Objetivo
El alumno practicará la toma de muestras para el aislamiento de

bacterias a partir de órganos, secreciones y excreciones de animales,
así como el correcto envío de las mismas al laboratorio de diagnóstico.
Introducción
El diagnóstico de las enfermedades infecciosas se basa en el estudio

de los signos clínicos, así como en la demostración de la presencia del
agente, de sus toxinas o de elementos del sistema inmune del
individuo contra el patógeno o sus productos. El diagnóstico clínico es
orientado por la evaluación de los datos que ofrece la historia clínica y
la exploración. La confirmación de un diagnóstico clínico requiere del
diagnóstico etiológico que compete a los laboratorios. Toda la
información diagnóstica que el laboratorio de bacteriología puede
proporcionar, depende de la calidad de la muestra recibida. Por ello,
una toma mal realizada, pobremente conservada o mal transportada,
puede afectar la viabilidad de los agentes involucrados, causar errores
en la identificación e incluso la elección de un tratamiento inadecuado
del animal enfermo.
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UNAM
Colección de muestras
Todas las muestras clínicas que se colecten deben considerarse
potencialmente infecciosas, y por ello, se deben manejar utilizando
numerosas prácticas dictadas en principio, por el sentido común,
además de tomar en cuenta las normas de bioseguridad. Lo anterior
debe impedir razonablemente la exposición franca del personal a
agentes potencialmente patógenos. Las muestras biológicas más
comunes que se colectan para cultivo e identificación bacteriana son:
exudados (moco o pus), secreciones (leche) excreciones (materia
fecal y orina), fluidos (líquido ascítico o pericárdico) y muestras de
tejidos (pulmón, hígado o sangre).
Las muestras que se pueden colectar con el uso de hisopos son: pus
de heridas o abscesos, exudados nasales, vaginales, óticos, oculares
u otros. Se recomienda tomar dos muestras de la misma área, además
de que es posible hacer extensiones y tinciones para una observación
inicial. Para evitar que se sequen los hisopos hay que colocarlos en
medio de transporte como medio de Stuart, solución salina fisiológica,
caldo de soya, medio de tioglicolato, entre otros.
Los fluidos como la sangre, líquidos (pleural, peritoneal, pericárdico,

sinovial), fluido cerebroespinal o exudado purulento de abscesos
cerrados o profundos, se pueden obtener con jeringas estériles por
medio de punción directa. Cuando se trata de tomas transcutáneas se
realiza la antisepsia de aproximadamente 10 cm2 de la piel sobre el área
afectada. Las muestras antes referidas pueden enviarse en la misma
jeringa sin aguja para evitar contaminaciones.
23
UNAM
Las muestras de orina pueden ser obtenidas por punción de la vejiga,

cateterización o estimulación mecánica de la micción. Se debe realizar
previamente antisepsia de la zona abdominal o prepucial según sea el
caso.
En especies grandes, las muestras de heces deben ser tomadas
directamente del recto, utilizando guantes de palpación o bolsas de
plástico nuevas. Para especies pequeñas se pueden utilizar hisopos,
introduciéndolos directamente en el recto y colocándolos después en
tubos estériles con medio de transporte. Cuatro gramos de heces en
general es suficiente para los estudios en el laboratorio.
Las muestras de tejidos deben ser tomadas del límite de las lesiones
producidas por el agente causal del que se sospeche. Deben ser de
un grosor no mayor de 4 cm3, se colocan en frascos estériles con tapa
hermética o en bolsas nuevas individuales. Cuando se obtienen
muestras de necropsias, se deben colectar preferentemente una a dos
horas máximo después de la muerte del animal. Es mejor anticipar
cuales muestras se requerirán para análisis bacteriológico y obtener
éstas primero, antes que la manipulación y la exposición excesiva del
tejido causen mayor contaminación. Las muestras de tubo digestivo se
toman al final para evitar la contaminación de otros tejidos.
En el caso de muestras de leche, es importante que ésta se tome en un
lugar cerrado para evitar contaminación por el polvo y aire. Es necesario
lavar la ubre y pezones con agua tibia limpia y frotar el esfínter del pezón
con un algodón humedecido con alcohol al 70%, permitiendo la
evaporación del mismo antes de tomar la muestra. La muestra de leche
debe tomarse inmediatamente antes de la ordeña regular, eliminando
24
UNAM
los primeros chorros, este procedimiento debe realizarse en cada cuarto

a muestrear. La muestra se debe tomar en un frasco estéril de boca
ancha con tapa de rosca con (por lo menos 15 ml). La persona que tome
la muestra deberá realizarse antisepsia de las manos con una solución
de alcohol entre cada vaca muestreada. La muestra se debe identificar
correctamente con los datos del animal y el cuarto de la ubre al que
corresponde.
En el caso de colección de agua para estudios de calidad bacteriológica,
las fuentes pueden ser: directamente de la llave, filtros, estanque,
cisternas, pozos y tinacos. A la muestra de agua se le debe adicionar un
quelante de cloro para evitar falsos negativos por el proceso de
potabilización convencional. Para su envío se requieren frascos estériles
de boca ancha, cierre hermético y con capacidad mínima de 100 ml.
Otras muestras que se pueden analizar en el laboratorio de bacteriología
son muestras de alimento o de colmenas. Para el análisis de alimento,
la obtención varía de acuerdo con la naturaleza y consistencia del
mismo.
En el caso de infecciones que afectan al panal (abejas adultas), se
envían de 10 a 15 cm2 de este, que contengan crías afectadas en todos
los estados de desarrollo, se envuelven en periódico u otro material que
permita la ventilación.
Envío de muestras
Los aspectos más importantes a considerar para el envío de las
muestras al laboratorio de bacteriología son: 1) cada muestra debe ser
rotulada, de modo que sea fácil de identificar, 2) las muestras deben ir
25
UNAM
acompañadas de la historia clínica completa (ver ejemplo anexo), 3)

se debe especificar claramente el análisis que solicita, 4) el envío debe
ser lo más pronto posible, 5) las muestras pueden estar refrigeradas o
congeladas según sea el caso y nunca deben ser fijadas en formol o
algún otro fijador químico y 6) se debe evitar que las muestras tarden
más de 24 horas en llegar al laboratorio.
Debe observarse una especial atención a los métodos de obtención y
conservación, así como la prontitud del transporte de muestras al
laboratorio en el caso de bacterias anaerobias y bacterias sensibles a
cambios de temperatura y pH para mantenerlas viables. Para el
aislamiento de anaerobios, los hisopos deben ser de alginato o rayón
y deben ser colocados en un medio de transporte especial para este
tipo de bacterias, como el medio de tioglicolato. El empaque propio o
adecuado de las muestras ayudará a protegerlas de la ruptura o
exposición al ambiente.
Que el alumno sea capaz de tomar muestras para estudios

bacteriológicos a partir de un cadáver y enviarlas adecuadamente a un
laboratorio para el aislamiento de bacterias patógenas.
Procedimiento
✓ Dos cadáveres de animales de laboratorio y/o bioterio (rata o

conejo).
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✓ Instrumental de disección: bisturí, pinzas planas y tijeras (dos

juegos) estériles.
✓ Espátula.
✓ Dos mecheros de Bunsen.
✓ Bolsas de plástico autosellables.
✓ Cuatro tubos con medio de transporte de Stuart.
✓ Cuatro hisopos estériles.
✓ Hilo cáñamo.
✓ Dos hieleras de unicel medianas.
✓ Refrigerantes de gel.
✓ Marcador indeleble.
✓ Formulario de historia clínica.
Se formarán dos grupos de alumnos y procederán con un cadáver por

grupo, de la siguiente manera:
1.- Realizar una inspección general al cadáver para determinar el

tiempo que lleva el animal muerto y si presenta secreciones o
excreciones en orificios naturales, en caso de haberlas, colectar una
muestra con hisopo.
2.- Una vez colectada la muestra, introducir el hisopo en el medio de

transporte de Stuart e identificar la muestra.
3.- Colocar el cadáver en posición decúbito dorsal y realizar una

incisión sobre la piel desde la fosa submandibular hasta la región
pélvica.
4.- Separar y retraer la piel de las cavidades torácica y abdominal,

posteriormente incidir sobre las aponeurosis axilares hasta lograr que
los miembros torácicos queden alineados con la superficie de la mesa.
5.- Desarticular ambas articulaciones coxofemorales para lograr

alinear con la superficie de la mesa los miembros posteriores.
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6.- Incidir sobre la región del cuello y hasta la cavidad torácica para
acceder a la tráquea y pulmones. Posteriormente colocar el aparato
respiratorio completo en una caja de Petri.
7.- Con tijeras flameadas, abrir la tráquea e introducir un hisopo para

recoger la secreción del tubo traqueal, proceder con la muestra de la
misma manera descrita en el numeral 3.
8.- Identificar cambios macroscópicos en el aspecto y consistencia de

los lóbulos pulmonares; con tijeras flameadas, cortar una sección de
aproximadamente 4 cm3 del pulmón e introducirla a una bolsa e
identificar.
9.- Abrir la cavidad abdominal y proceder con el hígado de la misma

forma que con el pulmón, una vez tomada la sección de hígado,
calentar la espátula por 20 segundos a la flama y colocarla sobre todas
las superficies de la muestra con la finalidad de que esta sea sellada.
Introducir la muestra en una bolsa de plástico e identificar.
10.- Identificar la porción del duodeno en las asas intestinales y hacer

dobles ligaduras en sus extremos con hilo cáñamo. Posteriormente
separar el duodeno completo seccionándolo entre cada una de las dos
ligaduras de cada extremo. Introducir a una bolsa de plástico e
identificar.
11.- Colocar todas las muestras dentro de la hielera entre los

refrigerantes de gel (congelados), rellenar los espacios con papel para
fijar la posición de todas las muestras y llenar la historia clínica.
12.- Cerrar la hielera con cinta adhesiva y colocar por fuera la historia
clínica, los logotipos de riesgo biológico y la dirección de envío con los
datos del remitente.
13.- Colocar los restos del cadáver en una bolsa amarilla para su
contención y posterior eliminación por incineración (NOM-087-ECOL-
SSA1-2002).
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Discusión
Razonar en forma grupal las siguientes preguntas:
1.- ¿Qué problemas encontró en la toma de muestras para

bacteriología?
2.- ¿Por qué es importante llenar una historia clínica y remitirla con
las muestras al laboratorio?
3.- ¿Qué diferencias cree que existan en cuanto a los procedimientos

con un animal vivo?
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Referencias
1.- González B.J.M. Técnicas y métodos de laboratorio clínico. 2010.

3ª edición. Elsevier.
2.- Ryan KJ and Ray CG. Sherris Medical Microbiology. An Introduction

to Infectious Diseases. 2004. 4th Edition. The McGraw-Hill.
3.- Manual de toma y envío de muestras.

http://www.microclin.com/archivos/manual_de_Toma_de_muestras_I
ASA.pdf. Fecha de consulta 18/1/2016. Historia clínica ICA.
http://www.ica.gov.co/getattachment/0555e074-c3de-4493-92b4-
e85feb7f1383/Coloracion-de-Zielh-Neelsen.aspx. Fecha de consulta
18/1/2016.
4.- Manual de colección, recepción, manejo, transporte y conservación

de muestras para análisis bacteriológico. UADY.
www.ccba.uady.mx/sgc/spp/M-CCBA-LB-01.doc. Fecha de consulta
18/1/2016.
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UNAM
Práctica 4: Preparación de medios de cultivo para

bacterias.
Objetivo
El alumno aprenderá a preparar medios de cultivo para su uso en

bacteriología.
Introducción
Después de realizada la toma y envío de muestras adecuadas para

estudios bacteriológicos, en el laboratorio se selecciona el medio de
cultivo idóneo para el aislamiento de la posible bacteria causal con
base en la información clínica y el diagnóstico presuntivo que
acompaña a la muestra.
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de

crecimiento y otros componentes que proporcionan las condiciones
necesarias para el desarrollo de los microorganismos in vitro. Todas
las bacterias requieren agua, carbono, nitrógeno, hidrógeno, oxígeno,
fósforo y hierro como elementos vitales. Otras más exigentes requieren
factores de crecimiento como aminoácidos, vitaminas y otras
sustancias que no son capaces de sintetizar. Con base en lo anterior,
el medio de cultivo es seleccionado según las necesidades
metabólicas de cada bacteria.
33
UNAM
Clasificación de medios de cultivo con base en sus características

físicas.
Líquidos: Son aquellos que no contienen agar, sirven para obtener

crecimiento bacteriano masivo. Por ejemplo, caldo nutritivo y caldo
infusión de cerebro corazón (BHI).
Semisólidos: Son aquellos que contienen de 0.4 a 0.5% de agar, sirven

para la realización de pruebas bioquímicas. Por ejemplo, medio O/F y
medio SIM.
Sólidos: Son aquellos que contienen de 2 a 3% de agar, sirven para el

primoaislamiento y/o purificación de colonias bacterianas. Por ejemplo,
agar nutritivo, agar Mac Conkey y agar sales manitol.
Clasificación de medios de cultivo con base en su función y uso
Medios de transporte: son aquellos que se utilizan para la toma,

transporte y preservación de las muestras clínicas aptas para
exámenes bacteriológicos. Por ejemplo, medio de transporte de Stuart.
Medios básicos: contienen nutrientes que favorecen el desarrollo de la

mayoría de microorganismos sin requerimientos especiales. Por
ejemplo, agar y caldo nutritivo.
34
UNAM
Medios enriquecidos: son medios que han sido suplementados con

nutriente(s) que proporcionan factores de crecimiento para permitir el
desarrollo de microorganismos más exigentes. Por ejemplo, agar
sangre (adicionado con sangre desfibrinada), agar chocolate
(adicionado con sangre desfibrinada y hemolizada) o agar yema de
huevo (adicionada con yema de huevo).
Medios de enriquecimiento selectivo: en el caso de algunos géneros

como Salmonella existen medios que permiten su crecimiento en forma
más rápida (por contener nutrientes específicos), sin inhibir totalmente
el desarrollo de los demás. Por ejemplo, caldo selenito de sodio y caldo
tetrationato.
Medios selectivos: contienen una o más sustancias inhibidoras (ver

cuadro 1) que permiten el crecimiento de un determinado tipo de
bacterias e inhiben el desarrollo de las demás. Por ejemplo, medio de
Lowenstein-Jensen para Mycobacterium spp; Fletcher para Leptospira
spp. y agar 110 para Staphylococus spp.
Medios diferenciales: contienen sustancias que permiten que las

colonias de una bacteria exhiban características metabólicas en
presencia de un indicador de pH (cuadro 2) que las diferencian con
base en su color de otras colonias que puedan crecer en el mismo
medio. Por ejemplo, agar Mac Conkey o verde brillante para
fermentación de lactosa y agar sales manitol para fermentación de
manitol.
35
UNAM
Cuadro 1.- Componentes más comunes de los medios de cultivo para bacterias.
NUTRIENTES
• Extracto de carne: proporciona carbono, nitrógeno, sales inorgánicas y otros nutrientes. Se
elabora principalmente con músculo, corazón o hígado de bovino; también se puede usar cerebro,
bazo o placenta de ternera.
• Extracto de levadura: es un derivado de pan o cerveza, proporciona aminoácidos y vitaminas del
complejo B.
• Peptonas: son proteínas animales o vegetales degradadas, ricas en nitrógeno y carbono de fácil
disposición. Se elaboran a partir de músculo, hígado, sangre, leche, caseína, lactoalbúmina,
gelatina o frijol de soya.
• Cloruro de sodio: mantiene el equilibrio osmótico.
SOLIDIFICANTE:
Agar: es un solidificante sin propiedades nutritivas, es un extracto seco, gelificante, obtenido de algunas
algas marinas principalmente de los géneros: Gelidium, Graciliaria, Pteroclaida y Adanthopeltis. La
concentración varía dependiendo del estado físico que se quiera obtener para el medio:
▪ Medio sólido: 2 a 3% de agar.
▪ Medio semisólido: 0.4 a 0.5% de agar.
INHIBIDORES:
• Sales biliares: actúan como inhibidores de bacterias Gram positivas (taurocolato sódico y
desoxicolato sódico).
• Colorantes: se utilizan como inhibidores de bacterias Gram positivas, principalmente cristal violeta,
verde brillante, eosina y azul de metileno.
• Antibióticos: principalmente gentamicina, cloranfenicol, amikacina, ácido nalidíxico, vancomicina,
polimixina y cefalosporinas.
• Clorhexidina o actidiona: fungen como antimicóticos.
INDICADORES:
Indicadores de pH: son colorantes que detectan variaciones en la acidez o alcalinidad del medio causadas
por el metabolismo bacteriano.
Los medios selectivos más comúnmente utilizados para el

aislamiento de enterobacterias como Mac Conkey, verde brillante y
eosina azul de metileno (EMB) también tienen propiedades
diferenciales, por lo que son selectivos y diferenciales al mismo tiempo.
36
UNAM
Indicador de pH pH ácido pH alcalino

Rojo de fenol Amarillo Rojo
Rojo neutro Rojo Amarillo
Azul de bromotimol Amarillo Azul
Púrpura de bromocresol Amarillo Púrpura
Fenolftaleína Incoloro Rojo
Indicador de Andrade Rojizo Incoloro
Cuadro 2.- Indicadores de pH utilizados en medios
de cultivo para bacterias.
Que el alumno adquiera la capacidad para preparar un medio de cultivo

comercial en cualquiera de sus tres formas físicas.
Procedimiento
✓ Autoclave.
✓ Medios de cultivo comerciales.
✓ Cinco balanzas granatarias.
✓ Cinta testigo.
✓ Un matraz Erlenmeyer de 250 ml (con torunda).

✓ Tres cajas de Petri de 9 cm de diámetro estériles (20-30 ml de
medio/caja).
37
UNAM
✓ Diez tubos de ensaye de 8 ml (2-3 ml de medio por tubo).

✓ Una probeta de 100 ml.
✓ Una pipeta de 10 ml.
✓ Agua destilada.
✓ Un mechero de Bunsen.
✓ Un atomizador con desinfectante.
✓ Una franela.
✓ Encendedor, marcador indeleble y espátula.
1.- Calcular y pesar la cantidad de polvo que se necesita para preparar

el medio de cultivo.
2.- Rehidratar el medio vertiendo primero el agua en el matraz y

posteriormente el polvo y si el medio lo requiere, dejar reposar 5
minutos.
3.- Homogenizar el medio con movimientos circulares suaves y

calentándolo sobre la flama del mechero.
4.- Calentar el medio hasta que desaparezcan los grumos y se torne

transparente (clarificación). Evitar la ebullición prolongada del mismo.
5.- En el caso de los medios preparados en tubo, transferir con la

pipeta, dos mililitros de medio por tubo y colocar el tapón flojo para
permitir el flujo de vapor. Los medios que se sirven en caja se
esterilizan en el matraz en donde se prepararon.
38
UNAM
6.- Esterilizar el medio de cultivo en autoclave a 121°C 15 lb/in2 durante

15 minutos.
7.- Cerrar completamente el tapón de los medios preparados en tubo

inmediatamente después de sacarlos del autoclave. En el caso de los
medios en caja, enfriar el medio de cultivo a una temperatura
aproximada de 45-50°C para poder servirlo.
8.- Desinfectar la superficie de la mesa de trabajo y encender el

mechero. Posteriormente, desenvolver las cajas de Petri junto al
mechero y verter aproximadamente 25 ml de medio en cada caja.
9.- Dejar solidificar el medio, invertir las cajas y pasar a prueba de

esterilidad a 37°C durante 24 horas en la estufa bacteriológica.
Aquellos medios que no estén contaminados podrán ser utilizados en

forma inmediata o ser almacenados en refrigeración. Los medios que
presenten algún tipo de crecimiento (contaminados) tendrán que ser
eliminados según la NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002.
Resultados
De los medios preparados en el grupo, recabe la siguiente información:
39
UNAM
MEDIO COLOR INHIBIDORES INDICADOR pH
Autoevaluación
1.- Para la preparación de 300 ml del medio de cultivo agar sangre

al 5% ¿qué cantidad de polvo se requiere?
2.- Al haber esterilizado el medio anterior, ¿qué cantidad de sangre

se necesita adicionar?
3.- ¿Por qué los medios de cultivo deben enfriarse antes de servirse
en las cajas de Petri?
40
UNAM
Referencias
1.- (s.f.). Obtenido de
http://www.ugr.es/~cjl/medios%20de%20cultivo.pdf
2.- BIOXON. (s.f.). MANUAL DE MEDIOS DE CULTIVO.
3.- Diaz, R., Gamazo, C., & López, I. (2004). Manual práctico de
microbiología. Barcelona: Masson.
4.- Forbes, B., Sahm, D., & Weissfeld, A. S. (2009). Diagnóstico

Microbiológico. Argentina: Panamerica.
5.- García V., S., Ortega L., L., & Cruz S., T. (s.f.). Manual de
Prácticas de Microbiología Veterinaria. México.
6.- García, P., Fernández, M., & Paredes, F. (2002). Microbiología

clínica aplicada. España: Diaz de santos.
7.- Koneman, E., Winn, W., Allen, S., & Procop, G. (2006). Koneman
diagnostico microbiológico. México: Medica Panamericana.
8.- Prescott, L., Harley, J., & Klein, D. (2004). Microbiología. España:
McGraw-Hill.
9.- Rodríguez, E., Gamboa, M., Hernández, F., & García, J. (2012).
Bacteriología General. Costa Rica: Editorial Universidad de Costa
Rica.
41
UNAM
Práctica 5: Técnicas de siembra para el

aislamiento de bacterias y determinación de su
morfología colonial.
Objetivos
El alumno realizará una técnica de siembra por dilución en medios

sólidos para el aislamiento de colonias bacterianas.
El alumno describirá las características morfológicas más importantes.
Introducción
Las técnicas de siembra tienen la finalidad de depositar

adecuadamente a las bacterias en los medios de cultivo para lograr su
desarrollo óptimo en ellos. Estas técnicas pueden variar dependiendo
del estado físico del medio o del propósito de la siembra, por ejemplo,
se emplea una técnica diferente para un medio líquido que para un
sólido; en medios sólidos hay técnicas de siembra que permiten el
desarrollo masivo de la bacteria y hay otras que permiten el aislamiento
de colonias.
Las técnicas de siembra empleadas para la dilución de colonias

bacterianas tienen la finalidad de separar físicamente sobre una
superficie de agar, las diversas poblaciones bacterianas presentes en
una muestra (clínica, patológica, de alimento etc.), de tal manera que
42
UNAM
nos permitan obtener colonias aisladas de una determinada bacteria

para su posterior cultivo puro e identificación. La técnica más utilizada
para este propósito es la de estrías cruzadas, cuya finalidad es
disminuir en cada serie de estrías la concentración de bacterias en la
superficie del agar (dilución).
Una colonia bacteriana es un conjunto de millones de bacterias que

forman una estructura macroscópica definida, generalmente visible a
simple vista en un medio sólido. Las colonias se derivan de una sola
bacteria viable o un grupo de éstas pertenecientes a la misma clona a
las que se les denomina unidad formadora de colonia (UFC). Si la
colonia crece lo suficientemente alejada del resto y no se mezcla con
otras, se denomina colonia pura y posee características constantes
dependiendo del tipo de bacteria que la formó. De esta manera, las
colonias de algunos organismos presentan características
morfológicas propias como: tamaño, forma, márgenes, elevación,
pigmentación y olor. La simple evaluación de la morfología colonial es
el inicio de la identificación bacteriana y ayuda a la toma de decisiones
sobre el esquema de identificación que se seguirá.
Manejo del área estéril y el asa bacteriológica
Todas las siembras que se llevan a cabo en el laboratorio de

bacteriología tienen que ser realizadas con instrumentos esterilizados,
generalmente en una flama y en un área estéril. El mechero de Bunsen
cuando está encendido produce una corriente de aire que circula
43
UNAM
constantemente hacia dentro de la flama por la parte inferior saliendo

por la parte superior de la misma. El aire que pasa a través de la flama,
continuamente se mantiene estéril mientras que no se rompa el flujo
con corrientes fuertes externas (figura 1). El área de esterilidad que se
genera por este fenómeno es aproximadamente de unos 15 cm
alrededor y debajo de la flama, por lo que todos los procedimientos en
donde se abran tubos o cajas estériles deben hacerse dentro de la
misma.
Aire caliente Flama azul

(estéril)
Aire frío
Aire frío
15 cm
MAMG
ÁREA DE ESTERILIDAD
Figura 1.- Flujo de aire estéril producido por el

mechero de Bunsen
El asa bacteriológica en un instrumento de transferencia que tiene un

mango para sujetarse y un filamento de una aleación de cromo y niquel
(chromel) con la propiedad de calentarse al rojo vivo y enfriarse de
manera muy rápida. Esta propiedad es utilizada para esterilizar el
filamento al rojo vivo dentro de la flama y transferir bacterias de un
medio a otro enfriando el filamento previamente. Se pueden emplear
44
UNAM
también varillas de vidrio o asas de plástico estériles desechables para

la siembra de bacterias.
Existen diversas técnicas de siembra para este propósito, sin embargo,

por su facilidad, la más utilizada en los laboratorios de bacteriología es
la técnica de estrías cruzadas.
Que el alumno sea capaz de obtener colonias aisladas a partir de la

siembra mediante la técnica de estrías cruzadas en un medio de cultivo
sólido, con el fin de conocer sus características básicas coloniales y de
crecimiento.
Procedimiento (primera sesión)
Material por grupo:
✓ Estufa bacteriológica.
✓ Mechero de Bunsen.
✓ Asa bacteriológica.
✓ Encendedor.
45
UNAM
✓ Desinfectante.
✓ Franela.
✓ Cajas con medios de cultivo sólidos (agares).
✓ Cultivo bacteriano.
1.- Encender el mechero de Bunsen y regular el paso de aire hasta

lograr una flama azul homogénea.
2.- Esterilizar el asa bacteriológica en la orilla de la flama y enfriar

durante algunos segundos tocando con ella la superficie del agar.
3.- Abrir el cultivo bacteriano dentro del área estéril del mechero,
procurando usar solo la mano izquierda para sostener y abrirlo. Si esto
no es posible, solicite a un compañero que abra el medio.
4.- Tomar una asada del cultivo y transferir a la caja de agar, para lo
cual, sobre la superficie del agar, trazar una línea (estría) desde una
orilla hasta un tercio de la caja en dirección al centro (sobre el radio de
la circunferencia), realícela suavemente para que no rompa el agar.
Posteriormente trace una estría continua hacia abajo de lado a lado de
la caja en forma perpendicular a la primera estría para dispersar a las
bacterias en la superficie del agar, no rebase más allá de un tercio de
la caja (figura 2a).
5.- Esterilizar y enfriar el asa bacteriológica.
46
UNAM
6.- Girar la caja unos 45° en contra de las manecillas del reloj y trazar
una estría continua de izquierda a derecha tocando por el lado
izquierdo la primera serie de estrías (figura 2b).
7.- Esterilizar y enfriar el asa bacteriológica.
8.- Nuevamente girar la caja otros 45° en contra de las manecillas del
reloj y trazar otra estría continua de izquierda a derecha tocando por el
lado izquierdo sólo a la segunda estría continua (figura 2c).
9.- Repetir el paso 6 y 7 procurando tocar solamente la última estría en

el agar.
10.- Trazar una estría continua hacia el centro de la caja pasando sólo
por la última estría continua y cuidando de no tocar ninguna otra (figura
2d).
11.- Esterilizar y enfriar el asa bacteriológica antes de dejarla en la

mesa.
12.- Tapar la caja de agar sembrada antes de retirarla del área estéril
y colocarla con la tapa hacia abajo.
13.- Incubar a 37 °C durante 24 hrs.
47
UNAM
Evaluación del crecimiento bacteriano y la morfología colonial
Algunas características que pueden ser fácilmente apreciables en las

colonias bacterianas para orientar la identificación son: cantidad de
colonias (crecimiento), tamaño, forma, tipo de bordes, elevación y
color. Otras más difíciles de apreciar como el olor y la consistencia
pueden ser tomadas en cuenta cuando la persona que las evalúa es
más experimentada en la identificación bacteriana (figura 3). A
continuación, se describen las características más comunes.
48
UNAM
Crecimiento
La cantidad de colonias desarrolladas en la placa se evalúa de manera
subjetiva en diferentes grados como son: crecimiento ligero,
crecimiento moderado, crecimiento abundante o sin crecimiento.
Tamaño
Se puede categorizar en: colonias pequeñas con un diámetro
aproximado de 1 mm o menor, las cuáles no son fácilmente
perceptibles a simple vista; colonias medianas con un diámetro de
entre 1 y 3 mm y colonias grandes con diámetros mayores a 3 mm.
Estas dos últimas pueden identificarse a simple vista sin ninguna
dificultad, sin embargo, para evaluar colonias pequeñas, es necesario
el uso de instrumentos ópticos como el microscopio estereoscópico o
la lupa para contar colonias (cuentacolonias).
Forma
Circular: forma redondeada simétrica sin prolongaciones periféricas.
Irregular: forma no simétrica compacta con prolongaciones periféricas
pequeñas.
Lobulada: forma muy irregular con prolongaciones extensas en forma
de lóbulos, generalmente son muy grandes.
Bordes
Completo: los bordes son lisos y planos.
Ondulado: con bordes redondeados.
Lobulado: con bordes dentados.
49
UNAM
Elevación
Se refiere a la altura de las colonias sobre la superficie de agar.
Plana: sin elevación.
Convexa: elevada con apariencia de domo.
Mamelonada: con muchas elevaciones irregulares de la colonia en
toda su superficie.
Umbilicada: con una sola elevación central más prolongada que el
resto de la colonia (aspecto de huevo frito).
Pigmentación
Los microorganismos llamados cromogénicos pueden producir
pigmentos con diferente localización.
Pigmentos intracelulares: son los responsables de la coloración de sus
colonias.
Pigmentos extracelulares: son los que aparte de pigmentar la colonia,
pueden difundir en el medio y pigmentar un área alrededor de la misma
(halo) o en ocasiones todo el medio.
Las colonias de microorganismos que no producen pigmentos se
observan transparentes, blancas o grisáceas.
50
UNAM
Figura 3. Características de la morfología colonial bacteriana.

Guille, A., (2020) Morfología colonial. Recuperada el 24 de agosto de 2022 de
https://dingmicrolab.wordpress.com/2020/10/12/morfologia-colonial/
51
UNAM
Procedimiento (segunda sesión)
Material por equipo:
✓ Microscopio estereoscópico.
✓ Cajas sembradas por dilución de colonias (sesión anterior).
✓ Encendedor.
✓ Desinfectante.
✓ Franela.
1.- Coloque la caja con colonias aisladas (sembrada la sesión anterior)

en el microscopio estereoscópico y examine las características
anteriormente descritas en las colonias obtenidas.
2.- Con base en las características de cada colonia de las distintas

cepas que se utilizaron en el laboratorio, llene el siguiente cuadro de
resultados:
52
UNAM
CEPA TAMAÑO FORMA BORDES ELEVACIÓN PIGMENTACIÓN
Discusión
Conclusiones
53
UNAM
Autoevaluación
1.- ¿Por qué es necesario hacer técnicas de dilución de colonias?
2.- ¿Qué problemas encontró en la realización de la técnica de

dilución de colonias?
3.- ¿Por qué es importante la evaluación de la morfología colonial?
54
UNAM
4.- ¿Cuáles son las características de morfología colonial que te

parecieron más difíciles de evaluar?
Referencias
1.- Aquiahuatl R.M.A., Volke S.T., Prado V.L., Shirai M.K., Ramírez
V.F., Salazar V.M. (2012). Manual de prácticas de laboratorio:
Microbiología general. Universidad Autónoma Metropolitana. México
D.F.
2.- Lagunas B.S., Vega C.L.F. (2013). Manual de Prácticas de

Laboratorio de Bacteriología y Micología. Facultad de Medicina
Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autónoma del Estado de
México. Toluca, México.
3.- Bradshaw J. (1976). Microbiología de laboratorio. Manual

Moderno, México D.F.
55
UNAM
Practica 6: Técnicas de tinción para bacterias.
Objetivo
El alumno identificará algunas formas y estructuras bacterianas como

pared, esporas y cápsula utilizando diferentes técnicas de tinción.
Introducción
En los inicios de la Bacteriología, se realizaban principalmente

tinciones básicas con un solo colorante para observar y tratar de
clasificar a esas formas de vida antes desconocidas. Cuando se
observó que muchos microorganismos no se tiñen fácilmente, se
perfeccionaron técnicas de tinción más complejas y en la actualidad,
muchas de ellas las seguimos empleando de forma rutinaria en el
laboratorio. En el proceso de identificación bacteriana, uno de los
pasos iniciales es realizar técnicas de tinción para determinar si
nuestro cultivo está puro, visualizar su morfología, agrupación y tipo de
pared de la bacteria: Gram positiva, Gram negativa, o ácido alcohol
resistente.
Las tinciones se pueden clasificar en:
Diferenciales: clasifican al microorganismo con base en la estructura

bioquímica de su pared celular. Dentro de éstas se encuentran las
tinciones de Gram y ácido alcohol resistentes (Ziehl-Neelsen).
56
UNAM
Estructurales: tiñen o evidencian a una estructura en particular como

las tinciones de esporas (Schaeffer y Fulton) y cápsula.
Tipos de tinción
Tinción de Gram
Esta tinción es rutinaria en cualquier laboratorio de Bacteriología, las

bacterias Gram positivas en su pared tienen mayor cantidad de
peptidoglicano que atrapa el complejo cristal violeta-yodo (lugol)
tomando una coloración azul-morado. Las bacterias Gram negativas,
poseen en la estructura de su pared una menor cantidad de
peptidoglicano y tienen una membrana externa que limita la asociación
del complejo cristal violeta-yodo a ésta. Al aplicar acetona a estas
bacterias, se elimina este complejo azul/morado y cuando se emplea
safranina como colorante de contraste, se tiñen de color rojo/rosado.
La información que obtenemos de esta técnica es:
1. Clasificación de las bacterias: Gram positivas (color

azul/morado) o Gram negativas (color rojo/rosado).
2. Forma de la bacteria: coco, bacilo, cocobacilo, etc.
3. Agrupación bacteriana: racimos, cadenas, tétradas, pares,
empalizadas, etc.
57
UNAM
Tinción para bacterias ácido alcohol resistentes (Técnica de Ziehl-

Neelsen).
Las bacterias ácido alcohol resistentes (B.A.A.R.) tienen una pared

celular con un alto contenido de lípidos (ácidos micólicos) que impiden
el paso de colorantes con los métodos rutinarios de tinción, motivo por
el cual se desarrolló esta técnica. Aplicando calor se asegura que el
colorante primario penetre la pared y permanezca dentro, aun cuando
son sometidas a una decoloración exhaustiva con alcohol ácido (una
mezcla de ácido clorhídrico y etanol) conservando una coloración
roja/púrpura.
El género Mycobacterium pertenece a este grupo de bacterias; el

género Nocardia es parcialmente ácido alcohol resistente,
empleándose para su identificación una variante llamada tinción de
Kinyoun.
Tinción de esporas (Técnica de Schaeffer y Fulton)
La espora bacteriana es una estructura de resistencia formada por

varias capas que le permite a bacterias de los géneros Bacillus,
Paenibacillus y Clostridium, sobrevivir a condiciones muy adversas
como desecación, radiaciones, falta de nutrientes, cambios de pH,
presencia de oxígeno, etc. Por esta característica, la espora es muy
difícil de teñir, no obstante, la técnica de Schaeffer y Fulton permite al
colorante primario (verde de malaquita) penetrar las capas de la espora
aplicando calor (vapor de agua) y al enfriarse, ya no permiten la salida
58
UNAM
del colorante cuando se enjuaga el frotis. Para contrastar a la espora,

el cuerpo bacteriano se tiñe con safranina para su fácil apreciación.
Algunas esporas se pueden encontrar dentro del cuerpo bacteriano

(endosporas) y presentan tres características que pueden ayudar a
identificar el microorganismo: forma de la espora (esférica, ovoide o
cilíndrica), posición (central, subterminal o terminal) y si es deformante
o no (cuadro 1). Cuando el cultivo tiene más tiempo, generalmente
encontramos a las esporas fuera del cuerpo bacteriano.
Forma Posición
Esférica Terminal
Deformante
Ovoide
Subterminal
Cilíndrica No deformante
Central
Edna M. Legaspi (2016)

Cuadro 1.- Forma y distribución de esporas bacterianas.
Tinción de cápsula (Tinción negativa)
La cápsula bacteriana es una estructura externa que generalmente

está constituida de polisacáridos, esta estructura principalmente ayuda
a la bacteria a evitar la fagocitosis, pero también le ayuda a adherirse
a las superficies y formar biopelículas (biofilms).
La tinción para demostrar la presencia de cápsula se realiza cuando la

morfología de la colonia bacteriana es de aspecto liso (mucoide y
59
UNAM
brillante) sugerente de que el microorganismo es capsulado. La

cápsula no se tiñe fácilmente con colorantes, por lo que se emplean
otras técnicas para su observación. En la tinción negativa se emplea
la tinta china que tiene carga negativa; este colorante al estar en
contacto con la cápsula que también tiene carga negativa, es repelido
ocasionando que se vea un espacio translúcido alrededor de la
bacteria en un fondo negro de la tinción.
Que el alumno sea capaz de realizar un frotis bacteriano, aplique las

cuatro técnicas de tinción convencionales para bacterias, las observe
e interprete.
Procedimientos
✓ Cultivos bacterianos ✓ 1 mechero Bunsen

✓ 1 asa de inoculación ✓ 1 tripié
✓ 1 tubo de ensaye con agua ✓ 1 base de caja Petri
✓ 1 frasco gotero con cristal ✓ 1 varilla de vidrio con
✓ 1 frasco gotero con lugol ✓ 1 rejilla de asbesto
✓ 1 frasco gotero con acetona ✓ 1 pinza de madera
✓ 1 frasco gotero con safranina ✓ 1 encendedor
✓ 1 frasco gotero con carbol ✓ 1 franela
✓ 1 frasco gotero con alcohol ✓ 1 atomizador con
✓ 1 frasco gotero con verde de ✓ 1 marcador indeleble
60
UNAM
✓ 1 frasco gotero con tinta ✓ 1 microscopio óptico

✓ 4 portaobjetos ✓ Papel limpia lentes
✓ 1 cubreobjetos ✓ Aceite de inmersión
✓ 2 cuadros de papel filtro ✓ 1 microscopio óptico
Preparación de un frotis bacteriano
Para poder realizar cualquier tinción se deben fijar las bacterias a un

portaobjetos de la siguiente forma:
1.- Transferir con el asa de inoculación una o dos gotas de agua

destilada.
2.- Esterilizar el asa, enfriarla y tomar del cultivo una colonia

bacteriana.
3.- Mezclar con el asa, el agua con la colonia bacteriana y extender en

forma circular la preparación.
4.- Esterilizar el asa y colocar sobre la mesa.
5.- Pasar la preparación cuatro veces por la flama azul del mechero de
Bunsen, para fijar las bacterias y dejar secar junto al mismo.
6.- Una vez seca la preparación, se puede realizar la técnica de tinción.
Tinción de Gram
1.- Elaborar un frotis fijo a partir del cultivo.
2.- Cubrir el frotis con el cristal violeta (colorante primario) durante un

minuto.
61
UNAM
3.- Enjuagar con agua corriente el exceso de colorante del frotis.
4.- Sin secar, cubrir el frotis con el lugol (mordiente) y dejarlo un minuto.
5.- Decantar el lugol sin enjugar.
6.- Aplicar sobre el frotis acetona (decolorante) y deja actuar tres

segundos, una vez transcurrido el tiempo, inmediatamente enjuagar
con agua corriente.
7.- Cubrir el frotis con safranina (colorante de contraste) durante un

minuto.
8.- Enjuagar con agua corriente el exceso de safranina.
9.- Secar la preparación y observar al microscopio en objetivo de

inmersión (100x).
Tinción para bacterias ácido alcohol resistentes
1.- Colocar encima del tripié la rejilla de asbesto y la base de la caja de

Petri con la varilla de vidrio dentro.
2.- Agregar agua corriente a la caja de Petri sin que rebase el nivel de
la varilla de vidrio.
3.- Elaborar un frotis fijo a partir del cultivo bacteriano.
4.- Colocar el frotis sobre la varilla. Poner encima el papel filtro y

agregarle carbol fucsina (colorante primario) hasta que se humedezca
completamente.
62
UNAM
5.- Acercar el mechero por debajo de la caja hasta que el agua se

caliente y emita vapor. A partir de la emisión de vapor se cuentan 10
minutos. Durante la emisión de vapor se debe vigilar que el agua no
ebulla (si esto sucede, alejar el mechero del tripié) y que no se seque
el colorante, si es necesario agregar más colorante para que el papel
filtro permanezca húmedo durante todo el proceso.
6.- Quitar el papel filtro del frotis y desechar en el contenedor

correspondiente.
7.- Con la pinza, tomar la laminilla y con agua corriente eliminar el

exceso de colorante del frotis.
8.- Sin secar, aplicar alcohol ácido hasta que el líquido que escurra sea
claro.
9.- Eliminar con agua corriente el exceso de alcohol ácido, en este

paso debe observarse particularmente que el frotis siga orientándose
hacia arriba para continuar la tinción.
10.- Aplicar sobre el frotis el verde de malaquita y dejar actuar un

minuto
11.- Una vez transcurrido el tiempo, inmediatamente enjuagar con

agua corriente.
12.- Secar la laminilla.
13.- Observar al microscopio en objetivo de inmersión (100x).
63
UNAM
Tinción de esporas
1.- Colocar encima del tripié la rejilla de asbesto y la base de la caja

Petri con la varilla de vidrio dentro.
2.- Agregar agua corriente a la caja sin que rebase el nivel de la varilla
de vidrio.
3.- Elaborar un frotis fijo a partir del cultivo bacteriano.
4.- Colocar el frotis sobre la varilla, poner encima el papel filtro y

agregar verde de malaquita (colorante primario) hasta que se
humedezca completamente.
5.- Acercar el mechero por debajo de la caja hasta que el agua se

caliente y emita vapor. A partir de la emisión de vapor, se cuentan cinco
minutos. Durante la emisión de vapor, se debe vigilar que el agua no
ebulla (si esto sucede, alejar el mechero del tripié) y que no se seque
el colorante, si es necesario, agregar más colorante para que el papel
filtro permanezca húmedo durante todo el proceso.
6.- Quitar el papel filtro del frotis y desecharlo en el contenedor

correspondiente.
7.- Con la pinza, tomar la laminilla y con agua corriente eliminar el

exceso de colorante del frotis, en este paso debe observarse
particularmente que el frotis siga orientándose hacia arriba para
continuar la tinción.
8.- Aplicar sobre el frotis la safranina y deja actuar un minuto.
64
UNAM
9.- Enjuagar con agua corriente.
10.- Secar la laminilla.
Tinción de cápsula en fresco
1.- Con el asa de inoculación, transferir dos gotas del cultivo líquido a
un portaobjetos limpio.
2.- Depositar una gota de tinta china encima y colocar un cubreobjetos

sobre la preparación.
Al finalizar la observación de cualquiera de las tinciones, se deben

desechar las laminillas en el contenedor correspondiente.
65
UNAM
Resultados
Tinción de Gram Tinción de Bacterias

Tipo de pared: ácido alcohol resistentes
Forma: Resultado:
Agrupación:
Tinción de esporas Tinción de cápsula

Resultado: Resultado:
66
UNAM
Discusión
Conclusiones
Autoevaluación
1.- ¿Cuál es el fundamento de la tinción de Gram?
2.- El cristal violeta se fija al peptidoglicano de las bacterias Gram

positivas gracias a la adición de:
67
UNAM
3.- El agente decolorante de las bacterias Gram negativas en la

tinción de Gram es:
4.- En la tinción de Ziehl-Neelsen las bacterias que no son ácido-

alcohol resistentes se tiñen de color:
5.- ¿Por qué la cápsula no se tiñe?
6.- Cuando la espora está dentro del cuerpo bacteriano recibe el

nombre de:
Referencias
1.- Tortora, G. J., Funke, B. R. & Case, C. L. 2013. Microbiology. An

Introduction. 11th Edition. Pearson. pp: 69-71
Recursos electrónicos
2.- Breakwell, D.P., Moyes, R.B. &. Reynolds, J.2009.Current Protocols
in Microbiology. Appendix 3I Differential Staining of Bacteria: Capsule
Stain. Recuperado el 11 de diciembre de 2015
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/9780471729259.mca03is15/
pdf
3.- Hughes,R.B., & Smith, A.C. 2008. Capsule stain protocols.
Recuperado el 23 de agosto de 2016 de
http://www.asmscience.org/content/education/protocol/protocol.3041
68
UNAM
4.- Hussey, M.A. & Zayaitz, A. 2008. Acid-Fast stain protocols.

5.- Hussey, M.A. & Zayaitz, A. 2008. Endospore stain protocols.
6.- Moyes,R.B., Reynolds, J. & Breakwell, D.P.2009.Current Protocols
in Microbiology.Appendix 3C Differential Staining of Bacteria : Gram
Stain. Recuperado el 08 de diciembre de 2015 de
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/9780471729259.mca03cs15
/pdf
7.- Reynolds, J., Moyes, R.B. & Breakwell, D.P.2009.Current Protocols
in Microbiology. Appendix 3H Differential Staining of Bacteria: Acid Fast
Stain. Recuperado el 11 de diciembre de 2015 de
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/9780471729259.mca03hs15
/pdf
8.- Reynolds, J., Moyes, R.B. & Breakwell, D.P.2009.Current Protocols
in Microbiology.Appendix 3J Differential Staining of Bacteria:
Endospore Stain. Recuperado el 11 de diciembre de 2015
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/9780471729259.mca03js15/
pdf
69
UNAM
Práctica 7: Pruebas primarias de identificación

bacteriana.
Objetivo:
El alumno identificará el género de una bacteria utilizando algunas

pruebas bioquímicas primarias (tinción de Gram, catalasa, oxidasa,
motilidad, oxidación fermentación y ácido de la glucosa).
Introducción:
En la bacteriología diagnóstica clásica la identificación bacteriana, que

consiste en determinar el género y especie al que pertenece una cepa
o aislamiento bacteriano, se realiza conociendo algunas
características fenotípicas que expresa la cepa en cuestión como sus
propiedades bioquímicas estructurales, metabólicas y de replicación.
Las pruebas primarias son aquellas que permiten, a partir de un cultivo
puro, la identificación del género bacteriano o de un grupo de géneros
bacterianos relacionados.
A continuación, se describe brevemente el fundamento de las pruebas

primarias que se realizarán en esta práctica:
Tinción de Gram: Como se vio en la practica 6, la mayoría de las

bacterias de interés veterinario pueden clasificarse como Gram
70
UNAM
positivas o Gram negativas, de acuerdo a la coloración adquirida con

la tinción. Adicionalmente, se puede establecer la morfología celular,
agrupación bacteriana y presuntivamente, la presencia de endosporas.
Catalasa: La catalasa es una enzima que permite a las bacterias que

crecen en un ambiente aerobio o anaerobio facultativo, desdoblar el
peróxido de hidrógeno (H2O2) que puede resultarles tóxico y que se
genera como subproducto de la fosforilación oxidativa en la generación
de ATP. El resultado de la acción de la catalasa sobre el peróxido de
hidrógeno es la producción de agua y oxígeno gaseoso. El oxígeno
liberado puede detectarse visualmente como un burbujeo cuando a
una colonia se le agregan unas gotas de peróxido de hidrógeno.
Oxidasa: La prueba detecta la presencia de la enzima oxidasa del

citocromo C, esta es la última enzima de la cadena de transporte de
electrones, la enzima cataliza la transferencia de electrones del
citocromo C al oxígeno molecular para la formación de agua. Para la
detección de la enzima en el laboratorio, se utiliza una solución acuosa
de NŃŃŃ´tetrametil-p-fenilendiamina o de NŃ´difenil-p-
fenilendiamina que al contacto con la enzima se oxidan y producen una
coloración morado-obscura o rosa respectivamente.
Motilidad: Un buen número de bacterias de interés veterinario son

móviles gracias a sus flagelos; existen dos métodos para evaluar esta
71
UNAM
característica: la observación directa en gota suspendida o la

observación indirecta por medio de la inoculación de medios
semisólidos.
Prueba de oxidación-fermentación (OF): Esta prueba se utiliza para

determinar el metabolismo oxidativo o fermentativo de la bacteria con
respecto a los carbohidratos. Se utilizan dos tubos de un medio
semisólido al que se le adiciona glucosa como carbohidrato de prueba
y azul de bromotimol como indicador de pH (medio de OF). Después
de la siembra, a uno de los tubos se le agrega vaselina para bloquear
el paso de oxígeno. El catabolismo de la glucosa acidifica el medio
tornándolo amarillo, si la bacteria sólo metaboliza la glucosa en
condiciones aerobias, se clasifica como oxidativa (O), en cambio si la
bacteria metaboliza la glucosa en condiciones sólo anaerobias o
facultativas (aerobias y anaerobias) se le clasifica como fermentativa
(F). Las bacterias que no degradan el azúcar en ninguna de las dos
condiciones se catalogan como no sacarolíticas.
Prueba de ácido y gas de la glucosa: Esta prueba determina la

capacidad de una bacteria de producir ácidos (ácido pirúvico, ácidos
tricarboxílicos, etc.) a partir del catabolismo de la glucosa con un
posible desprendimiento de CO2. Se utiliza un caldo amortiguado en
tubo con glucosa al 1% y un indicador de pH que puede ser rojo de
fenol o indicador de Andrade que cambian su coloración a amarillo o
rosa intenso respectivamente, cuando el medio se acidifica. El medio
72
UNAM
contiene un tubo más pequeño invertido llamado campana de Durham

que tiene como propósito capturar el gas (CO2) que producen algunas
bacterias por el catabolismo de la glucosa, por lo tanto, la presencia de
gas siempre es en presencia de acidez.
Que el alumno identifique mediante pruebas bioquímicas, el género o

el grupo de géneros al que pertenece una bacteria.
Procedimientos
Material por grupo:
✓ Un frasco con peróxido de hidrógeno al 3%

✓ Un frasco con solución acuosa al 1% de NŃŃŃ´tetrametil-p-
fenilendiamina o de NŃ´difenil-p-fenilendiamina
✓ Vaselina
✓ Un juego de reactivos para la tinción de Gram

✓ Un cultivo bacteriano puro
✓ Un mechero
✓ Un asa bacteriológica
✓ Aguja de inoculación
73
UNAM
✓ Un palillo de madera
✓ Un portaobjetos
✓ Una tira de papel filtro
✓ Una caja Petri
✓ Dos tubos con medio OF
✓ Un tubo con medio para ácido de la glucosa con indicador de
Andrade
Tinción de Gram
Cada equipo aplicará la tinción de Gram de acuerdo al procedimiento

descrito en la práctica 6 con su cultivo de bacterias y registrará el
resultado.
Resultados
Tipo de pared: Gram positivas o Gram negativas.
Forma: cocos, bacilos o cocobacilos.
Agrupación: con o sin agrupación.
74
UNAM
Prueba de catalasa
1.- Tomar con un palillo una colonia del cultivo cuidando de no acarrear
parte del medio de cultivo y colocarla en un portaobjetos limpio.
2.- Desechar inmediatamente el palillo en una solución desinfectante.
3.- Agregar a la colonia una gota de peróxido de hidrógeno al 3% y

observar durante unos segundos (figura 1).
4.- Registrar el resultado obtenido.
Resultados
Positivo: producción de burbujas en la preparación.
Negativo: ausencia de burbujas.
Figura 1: Resultados de la prueba de catalasa.
75
UNAM
Prueba de oxidasa
1.- Colocar una tira de papel filtro en una caja Petri e impregnar con
una solución acuosa al 1% de NŃŃŃ´tetrametil-p-fenilendiamina o
de NŃ´difenil-p-fenilendiamina.
2.- Con un palillo, tomar una colonia del cultivo y colocarla en la tira de
papel filtro impregnada cuidando de no acarrear parte del medio de
cultivo.
3.- Desechar inmediatamente el palillo en una solución desinfectante.
4.- Esperar hasta 20 segundos para la lectura y registrar el resultado

obtenido (figura 2).
5.- Desechar el papel impregnado en una solución desinfectante.
Resultados
Positivo: coloración morado o rosa (según el reactivo) en el punto de

contacto con la colonia.
Negativo: ausencia de color en el punto de contacto con la colonia.
Figura 2. Resultados de la prueba de oxidasa.
76
UNAM
Prueba de motilidad en gota suspendida
1.- Colocar una gota grande de agua destilada estéril sobre el

cubreobjetos.
2.- Colocar cuatro bolitas de plastilina del mismo tamaño en cada

esquina del cubreobjetos.
3.- Con el asa bacteriológica transferir bacterias del cultivo a la gota

cuidando de no dispersarla.
4.- Colocar el portaobjetos sobre las bolitas de plastilina y presionar

ligeramente para que se adhiera, posteriormente invertir la preparación
para lograr que la gota quede suspendida del cubreobjetos (figura 3).
5.- Montar la preparación en el microscopio óptico y observar la gota

con el objetivo 40x.
6.- Registrar el resultado.
Resultados
Positivo: bacterias con movimiento rectilíneo en diferentes direcciones.
Negativo: bacterias con movimiento Browniano.
77
UNAM
Prueba de óxidación-fermentación
1.- A partir del cultivo bacteriano, sembrar por picadura con la aguja de
inoculación dos tubos con el medio de OF.
2.- A uno de los tubos sembrados adicionarle vaselina cubriendo la

superficie y rotular como tubo F.
3.- Rotular el otro tubo como tubo O.
4.- Incubar ambos tubos a 37 °C por 24 horas.
5.- Realizar la lectura de la prueba.
Resultados:
Oxidativa (O): tubo O color amarillo, tubo F color verde.
Fermentativa (F): tubo F color amarillo independientemente del color

del tubo O.
78
UNAM
No fermentativa (-): Tubos O y F sin cambios de color.
Figura 4. Resultados de la prueba de OF (de izquierda a derecha): a) Fermentativa = F; b)

oxidativa = O; c) no sacarolítica = (-).
Prueba de ácido y gas de la glucosa
1.- A partir del cultivo bacteriano, transferir bacterias con el asa

bacteriológica al tubo con el medio para ácido de la glucosa inoculando
por agitación.
2.- Incubar a 37 °C por 24 horas.
3.- Realizar la lectura de la prueba (figura 5).
Resultados
Positivo a acidez: cambio de color a rosa intenso del medio de cultivo.
Negativo a acidez: medio con turbidez sin cambio de color.
Producción de gas: formación de burbuja en el tubo invertido de

Durham siempre acompañado de acidez.
79
UNAM
Figura 5. Resultados de la prueba de ácido y gas de la glucosa

MAMG
Resultados
Cada equipo anotará los resultados obtenidos y consultando las tablas

de los anexos 1 o 2, establecerá el género o el grupo de géneros al
que pertenece la cepa.
Prueba Resultado
Tinción de Gram, forma y agrupación.
Catalasa
Oxidasa
Motilidad
Ácido de la Glucosa
O/F
Género Bacteriano Identificado:
80
UNAM
Discusión
Compare sus resultados con los obtenidos por los otros equipos:
ÁCIDO Y
CEPA GRAM OXIDASA CATALASA O/F GAS DE LA RESULTADO
GLUCOSA
Conclusiones
81
UNAM
ANEXO 1: Tablas de identificación para bacterias Gram positivas.
82
UNAM
ANEXO 2: Tablas de identificación para bacterias Gram negativas.
83
UNAM
Autoevaluación
1.- Además de la tinción de Gram ¿Qué otras técnicas de tinción

podrían considerarse pruebas primarias?
2.- En cuanto a su metabolismo energético ¿Qué quiere decir que una

bacteria sea no fermentativa?
3.- Además de la prueba que se utilizó durante esta práctica ¿Existe

alguna otra forma de evaluar la motilidad bacteriana?
4.- ¿La enzima oxidasa del citocromo C forma parte del metabolismo
oxidativo o fermentativo?
Referencias
1.- Cowan and Steel. Manual for the identification of medical bacteria.
Second edition. Cambridge University Press, 1974.
2.- Markey, B., Leonard, F., Archambault, M., Cullinane, A., Maguire,
D. Clinical Veterinary Microbiology, 2nd Edition, Mosby Elsevier, 2013.
84
UNAM
Práctica 8: Identificación bioquímica de

enterobacterias.
Objetivo
El alumno identificará el género y se aproximará a la especie de una

enterobacteria utilizando pruebas bioquímicas secundarias (LIA, TSI,
SIM, MR-VP, citrato, urea, nitratos, malonato y gelatina).
Introducción
La familia Enterobacteriaceae comprende alrededor de 65 géneros, de

los cuales poco más de una docena se asocian frecuentemente a
infecciones en los animales domésticos. Las enterobacterias están
relacionadas a diferentes cuadros clínicos producidos en las especies
domésticas (cuadro1).
Las pruebas bioquímicas secundarias permiten identificar el género y

la especie de una bacteria desconocida por medio de su actividad
metabólica. Existen numerosas pruebas bioquímicas llevadas a cabo
en medios de cultivo adicionados con indicadores de pH para detectar
la producción de ácidos o álcalis, con inhibidores selectivos como
malonato o bilis, y/o con sales férricas que permiten la detección
85
UNAM
Cuadro 1.- Principales géneros de enterobacterias de importancia veterinaria.
GÉNERO CUADROS CLÍNICOS

• Diarrea toxicoinfecciosa (colibacilosis)
Escherichia • Mastitis ambiental (más frecuente)
• Infeccion urinaria (más frecuente)
• Infecciones en heridas
Salmonella • Disenteria
Shigella • Septicemias
• Mastitis ambiental
Enterobacter
• Infeccion urinaria
Klebsiella
• Infecciones en heridas
Proteus • Otitis en perros (Proteus)
Citrobacter
Morganella
Providencia • Infecciones secundarias en heridas.
Serratia
Hafnia
Yersinia
de ácido sulfhídrico. Las actividades que se evalúan con mayor

frecuencia son: capacidad para fermentar carbohidratos (glucosa,
lactosa, sacarosa), para catabolizar aminoácidos y urea, la producción
de enzimas hidrolíticas específicas como gelatinasa, etc. Las pruebas
bioquímicas secundarias pueden ser simples, obteniendo un solo
resultado positivo o negativo, o pueden ser múltiples, en las que se
obtiene más de un resultado (cuadro 2). A continuación, se describen
las características de las pruebas bioquímicas más comunes utilizadas
en la identificación de enterobacterias de interés veterinario.
86
UNAM
Cuadro 2.- Pruebas bioquímicas secundarias más comunes para la identificación de

enterobacterias.
MEDIO DE CULTIVO TIPO PRUEBA(S) Y RESULTADO(S)
Malonato Simple Crecimiento en presencia de malonato (+/-)
Urea Simple Desdoblamiento de la urea (+/-)
Citrato de Simons Simple Asimilación de citrato (+/-)
Caldo nitrato Simple Reducción de nitrato (+/-)
Gelatina Simple Licuefacción de la gelatina (+/-)
Caldo MR-VP* Producción de ácidos mixtos (+/-)

Simple
o
(Rojo de metilo, Voges-Proskauer) Producción de acetoína vía butilenglicol
Simple
(+/-)
Fermentación de carbohidratos (variable ver
cuadro 3)
TSI (Triple azúcar hierro) Múltiple
Producción de ácido sulfhídrico (+/-)
Producción de gas (+/-)
Producción de indol (+/-)
SIM (Sulfhídrico, indol, motilidad) Múltiple Motilidad (+/-)
Descarboxilación de lisina (+/-)
LIA (Agar lisina y hierro) Múltiple Desaminación de lisina (+/-)
*Se utiliza el mismo caldo para realizar una prueba simple u otra.
PRUEBAS SIMPLES
Citrato
Para esta prueba se emplea el medio de citrato de Simmons, que es

sólido, de color verde y en posición inclinada; contiene citrato de sodio,
una sal de amonio y azul de bromotimol como indicador de pH. Se
87
UNAM
determina si la bacteria es capaz de asimilar el citrato como única

fuente de carbono y sólo cuando la bacteria utiliza el citrato, utiliza
también la sal de amonio como fuente de nitrógeno produciendo
amoniaco. La transformación de amonio en amoniaco alcaliniza
fuertemente el medio volviéndolo de color azul intenso.
Urea
El caldo urea de Stuart es de color canela claro y contiene entre sus

principales componentes, urea y rojo de fenol como indicador de pH.
El inóculo para este medio debe ser muy denso para evitar resultados
falsos negativos. En esta prueba se determina la capacidad de una
bacteria para degradar la urea, formando dos moléculas de amoniaco
por la acción de la enzima ureasa, el amoniaco producido alcaliniza
fuertemente el medio de cultivo volviéndolo de color rosa intenso.
Malonato
Es un medio líquido de color verde, se inocula densamente por

agitación con el asa bacteriológica, contiene malonato de sodio y azul
de bromotimol como indicador de pH. Esta prueba detecta si la bacteria
es capaz de utilizar el malonato de sodio como única fuente de
carbono, con la alcalinidad resultante producto de la utilización del
amonio como fuente de nitrógeno (ver prueba de citrato). Si hay un
cambio del medio a color azul intenso la prueba es positiva.
88
UNAM
MR-VP
El caldo MR-VP es de color ámbar claro, sus principales componentes

son peptonas, glucosa y fosfato dibásico de potasio como
amortiguador con un pH de 7.2. Este medio no tiene indicadores de
pH. En el caldo MR-VP se pueden llevar a cabo independientemente
dos pruebas simples: la prueba de rojo de metilo (por sus siglas en
inglés: MR) o la prueba de Voges-Proskauer (VP) por lo que al inicio
se inoculan dos tubos de este medio. La prueba de MR detecta la
formación de ácidos mixtos (ácidos fuertes) a partir de la fermentación
de la glucosa, estos ácidos son: ácido láctico, ácido acético, ácido
fórmico y etanol y provocan una baja considerable del pH amortiguado
del medio a niveles por debajo de 4.5. El indicador rojo de metilo que
es color anaranjado vira a color rojo intenso cuando se agrega a un
medio en donde hay la presencia de ácidos mixtos. La prueba puede
leerse a partir de las 24 horas de cultivo.
Por otra parte, la prueba de VP detecta otro tipo de fermentación

llamada butilenglicólica, en la que se forma acetoína como metabolito
intermediario. La acetoína debe acumularse lo suficiente para poder
ser detectada, por lo que esta prueba se incuba durante al menos 48
horas. Pasado el tiempo de incubación, se agregan al medio los
reactivos alfa-naftol e hidróxido de potasio (KOH) al 40% los cuales
reaccionan con la acetoína y forman un complejo de color rojo en el
medio. Por lo general, una enterobacteria lleva a cabo un solo tipo de
fermentación, ya sea ácida mixta o butilenglicólica, por lo tanto, solo
da positivo a una de las dos pruebas.
89
UNAM
Nitrato
El caldo nitrato es un medio color ámbar claro, que se puede confundir

con el caldo MR-VP, por lo que se recomienda identificarlos en el
momento de su preparación. Se debe inocular densamente e incubar
el medio durante al menos 48 horas para evitar resultados falsos
negativos. Su ingrediente principal es el nitrato de potasio, extracto de
carne y peptonas. En este medio se determina la capacidad de una
bacteria para reducir el nitrato (NO3) a nitrito (NO2) o hasta nitrógeno
(N2) liberado del medio en forma de gas. Los reactivos ácidos
sulfanílico y alfa-naftilamina son adicionados al medio para formar un
complejo de color rojo con los nitritos resultantes de la reducción del
nitrato. Cuando no se forma el complejo rojo, se debe descartar la
posible reducción del nitrato a nitrógeno molecular (el cual no es
detectado por los reactivos), por lo que se adiciona polvo de zinc, el
cual transforma de forma inmediata el nitrato en nitrito con la
consecuente formación del complejo rojo con los reactivos
anteriormente adicionados.
Gelatina
El medio de gelatina es semisólido y contiene como componente

principal gelatina, no tiene indicador de pH. En esta prueba se
determina la capacidad de una bacteria de hidrolizar la gelatina,
volviendo al medio líquido. Para la lectura de la prueba se requiere
refrigerar los tubos antes de leerlos debido a que la gelatina se vuelve
90
UNAM
líquida a 37°C. La reacción positiva puede darse hasta dos semanas

posteriores a la inoculación.
PRUEBAS MÚLTIPLES
TSI (Triple Sugar Iron / Triple azúcar hierro)
Es un medio sólido inclinado de color anaranjado, que ofrece un fondo

en donde se llevan a cabo fermentaciones anaerobias de azúcares y
una superficie en donde se llevan a cabo degradaciones aerobias
sobre todo de peptonas. Se inocula por picadura al fondo y estría en la
superficie para cultivar a la bacteria en condiciones aerobias y
anaerobias. El medio contiene 3 azúcares: lactosa al 1%, sacarosa al
1% y glucosa al 0.1%, también contiene peptonas, sulfato de hierro y
amonio, y rojo de fenol como indicador de pH. Con este medio se
puede determinar la fermentación diferenciada de carbohidratos, la
producción gas y la producción de ácido sulfhídrico. Si la bacteria solo
tiene capacidad para fermentar la glucosa, la concentración limitada
de ésta en el medio produce que se genere acidez transitoria en fondo
y superficie, sin embargo, la degradación aerobia de peptonas en la
superficie alcaliniza esta parte del medio posteriormente. Lo anterior
genera un patrón de superficie alcalina (K)/fondo ácido (A) en el medio
(K/A). Si la bacteria tiene la capacidad de degradar lactosa y/o
sacarosa, entonces la abundante concentración de estos azúcares
produce acidez fuerte en todo el medio, la bacteria preferirá seguir
degradando azúcares antes de utilizar peptonas, por lo que no se
91
UNAM
genera alcalinidad en la superficie, dando un patrón A/A. Cuando una

bacteria no es capaz de degradar los azúcares, sólo degrada peptonas
generando un patrón K/K en el medio (figura 1).
La producción de gas se manifiesta como burbujas en el agar, ruptura

o desprendimiento del agar dependiendo de la cantidad producida. Si
la bacteria produce ácido sulfhídrico (H2S), este se combina con el
hierro del sulfato de hierro y amonio, formando un precipitado color
negro en el fondo o en la totalidad del medio, dependiendo de la
cantidad producida.
Figura 1.- Diferentes resultados en el medio TSI
SIM (Sulfhídrico, Indol, Motilidad / Sulphide Indole Motility)
Es un medio semisólido en tubo color amarillo ámbar, que contiene

tripteína (fuente de triptófano), sulfato ferroso y tiosulfato de sodio, se
inocula por picadura con aguja recta. Esta prueba se utiliza para
determinar la producción de H2S, la producción de indol y la
observación de la motilidad. El triptófano es un aminoácido
92
UNAM
constituyente de muchas peptonas (particularmente de la tripteína),

que puede ser oxidado por algunas bacterias para formar indol. En el
proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasas. El
indol producido puede ser detectado por el reactivo de Kovac o de
Ehrlich, para originar un compuesto de color rojo en la superficie del
tubo (anillo indólico). Las cepas móviles pueden apreciarse en este
medio por la turbidez que producen alrededor de la punción de
siembra, mientras que aquellas cepas productoras de ácido sulfhídrico,
se distinguen por la formación de un precipitado negro de sulfuro de
hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH
mayor a 7.2.
LIA (Lisina hierro agar / Lysine Iron Agar)
Es un medio sólido inclinado, de color lila claro, se inocula por picadura

en el fondo y estría en la superficie bajo el mismo principio de la prueba
de TSI. Tiene entre sus principales componentes lisina al 1%, glucosa
al 0.1% y púrpura de bromocresol como indicador de pH el cual es de
color amarillo en acidez y violeta en alcalinidad. En este medio se
puede detectar la descarboxilación o desaminación de la lisina y la
producción de H2S. La glucosa es un sustrato fermentable y la lisina
es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas
decarboxilasa o desaminasa. El citrato de hierro y amonio, así como el
tiosulfato de sodio, son los indicadores de la producción de ácido
sulfhídrico.
93
UNAM
La descarboxilación de lisina por acción de la enzima lisina-

descarboxilasa, debe ocurrir a un pH ácido, por lo que es necesario
que previamente la glucosa sea fermentada, produciendo acidez
transitoria del medio (color amarillo). Al llevarse a cabo la
descarboxilación de lisina se generará una diamina llamada
cadaverina que alcalinizará fuertemente el medio volviéndolo de color
violeta o morado intenso; en el caso de enterobacterias, esta reacción
de descarboxilación es visible a las 24 horas de incubación.
Los microorganismos que no producen lisina-descarboxilasa pero que

son fermentadores de glucosa, producen un viraje de la totalidad del
medio de cultivo al amarillo, sin embargo, a veces puede también
observarse un patrón K/A (superficie violeta/fondo amarillo) debido al
consumo de las peptonas. Algunos géneros como Proteus,
Providencia y algunas cepas de Morganella sp., desaminan la lisina
con una enzima diferente llamada lisina-desaminasa, esto produce
ácido alfa-ceto-carbónico, el cual, con la sal de hierro forma un color
rojizo (púrpura) en el medio. La producción de H2S, se visualiza por el
ennegrecimiento del medio debido a la formación de sulfuro de hierro
(figura 2).
94
UNAM
Figura 2.- Resultados en el medio LIA. Medio sin inocular (s/inoc); Resultado positivo a
descarboxilación (K/K); Resultado negativo a descarboxilación/desaminación (K/A); resultado
positivo a desaminación (R/A); Resultado negativo a descarboxilación y positivo a ácido sulfhídrico
y gas.
PRUEBAS IMViC Y SU UTILIDAD EN LA IDENTIFICACIÓN DE

ENTEROBACTERIAS
El IMViC es un conjunto de pruebas utilizadas para la identificación

rápida de géneros de enterobacterias. Se compone de cuatro pruebas:
Indol, Rojo de Metilo, Voges-Proskauer y Citrato. Los resultados se
expresan mediante símbolos de positivo o negativo (+ o -) según el
resultado de cada prueba, siguiendo siempre el orden establecido por
las iniciales del método (cuadro 3).
95
UNAM
IMViC
Bacteria
Indol MR VP Citrato
Escherichia coli + + - -
Salmonella enteritidis - + - +
Enterobacter sp. - - + +
Proteus sp. - + - +
Cuadro 3. Resultados IMViC
Que el alumno sea capaz de generar e interpretar los resultados de un

grupo de pruebas bioquímicas secundarias para la identificación del
género, y la especie de una enterobacteria.
Procedimiento
✓ Frasco gotero con rojo de metilo.

✓ Frasco gotero con alfa naftol.
✓ Frasco gotero con hidróxido de potasio al 40%.
✓ Frasco gotero con ácido sulfanílico.
✓ Frasco gotero con alfa-naftilamina.
✓ Polvo de zinc.
✓ Frasco gotero con reactivo de Kovac o Ehrlich.
96
UNAM
✓ Una cepa bacteriana.

✓ Asa de inoculación.
✓ Mechero.
✓ Desinfectante.
✓ Franela de limpieza.
✓ Un tubo con medio de citrato de Simmons.
✓ Un tubo con caldo urea.
✓ Un tubo con caldo malonato.
✓ Dos tubos con caldo MR-VP.
✓ Un tubo con caldo nitratos.
✓ Un tubo con medio TSI.
✓ Un tubo con medio SIM.
✓ Un tubo con medio LIA.
Inoculación de medios de cultivo líquidos (caldo urea, caldo

malonato, caldo nitrato y caldos MR-VP)

bacteriológica a cada tubo e inocular por agitación. Es importante para
estos medios hacer inóculos densos para evitar resultados falsos
negativos.
2.- Incubar en la estufa bacteriológica a 37 °C durante 24 horas los

tubos de urea, malonato y MR, e incubar por 48 horas los tubos de
nitrato y VP.
97
UNAM
Inoculación de medios de cultivo sólidos en tubo (citrato, TSI y

LIA)

bacteriológica e inocular por estría en la superficie al tubo de citrato.
En el caso de los medios de TSI y LIA, picar el fondo del agar con la
aguja de inoculación y posteriormente, estriar con la misma la
superficie inclinada del medio.
2.- Incubar en la estufa bacteriológica a 37 °C durante 24 horas los

tubos de citrato, TSI y LIA.
Inoculación de medios de cultivo semisólidos (SIM y gelatina)
1.- A partir del cultivo bacteriano, inocular por picadura hasta llegar casi
al fondo con la aguja de inoculación ambos medios de cultivo. En el
caso del SIM, es importante hacer la siembra en una sola línea para la
visualización óptima de la motilidad.
2.- Incubar en la estufa bacteriológica a 37 °C durante 24 horas el tubo

de SIM y el tubo de gelatina de 24 horas hasta 14 días.
Resultados
1.- Con la información del cuadro 2, interprete y anote los resultados

de sus pruebas bioquímicas.
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Tiempo de Indicador de pH o
Prueba Incubación Reactivo (s) Resultado
Citrato
Malonato
Urea
MR
VP
Nitratos
Gelatina
Inclinado/fondo
TSI H2 S
Gas
Motilidad
SIM H2 S
Indol
Descarboxilasa
de la lisina
LIA
H2 S
Gas
Enterobacteria identificada:
2.-Utilizando la información del cuadro 3 y con las tablas de

identificación del anexo 1, identifique el género y en su caso la
especie bacteriana de su cepa.
99
UNAM
Cuadro 2.- Interpretación de las pruebas bioquímicas secundarias utilizadas
PRUEBA RESULTADO POSITIVO RESULTADO NEGATIVO

Citrato Azul intenso Verde
Malonato Azul intenso Verde
Urea Rosa intenso Sin cambio de color
1ª Fase: agregar 3 gotas de ácido sulfanílico
y 3 gotas de alfa naftilamina
Nitrato Rojo Sin cambio (realizar 2ª fase)
2ª fase: agregar polvo de zinc
Sin cambio Rojo
Agregar 3 gotas de rojo de metilo
MR Rojo Sin cambio o ligero color
naranja
Agregar 3 gotas de alfa naftol y 3 gotas de KOH al 40%
VP Rojo Sin cambio o ligero color
naranja
Gelatina Refrigerar 15 minutos antes de la lectura
Líquido Sólido
Agregar 3 gotas de reactivo de Kovac o Ehrlich
Producción de Indol (medio de
SIM) Anillo rojo sobre la superficie
Sin cambio
del medio
Zona difusa de crecimiento
Sólo se observa la línea de
Motilidad (medio de SIM) que se propaga desde la
inoculación
línea de inoculación
Producción de ácido sulfhídrico Ausencia de
Ennegrecimiento del medio
(medios de SIM, LIA y TSI) ennegrecimiento
Burbujas de aire en el medio
Producción de gas (medios de
o separación del agar del Sin cambio
TSI y LIA)
fondo del tubo
Descarboxilación: Pico de Pico de flauta violeta
flauta violeta o morado (K)/fondo amarillo (A)
Descarboxilación/desaminación intenso (K)/fondo violeta o
ó
de la lisina (LIA) morado intenso (K).
Todo el medio amarillo
Desaminación: pico de flauta
rojo (R)/fondo amarillo (A)
100
UNAM
Cuadro 3.- Resultados de algunas enterobacterias en las pruebas de TSI y el grupo de pruebas
IMViC.
IMViC
Bacteria Inclinado/fondo H2S Gas
Indol MR VP Citrato
Escherichia coli Ácido/ácido - + + + - -
(A/A)
Alcalino/ácido - + - +
Salmonella enteritidis + +
(K/A)
Ácido/ácido - - + +
Klebsiella pneumoniae - -
(A/A)
Alcalino/ácido - + - +
Proteus sp. + -
(K/A)
101
UNAM
ANEXO 1.- Tablas de identificación para enterobacterias.
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103
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104
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UNAM
Autoevaluación
1.- ¿Qué actividad de la bacteria se evalúa con las pruebas

bioquímicas secundarias?
2.- ¿Por qué se utilizan indicadores de pH en algunas pruebas

bioquímicas?
3.- ¿La actividad de que enzimas se hace evidente en las pruebas de

indol, urea y nitratos?
4.- ¿Qué propósito tiene la adición de sales férricas en algunas

pruebas bioquímicas?
106
UNAM
5.- Comente brevemente a qué problemas se enfrentó para identificar

correctamente el género y la especie de la bacteria problema.
Referencias
1.- Cowan, S. T., Cowan, K. J. S., & Steel, K. J. (1979). Manual para la
identificación de bacterias de importancia médica (No. C QR 46.
C6818).
2.- MacFaddin, J. F. (2003). Pruebas bioquímicas para la identificación

de bacterias de importancia clínica. Ed. Médica Panamericana.
107
UNAM
PRACTICA 9: Identificación rápida de bacterias

(API 20E®) y evaluación de la sensibilidad a
antimicrobianos.
Objetivo
El alumno conocerá e integrará métodos rápidos de identificación

bacteriana y de determinación de la sensibilidad a diferentes
antimicrobianos con el fin de generar información útil para la
terapéutica.
Introducción
En la práctica veterinaria, el procedimiento bacteriológico más

solicitado en los laboratorios de diagnóstico es el aislamiento e
identificación bacteriana. Este estudio es complementado en la
mayoría de los casos con la determinación del perfil de sensibilidad
antimicrobiana de la bacteria problema. Lo anterior es indispensable
para la resolución del problema a tratar, de modo que permite la toma
de decisiones en la terapéutica a seguir y en las medidas de
prevención y control de la enfermedad. Por lo tanto, el procedimiento
comúnmente llamado “identificación con antibiograma” debe ser bien
conocido por los veterinarios para evitar en lo posible, fallas en su
realización o interpretación.
108
UNAM
Por otra parte, existen en el mercado sistemas estandarizados que nos

permiten una identificación más rápida y precisa de bacterias. Las
ventajas que tienen estos sistemas son: tiempos de conservación
prolongados (se hidratan al momento de usarlos), evitar la necesidad
de medios frescos, además de brindar resultados reproducibles y
confiables. El sistema API 20E® de BioMérieux ® (figura 1) es uno de
ellos, basado en pruebas bioquímicas para la identificación de
enterobacterias y otros bacilos Gram-negativos. Consta de 20
micropruebas estandarizadas, más una a tres pruebas adicionales y
una base de datos.
El sistema API 20E® es una tira de plástico con 20 cápsulas, cada una
tiene una cúpula y un tubo (figura 1). Cada cápsula contiene los
sustratos deshidratados de una prueba bioquímica. Se inoculan con
una suspensión bacteriana que al mismo tiempo rehidrata los medios
y después de incubar el sistema se observan cambios de color en las
cápsulas, algunas de ellas, necesitan la adición de algún reactivo. La
interpretación de cada reacción (+ o -) se hace de acuerdo con una
tabla de lectura (cuadro 1), los resultados del sistema son
transformados a un código numérico y la identificación se hace
mediante la consulta del código generado en un banco de datos
suministrado por el fabricante (Analytical Profile Index API 20E ®) o
mediante un software (Apiweb®).
109
UNAM
Figura 1.- Sistema API 20E.
Un antimicrobiano es una sustancia natural producida por un

microorganismo (antibiótico) o a una obtenida por síntesis química
(quimioterapéutico) que tiene acción tóxica selectiva sobre funciones o
estructuras de otro microorganismo.
A lo largo de décadas se ha hecho uso indiscriminado de los

antimicrobianos, lo que ha propiciado la aparición de cepas resistentes
a los mismos, provocando con ello fallas en los tratamientos. Por lo
anterior, es necesario la determinación de la sensibilidad de una
bacteria a diferentes antimicrobianos para poder seleccionar el más
adecuado para la terapéutica.
Existen diversos métodos para medir in vitro la susceptibilidad

bacteriana a los antimicrobianos, el más rutinario en los laboratorios es
el método de difusión en agar de Kirby-Bauer, también conocido como
antibiograma. Este método es cualitativo y para su realización, se
utilizan discos de papel filtro impregnados con concentraciones
conocidas de diferentes antimicrobianos. Los discos se colocan sobre
la superficie de un agar Müeller-Hinton previamente inoculado con la
cepa problema. Los antimicrobianos difunden en el agar inhibiendo el
110
UNAM
crecimiento de bacterias susceptibles a ellos, lo anterior produce zonas

alrededor de los discos en donde no hay crecimiento bacteriano (halos
de inhibición). El diámetro del halo de inhibición de un antimicrobiano
está relacionado a la susceptibilidad de cada bacteria y sólo debe ser
comparado con valores de referencia para el mismo antimicrobiano. Lo
anterior permite determinar si la bacteria es: susceptible (S), resistente
(R) o si es intermedio entre valores de susceptibilidad y resistencia (I).
El error más común en la interpretación de un antibiograma, es la
comparación directa de los halos entre los antimicrobianos probados y
la selección del que produce el halo más grande, debido a que el
diámetro de cada halo está influido por la hidrosolubilidad del
antimicrobiano.
El medio Müeller-Hinton es uno de los más utilizados para la

realización de los antibiogramas debido a que la mayoría de las
bacterias no exigentes crecen bien en este medio, no tiene inhibidores
de crecimiento y no contiene sales que interfieran con la actividad de
los antimicrobianos. El inóculo bacteriano empleado en la prueba se
prepara en una solución salina estéril o caldo de cultivo, debe ser
estandarizado para garantizar la repetibilidad y confiabilidad de los
ensayos.
Que el alumno conozca el sistema API 20E® e identifique con base en

los resultados de sus pruebas, una enterobacteria.
Que el alumno realice e interprete un antibiograma.
111
UNAM
Procedimientos
✓ Dos sistemas de identificación ✓ Polvo de zinc.

API 20E®.
✓ H2O2 al 1.5%.
✓ Dos jeringas de 5 ml.
✓ Aceite mineral.
✓ Tubo de 0.5 del nefelómetro de
McFarland.
✓ Multidiscos comerciales
✓ Tubo 5 ml solución salina
(determinada por el
fisiológica.
profesor).
✓ Tubo 5 ml de agua destilada. ✓ Tubos despachadores con
unidiscos conteniendo
✓ Cloruro férrico al 10%.
diferentes antimicrobianos
✓ Reactivo Kovac o Ehrlich.
(determinado por el
✓ Hidróxido de potasio al 40%. profesor).
✓ Alfa naftol.
✓ Ácido sulfanílico.
✓ Alfa naftilamina.
✓ Un mechero bunsen. ✓ Un medio de Müeller

Hinton.
112
UNAM
✓ Un frasco con desinfectante ✓ Un tubo 0.5 del

(cloruro de benzalconio al Nefelómetro de McFarland.
2%). ✓ Un tubo con 5 ml de SSF
✓ Una franela. estéril.
✓ Una lata conteniendo un ✓ Un calibrador Vernier.
encendedor, un marcador ✓ Un tubo con 3 ml de un
indeleble y unas pinzas de cultivo bacteriano (cepa
disección. bacteriana determinada
✓ Un hisopo de algodón por el profesor).
estéril.
Inoculación del sistema API 20E®
1.- Para preparar un sistema API 20E®, repartir 5 ml de agua en los

pozos de la base del sistema para proporcionar una atmósfera
húmeda.
2.- Colocar el sistema sobre la base.
3.- Comparar la turbidez del cultivo bacteriano con el estándar 0.5 de

McFarland, en caso de la que la turbidez sea mayor, transferir con la
jeringa poco a poco SSF hasta alcanzar la turbidez esperada.
4.- Sembrar la tira API 20E® con la suspensión bacteriana como se

indica a continuación (figura 2):
a) Llenar los tubos, pero no las cúpulas de las pruebas marcadas

con la letra A.
113
UNAM
b) Llenar los tubos y las cúpulas de las pruebas marcadas con la

letra B.
Figura 2.- Esquema de siembra del sistema API 20E®.

A. Cápsulas sembradas con inóculo sólo en el tubo.
B. Cápsulas sembradas con inóculo en tubo y cúpula.
C. Cápsulas sembradas con inóculo en el tubo y selladas con aceite
mineral en las cúpulas
c) Llenar los tubos con la suspensión bacteriana de las pruebas

marcadas con la letra C y después, la cúpula con aceite mineral
para generar una atmósfera anaerobia.
5.- Colocar la tapa del sistema e incubar a 35-37ºC durante 24 horas.
Resultados
1.- Pasado el tiempo de incubación, interpretar los resultados de las

reacciones que no requieren adición de reactivos conforme al cuadro
1 y anotarlos en la hoja de identificación del sistema API 20E ® del
anexo 1, como se observa en la figura 3.
2.- Si el microtubo de glucosa es negativo (azul), la bacteria debe ser

identificada con otros sistemas para bacterias no fermentadoras.
3.- Si el microtubo de glucosa es positivo (amarillo), continuar con la

identificación. Leer los resultados de las siguientes pruebas como se
indica:
114
UNAM
a) Añadir una gota de cloruro férrico al microtubo de TDA. La

aparición inmediata de un color marrón oscuro es resultado
positivo.
b) Añadir una gota de reactivo KOH y otra de alfa naftol al
microtubo de VP. Esperar cambio de color. Si es rojo o rosa es
positivo.
c) Añadir una gota del reactivo de Kovac al microtubo de IND y

esperar cambio de color. Un anillo rojo indica reacción positiva.
d) Observar si el microtubo de GLU tiene burbujas que indican la

presencia de gas nitrógeno. Añadir dos gotas de ácido sulfanílico
y dos gotas de alfa naftilamina, esperar dos a tres minutos.
Confirmar un resultado negativo al añadir polvo de zinc.
e) Añadir una gota de H2O2 a los microtubos de MAN, INO o SOR

(preferiblemente al que no tenga gas) esperar uno o dos minutos
para observar o no la formación de burbujas.
4.- Identificar la bacteria con base en los resultados de la siguiente

manera de acuerdo con el formato del anexo 1: las pruebas están
agrupadas en tripletes y se indica para cada una un valor de 1, 2 o 4.
En cada triplete se suman los números de las pruebas positivas para
generar un solo número. Como la tira API 20E ® consta de 20 pruebas
más la prueba de oxidasa, se obtiene un perfil numérico de 7 cifras
(figura 3). La identificación se realiza mediante una base de datos a
partir del número obtenido, ya sea en el catálogo de códigos del
sistema API 20E® o con la ayuda del software de identificación Apiweb
(Rodriguez 2005; Biomériux, 2010).
115
UNAM
Figura 3.- Registro de resultados y obtención del código numérico para la

identificación bacteriana en el sistema API 20E®.
116
UNAM
Cuadro 1.- Interpretación de resultados del sistema API20E®.
REACCIONES/ RESULTADO
PRUEBA SUBSTRATO
ENZIMAS NEGATIVO POSITIVO
Orto-nitro-fenil-
ONPG β-galactosidasa Incoloro Amarillo (1)
galactósido
ADH Arginina Arginina dihidrolasa Amarillo Rojo/naranja (2)
LDC Lisina Lisina descarboxilasa Amarillo Naranja
ODC Ornitina Ornitina descarboxilasa Amarillo Rojo/naranja (2)

Verde Azul verdoso/azul
(CIT) Citrato sódico Utilización de citrato
pálido/Amarillo (3)
H2S Tiosulfato sódico Producción de sulfhídrico Incoloro/gris Depósito negro
URE Urea Ureasa Amarillo Rojo/naranja
TDA Triptófano Triptófano deaminasa Amarillo* Marrón*
IND Triptófano Producción de indol Amarillo* Anillo rojizo*
(VP) Piruvato sódico Producción de acetoína Incoloro* Rojo-rosa

No difusión del Difusión de
(GEL) Gelatina de Kohn Gelatinasa
pigmento pigmento negro
GLU Glucosa Fermentación/Oxidación (4) Azul/verdoso Amarillo
MAN Manitol Fermentación/Oxidación (4) Azul/verdoso Amarillo
INO Inositol Fermentación/Oxidación (4) Azul/verdoso Amarillo
SOR Sorbitol Fermentación/Oxidación (4) Azul/verdoso Amarillo
RHA Ramnosa Fermentación/Oxidación (4) Azul/verdoso Amarillo
SAC Sacarosa Fermentación/Oxidación (4) Azul/verdoso Amarillo
MEL Melibiosa Fermentación/Oxidación (4) Azul/verdoso Amarillo
AMY Amigdalina Fermentación/Oxidación (4) Azul/verdoso Amarillo
ARA Arabinosa Fermentación/Oxidación (4) Azul/verdoso Amarillo

* Requiere la adición de reactivos
(1) Un amarillo muy pálido debe considerarse positivo
(2) Un color naranja pálido después de 24 horas de incubación podría considerarse
negativo
(3) La lectura debe hacerse en la cúpula (aerobiosis)
(4) La fermentación comienza en la parte inferior de los tubos, la oxidación en la superior
117
UNAM
Antibiograma
1.- Comparar la turbidez del cultivo bacteriano con el estándar 0.5 de
McFarland, en caso de la que la turbidez sea mayor, transferir con la
jeringa poco a poco SSF hasta alcanzar la turbidez esperada.
2.- Sumergir un hisopo estéril en el inóculo estándar y eliminar el
exceso de líquido presionándolo sobre la pared interna del tubo por
encima del nivel del líquido.
3.- Inocular la placa de agar Müeller-Hinton con el hisopo, empleando
la técnica de estría continua por toda la superficie del mismo en tres
direcciones distintas. Al final pasar el hisopo por todo el contorno del
agar.
4.- Dejar secar la placa unos minutos y después colocar los discos de
antibióticos (uni o multidiscos) sobre la superficie del agar utilizando
unas pinzas de disección estériles. Presionar ligeramente cada disco
para que se adhieran al agar. Los discos deben separarse al menos
20 mm entre sí y deben estar al menos a 15 mm del borde de la caja
(figura 4).
118
UNAM
Figura 4.- Colocación de los multidiscos (izquierda) o de los unidiscos (derecha) sobre el
agar Müeller-Hinton.
5.- Incubar la placa en posición invertida a 37°C por 18 a 24 horas.
Resultados
1.- Pasado el tiempo de incubación, medir los diámetros de los halos
de inhibición con una regla o un calibrador y expresar el resultado en
milímetros (figura 5).
Figura 5.- Medición correcta del halo de inhibición en el antibiograma.
119
UNAM
2.- Para cada antimicrobiano probado, clasificar la cepa como
resistente (R), intermedia (I) o sensible (S) dependiendo de lo que
indiquen los valores de referencia del cuadro en el anexo 2.
3.- Con la información obtenida de la práctica, contestar lo siguiente:
ANTIBIÓTICO DIAMETRO DEL HALO INTERPRETACION
120
UNAM
ANEXO 1: FORMATO PARA DETERMINACIÓN DEL CÓDIGO DE

IDENTIFICACIÓN, SISTEMA API 20E®
121
UNAM
ANEXO 2: VALORES (mm) PARA LA DETERMINACIÓN DE LA

SENSIBILIDAD/RESISTENCIA A DIFERENTES ANTIMICROBIANOS
ANTIMICROBIANO CODIGO CONCENTRACION RESISTENTE INTERMEDIO SUSCEPTIBLE
Amikacina AN/AK 30 g < 14 15-16 > 17
Amoxicilina AMX 20 g < 13 14-17 > 18
Ampicilina
Enterobacterias AM 10 g < 13 14-16 > 17
Staphylococcus sp. < 28 - > 29
Cefalotina CB/ CEP 100 g < 14 15-17 > 18
Ceftriaxona CX/CRO 30 g < 13 14-20 > 21
Cefuroxima CXM 30 g < 13 14-20 > 21
Ciprofloxacina CIP 5 g < 15 16-20 > 21
Cloranfenicol C/CL 30 g < 12 13-17 > 18
Dicloxacilina DC 1 g < 10 11-12 > 13
Enoxacina ENX 10 g < 14 15-17 > 18
Eritromicina E 15 g < 13 14-22 > 23
Estreptomicina S/SM 10 g < 11 12-14 > 15
Gentamicina GE/GEN 10 g < 12 13-14 > 15
Lincomicina LM 50g < 13 14-17 > 18
Netilmicina NET 30 g < 12 13-14 > 15
Penicilina P/PE 10 U < 28 - > 29
Polimixina B PB 30 U < 11 - > 12
Tetraciclina TE 30 g < 14 15-18 > 19

Ticarcilina con ácido
clavulánico
< 14 15-19 > 20
Enterobacterias TIM 10 g
< 14 - > 15
P. aeruginosa,
< 22 - > 23
Staphylococcus sp
Trimetoprim/
SXT 25 g < 10 11-15 > 16
sulfametoxazol
122
UNAM
Discusión
Bacteria identificada con el sistema API 20E®:
Perfil de sensibilidad:
Sugerencias para el tratamiento:
Conclusiones
123
UNAM
Autoevaluación
1.- ¿Por qué es importante realizar la identificación junto con el

antibiograma?
2.- ¿Cuál es la razón por la que se deben hacer antibiogramas?
3.- ¿Qué ventajas tiene el uso de sistemas comerciales como el API?
4.- ¿Por qué se utiliza el agar Müeller-Hinton para el antibiograma?
124
UNAM
Referencias
1.- Bio-Mérieux (2010) “API 20E sistema de identificación para

Enterobacteriaceae y otros bacilos Gram-negativos. No. 20100.
BioMérieux S.A. Francia. 24 pp.
2.- Díaz, R., Gamazo, C., & López, I. (2004). Manual Práctico de
Microbiología.Barcelona: Masson.
3.- Forbes, B., Sahm, D., & Weissfeld, A. S. (2009). Diagnóstico
Microbiológico.Argentina: Panamericana.
4.- García, P., Fernández, M., & Paredes, F. (2002). Microbiología
Clínica Aplicada.España: Díaz de Santos.
5.- Instructivo de uso. (s.f.). BIO-RAD.
6.- Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, Winn
WC. "Konemam Diagnóstico Microbiológico. Texto y Atlas en color". 6ª
ed. Ed. Médica Panamericana SA. Buenos Aires, 2006.
7.- Mac Faddin, J. F. 2003. Pruebas bioquímicas para la identificación
de bacterias de importancia clínica. 3ª edición Médica Panamericana.
México.
8.- Murray, P., Rosenthal, K., & Pfaüer, M. (2006). Microbiología
Médica. Madrid: Elsevier.
9.- Prescott, L., Harley, J., & Klein , D. (2004). Microbiología. España:
McGraw-Hill.
10.- Quinn, P., Carter, M., Markey, B., & Carter, G. R. (1994). Clinical
Veterinary Microbiology. Dublin: WOLFE.
11.- Rodríguez Cavallini, E.; Gamboa Coronado, María del Mar;
Hernández Chavarría, F. Bacteriología general principios y prácticas
de laboratorio. 1ª edición, Editorial de la Universidad de Costa Rica.
Costa Rica, 2005.
125
UNAM
PRÁCTICA 10: Aislamiento de bacterias

esporuladas.
Objetivo
El alumno aislará bacterias de los géneros Bacillus y Clostridium,

además verificará la abundancia de sus esporas en el ambiente y su
termoresistencia.
Introducción
Las bacterias formadoras de esporas generalmente se encuentran

distribuidas en la naturaleza como esporas en estado criptobiótico
(metabolismo completamente detenido), las cuales requieren de
condiciones especiales para su germinación. Algunas bacterias
esporuladas como las del género Clostridium, son también anaerobias
estrictas. Para realizar el cultivo de todas estas, es necesario utilizar
sistemas y medios de cultivos especiales que proporcionen las
características atmosféricas y nutricionales requeridas.
Aislamiento de bacterias anaerobias
La mejor forma de cultivar bacterias anaerobias estrictas es utilizando

campanas y estufas de anaerobiosis consistentes en equipos con
capacidad de cerrarse herméticamente y saturar su atmósfera interior
126
UNAM
al 100% con un gas inerte como CO2 o nitrógeno (figura 2A), la

principal desventaja de estos sistemas es su costo elevado. Otro
sistema ampliamente utilizado es la jarra Gas-Pak® (figura 2B), la cual
es una pequeña cámara hermética que generan anaerobiosis por un
sistema químico que consume el oxígeno de la jarra respectivamente.
A B
Aislamiento de bacterias esporuladas
Existen dos géneros de bacterias esporuladas de importancia

veterinaria: Bacillus y Clostridium. El género Bacillus se caracteriza por
tratarse de bastones Gram positivos agrupados en cadenas, aerobios,
catalasa positivos con esporas de formas ovoides o cilíndricas
centrales no deformantes. Clostridium es un género de bacilos Gram
positivos anaerobios estrictos no agrupados, catalasa negativos que
forma esporas subesféricas, subterminales o terminales deformantes.
El aislamiento de este tipo de microorganismos se logra exitosamente
aprovechando las características de termorresistencia que tienen las
esporas bacterianas.
Para el aislamiento, las muestras son calentadas aproximadamente a

100 °C por 10 minutos con lo que se logra la eliminación de bacterias
127
UNAM
vegetativas, quedando solo esporas en la misma. Posteriormente, la

muestra se siembra en cajas de agar para identificar las características
particulares de cada género. En el caso del género Bacillus los medios
pueden cultivarse en condiciones atmosféricas normales, sin embargo,
para el aislamiento del género Clostridium, se deben utilizar sistemas
o medios que generen anaerobiosis total.
Algunos medios de cultivo tienen entre sus componentes, sustancias

reductoras que generan químicamente un potencial oxido-reductivo
(REDOX) negativo con una consecuente anaerobiosis producto de la
inactivación química del oxígeno. Los medios más empleados para
anaerobios son el caldo tioglicolato y el medio modificado de
Robertson llamado también medio cooked-meat (carne cocida). En
este último, los pellets de carne que contiene el medio proporcionan
condiciones altamente reductoras debido a la gran cantidad de
aminoácidos azufrados y grupos sulfhidrilo que contiene la proteína de
la carne, además de la presencia de enzimas reductoras como la
glutianona. El medio favorece el desarrollo de bacterias anaerobias
independientemente de que formen esporas.
En el medio cooked-meat se pueden observar diferentes resultados: el

crecimiento se observa como turbidez del medio, en condiciones
anaerobias se puede observar también la formación de gas (elevación
de los pellets a la superficie), la digestión (desintegración) y el
oscurecimiento de la carne. El medio debe ser calentado para activar
sus condiciones reductoras, esto puede hacerse al mismo tiempo que
se lleva a cabo la eliminación de bacterias no esporuladas
128
UNAM
(vegetativas) sometiendo el medio ya sembrado con la muestra a

condiciones cercanas a los 100°C por unos minutos. El calentamiento
también produce la activación de las esporas para su germinación en
el medio y la expulsión de aire del tubo que refuerza las condiciones
de anaerobiosis.
Que el alumno identifique presuntivamente el género de bacterias

formadoras de esporas aisladas del ambiente y de la materia fecal.
Procedimiento
Material por grupo:
✓ Muestra de materia fecal de caballo y bovino.

✓ Frasco gotero con peróxido de hidrógeno.
✓ Tubos con un mililitro de solución salina fisiológica estéril

(SSF).
✓ Hisopo estéril.
✓ Agar nutritivo.
✓ Mechero.
✓ Varilla de vidrio en L.
129
UNAM
✓ Desinfectante y franela.
✓ Tren de tinción de Gram.
✓ Tren de tinción de esporas.
✓ Portaobjetos.
✓ Un tubo con medio cooked-meat.
✓ Recipiente para baño maría.
✓ Tripie.
✓ Palillos de madera.
✓ Una malla de asbesto.
✓ Pinzas planas.
Aislamiento de esporulados aerobios (Bacillus spp.)
1.- Humedecer el hisopo en la solución salina fisiológica y a

continuación, tomar la muestra de alguna superficie (piso, ventana,
marco de la puerta, mesas de trabajo, refrigerador, etc.).
2.- Sumergir el hisopo en el tubo con la solución salina fisiológica y

someter a baño maría en ebullición por 10 minutos.
3.- Remover el hisopo rodándolo por las paredes del tubo para extraer
todo el líquido, posteriormente vaciar la SSF en una placa de agar
nutritivo y dispersarlo homogéneamente con la varilla en L.
4.- Rotular la caja con los datos de la muestra e incubar a 37°C por 24-
48 horas.
5.- Después de la incubación, verificar el crecimiento. Buscar colonias

grandes de bordes lobulados y aspecto blanquecino opaco para
realizar la identificación.
130
UNAM
6.- Identificar el género mediante las siguientes pruebas (ver prácticas

anteriores):
a) Tinción de Gram.
b) Catalasa.
c) Tinción de esporas.
7.- Verificar la presencia de bastones grandes Gram positivos

agrupados en cadenas, catalasa positivos y con esporas centrales
ovales o cilíndricas no deformantes.
Aislamiento de esporulados anaerobios (Clostridium spp.):
1.- Transferir con las pinzas planas un fragmento de materia fecal (del
tamaño aproximado de una lenteja) al tubo de medio cooked-meat.
2.- Someter en medio a ebullición en baño maría por 10 minutos con

la tapa floja para expulsar el aire dentro del tubo y eliminar a las
bacterias vegetativas, al término del tiempo sacar el medio del baño
maría y cerrarlo completamente.
3.- Rotular el tubo con los datos de la muestra e incubar a 37°C por 48
horas.
4.- Pasado el tiempo de incubación, examinar el medio y verificar la

digestión de los pellets de carne y/o la formación de gas dentro del
tubo.
131
UNAM
5.- Abrir el tubo con el uso de guantes de forma cuidadosa para evitar
aerosoles por la presión de gas dentro del tubo.
6.- Con el asa bacteriológica, tomar muestras del fondo del tubo y
realizar dos frotis fijos en portaobjetos.
7.- Teñir uno de los frotis con Gram y el segundo con tinción de
esporas.
5.- Verificar la presencia de bastones grandes Gram positivos y con

presencia de espora terminal o subterminal deformante.
Resultados
Esquematice lo observado en la tinción de Gram:
Placas de agar nutritivo Medio cooked-meat
132
UNAM
Esquematice lo observado en la tinción de esporas:
Placas de agar nutritivo Medio cooked-meat
En la caja de agar nutritivo, de la misma colonia que realizó la tinción

de Gram, realice la prueba de catalasa.
Con todos los resultados obtenidos complete el siguiente cuadro:
133
UNAM
PRUEBA AGAR NUTRITIVO COOKED MEAT

Morfología colonial
(forma, bordes, elevación, ------
tamaño, color)
Catalasa ------
Gram
Esporas (forma y posición de

la espora)
Digestión ------
Gas ------
Oscurecimiento ------
Condiciones de cultivo
(aerobio o anaerobio)
Género (presuntivo)
Discusión
Conclusiones
134
UNAM
Autoevaluación
1.- ¿Por qué razón crecieron bacterias formadoras de esporas en el

agar nutritivo?
2.- ¿Qué diferencias encuentra entre los géneros Clostridium y

Bacillus?
3.- ¿Por qué crecen bacterias anaerobias en el medio de cooked-

meat?
4.- ¿Cuál es la importancia de saber que hay esporas bacterianas en

el ambiente?
135
UNAM
5.- ¿Qué importancia tiene saber que hay bacterias formadoras de

esporas en la materia fecal de los animales domésticos?
Referencias
1.- Engelkirk, GP. Principles and practice of clinical anaerobic

bacteriology: A self-instructional text and bench manual. Belmont,
California, 1992.
2.- Finegold, SM. A clinical guide to anaerobic infections. Singapore,

1992.
136
UNAM
Práctica 11: Identificación de levaduras y

dermatofitos de importancia veterinaria.
Objetivos
El alumno realizará las técnicas de laboratorio rutinarias para el

diagnóstico de levaduras y dermatofitos de importancia veterinaria
Introducción
La micología es la ciencia que estudia a los hongos (Dominio: Eukarya,

Reino: Fungi). Estos se caracterizan por ser organismos eucariontes
uni o pluricelulares con cromosomas múltiples. Pueden tener
reproducción sexual, asexual o ambas, son aerobios, principalmente
acidófilos y su fuente principal de nutrición son los carbohidratos. El
medio general para el cultivo selectivo de los hongos es el agar
dextrosa de Sabouraud (SDA por sus siglas en inglés).
Morfológicamente, se clasifican en levaduras (unicelulares) y hongos
filamentosos (pluricelulares).
Las levaduras en general crecen a 37°C, producen colonias de aspecto

cremoso muy semejantes a colonias producidas por bacterias, se
identifican por medio de tinciones para ver la morfología y la realización
de pruebas metabólicas, como la fermentación y asimilación de
carbohidratos.
137
UNAM
Los hongos filamentosos también llamados mohos u hongos miceliales

crecen a 25°C, producen colonias muy grandes de aspecto
arborescente/filamentoso o pulverulento, con o sin pigmentación que
se le conoce como micelio aéreo y a la parte de la colonia que se
adentra en el medio de cultivo se le llama micelio vegetativo. Su
identificación se hace a través de la morfología a nivel microscópico,
principalmente de las estructuras que se encuentran en el micelio
aéreo (conidias e hifas).
Los hongos dimórficos son aquellos que pueden presentar forma

micelial o de levadura. Su forma depende de factores ambientales
como: temperatura (miceliales a temperatura ambiente y
levaduriformes a 37ºC), concentración de CO2, pH, presencia de
elementos como suero, etc. En esta práctica se estudiarán los hongos
más importantes productores de infecciones en los animales (micosis).
Candida albicans
Este microorganismo es comensal de muchos animales domésticos y

el hombre. La candidosis es la micosis oportunista más frecuente, es
una infección aguda o crónica de las mucosas, piel, uñas o tejidos
profundos, causada por levaduras de este género. Lo que determina
la adquisición de la candidosis es la presencia de factores de
oportunismo que predispongan a un individuo, por ejemplo: las
endocrinopatías, la antibioterapia prolongada, terapias
inmunosupresoras, estrés etc. En las especies domésticas se asocia a
138
UNAM
infecciones en mucosa intestinal y oral en aves, glándula mamaria en

bovinos, endometrio (por lo que también puede causar abortos) y
vejiga urinaria (cistitis) de diferentes especies.
C. albicans es un hongo dimórfico, como levadura tiene forma redonda

u ovalada, que se reproduce por blastoconidias; sus colonias son
blanco amarillentas, poco elevadas y de bordes bien definidos. En su
fase micelial, C. albicans produce una elongación que se conoce como
tubo germinativo (formado por el blastoconidio que no se desprende
de la célula madre), que se va alargando hasta formar una pseudohifa
y un pseudomicelio. Puede producir clamidosporas en medios
especiales como el medio de harina de maíz. Las clamidosporas son
estructuras redondas que se caracterizan por poseer una pared celular
gruesa, originada en un segmento de la pseudohifa, el cual se
redondea, engrosa y posteriormente se desprende. Se consideran
estructuras de resistencia (soportan el calor y la desecación) en
ambientes hostiles.
El diagnóstico en general se realiza por aislamiento e identificación de

la levadura en medio SDA. Existen medios específicos para C. albicans
como el agar Biggy, en donde la levadura produce colonias de color
café marrón debido a la reducción del citrato de bismuto amónico y
sulfito de sodio que contiene el medio. Las pruebas más comunes que
se realizan son la prueba de tubo germinativo, la producción de
clamidosporas, el crecimiento a pH de 1.5, entre otras.
139
UNAM
Malassezia pachydermatis
M. pachydermatis es una levadura de morfología ovalada, aunque

debido a su forma de reproducción por gemación unipolar,
frecuentemente da formas que recuerdan a un cacahuate o a una suela
de zapato. Es una levadura lipofílica (coloniza zonas de la piel con
secreción sebácea) que en los cultivos se caracteriza por no ser
lipodependiente. Se encuentra comúnmente en pliegues cutáneos,
áreas interdigitales, conducto auditivo externo y mucosa oral, perioral
y anal de perros sanos.
La dermatitis por Malassezia spp. en perros es generalmente una
complicación a procesos seborreicos, predispuesta por la presencia de
pliegues en la piel. También se han descrito otras patologías como
problemas de hipersensibilidad contra la levadura. El diagnóstico
generalmente se hace tomando un hisopado de la región seborreica
afectada el cual se frota en un portaobjetos y se tiñe con Gram para la
observación de las levaduras con su forma característica. También es
factible el aislamiento en agar SDA.
Cryptococcus neoformans
C. neoformans es una levadura esférica, tiene una cápsula

mucopolisacárida característica que permite su observación con
tinciones negativas o la tinción directa de mucicarmín de Mayer. La
cápsula aumenta el tamaño del diámetro de la levadura a unos 25 µm,
la observación de levaduras capsuladas en algunas muestras tiene
140
UNAM
alto valor diagnóstico presuntivo. C. neoformans se encuentra

habitualmente en heces de palomas y otras aves.
La criptococosis es una micosis poco frecuente, la levadura entra por

inhalación diseminándose a aparato respiratorio y posteriormente a
sistema nervioso central en perros y gatos principalmente. En los
gatos también es frecuente una presentación cutánea severa en la
cara. En equinos, ovinos y caprinos sólo afecta aparato respiratorio, y
en bovinos se suele asociar a problemas de mastitis. El diagnóstico
puede hacerse buscando levaduras capsuladas en líquido
cefalorraquídeo en casos de meningitis criptococócica. En otras
infecciones se puede hacer el aislamiento en medios específicos como
el agar Niger (base de alpiste) o agar con semillas de girasol.
Dermatofitos
A los géneros de hongos que infectan tejidos queratinizados

superficiales (piel, pelo, uñas, cuernos, plumas o lana), se les conoce
como dermatofitos. En medicina veterinaria sólo los géneros
Microsporum y Trichophyton están involucrados en la enfermedad
conocida como dermatofitosis. Lo característico de esta enfermedad,
es que produce zonas alopécicas circulares (alopecia areata) con o sin
prurito que puede llegar a extenderse a todo el cuerpo, la piel de la
zona afectada se ve engrosada y seca, a esta condición comúnmente
se le conoce como tiña. La mayoría de las especies conocidas del
género son productoras de tiñas en los animales (zoofílicos) aunque
existen especies que son propias del humano (antropofílicas), muchas
141
UNAM
especies zoofílicas son zoonóticas, por lo que deben extremarse

precauciones para el manejo de los animales sospechosos de
dermatofitosis, en la toma de muestras para el diagnóstico y en los
procedimientos de la identificación diagnóstica.
Los dermatofitos son hongos filamentosos constituidos de hifas y dos

diferentes tipos de conidias (estructura de reproducción asexual): las
microconidias, que son estructuras unicelulares pequeñas (forma
circular, claviforme, piriforme, ovalada, etc.) y las macroconidias, que
son de mayor tamaño, pluricelulares, fusiformes o naviculares con
extremos puntiagudos y curvados, tienen paredes gruesas y en el
interior hay de 6 a 10 segmentaciones. (figura 1).
Microconidia
Macroconidia
Figura 1. Macroconidias y microconidias del género Microsporum. Modificado de Medical-Labs

(www.medical-labs.net/terminology-related-to-morphologic-featuresof-molds-2788/)
Trichophyton spp. es un género de hongos que se caracterizan por

desarrollar micro y macroconidios de paredes lisas. En la mayor parte
142
UNAM
de los casos, las macroconidias están adheridas lateral y directamente

a la hifa o con un pedicelo corto. Pueden ser de paredes gruesas o
delgadas, en forma de basto, clava o fusiformes. Los microconidios
son pocos o están ausentes en muchas especies; los que se llegan a
observar son esféricos, piriformes, claviformes o irregulares (figura 2).
El diagnóstico de los dermatofitos puede hacerse de manera

presuntiva haciendo la observación de un raspado superficial de la
zona afectada (escamas y pelo), la muestra se aclara con KOH al 15%
antes de ser observada al microscopio y se requiere de cierta
experiencia para la observación de conidias o hifas en estas
preparaciones.
Otra técnica rápida de diagnóstico es el uso de la lámpara de Wood

(lámpara de luz ultravioleta) que se coloca sobre las lesiones
presuntivas de dermatofitosis, sólo el 50% de las infecciones
producidas por Microsporum canis emiten una fluorescencia verde-
amarillenta debida a metabolitos del triptófano producidos por el
hongo.
Para el aislamiento de dermatofitos se emplea el agar DTM

(Dermatofite Test Medium, por sus siglas en inglés), es un medio
selectivo que contiene como indicador de pH rojo de fenol. En este
medio, las colonias de dermatofitos se observan blancas o ligeramente
amarillentas y producen el cambio de color del medio a rojo en no más
de cinco días.
143
UNAM
Macroconidias
Figura 1. Macroconidias del género Trichophyton. Modificado de Medical mycology

(www.slideshare.net/mobile/mukhitkazi/medical-mycology)
Que el alumno conozca las pruebas más comunes para la

identificación de dermatofitos, Candida albicans, Malassezia
pachydermatis y Cryptococcus neoformans.
Procedimientos
✓ Suero equino.
✓ Tinta china.
✓ Laminillas de frotis con Malassezia pachydermatis.
✓ Laminillas de Cryptococcus neoformans.
✓ Laminillas de Trichophyton.
144
UNAM
✓ Laminillas de Microsporum.
✓ Frascos goteros con KOH al 15%.
✓ Lámpara de Wood.
✓ Tren de tinción de Gram.

✓ Medio de SDA.
✓ Una placa de agar harina de maíz.
✓ Medio de Biggy.
✓ Asa de inoculación de filamento circular.
✓ Pinza de disección.
✓ Mechero.
✓ Desinfectante.
✓ Portaobjetos y cubreobjetos.
✓ Microscopio óptico.
✓ Cultivo de Candida albicans.
✓ Muestra de pelo.
Inoculación de agar dextrosa Sabouraud (SDA) y el medio de

Biggy con Candida albicans
1.- A partir del cultivo proporcionado, inocular por técnica de estrías

cruzadas el medio de SDA.
2.- Inocular por técnica de estría continua el medio de Biggy.
3.- Incubar ambos medios de cultivo a 37°C durante 24 horas.

145
UNAM
4.- Posterior a la incubación, realizar tinción de Gram a partir de una

colonia desarrollada en el medio SDA y observar con el objetivo 40x.
Resultados
- Las colonias de Candida albicans en SDA son de color blanco

amarillento, poco elevadas y con bordes bien definidos.
- En el medio de Biggy, las colonias de Candida albicans crecen con

una coloración marrón brillante.
- En la tinción de Gram, las levaduras se observan moradas, de gran

tamaño, con forma redonda u ovalada y pueden observarse en estado
de gemación (blastoconidios).
Esquematice lo observado.
Tinción de Gram de Candida albicans
146
UNAM
Inoculación del agar clamidospora con Candida albicans.
1.- Inocular el medio de cultivo con una estría en el centro.
2.- Colocar encima un cubreobjetos estéril.
3.- Incubar 48 horas a 37°C.
4.- Transcurrido el tiempo de incubación, quitar la tapa de la caja Petri

y montar al microscopio (con ayuda del profesor) bajando totalmente
la platina para que los objetivos no contacten con el agar. Observar por
encima del cubreobjetos con los objetivos 10x y 40x.
Resultado
Se observan pseudohifas y las clamidosporas unidas a ellas.

Esquematice las estructuras observadas.
147
UNAM
Observación de tubo germinativo producido por Candida

albicans.
1.- Inocular por agitación, 2 ml de suero equino con Candida albicans.
2.- Incubar a 37°C durante 3 horas.
3.- Transcurrido el tiempo de incubación, transferir con el asa

bacteriológica de 2 a 3 gotas del suero y colocar un cubreobjetos
encima.
4.- Observar al microscopio la preparación con el objetivo 40x y regular

el diafragma para hacer un contraste.
Resultado
El tubo germinativo es una estructura elongada que se origina de la

levadura.
Esquematice lo observado.
148
UNAM
Observación de la morfología de Malassezia pachydermatis y la

tinción de cápsula en fresco para Cryptococcus neoformans.
1.- Montar en el microscopio la laminilla proporcionada por el profesor

de una tinción de Gram con Malassezia pachydermatis y observar con
el objetivo 40x.
2.- Montar en el microscopio la laminilla proporcionada por el profesor

con la tinción de cápsula en fresco de Cryptococcus neoformans y
observar con el objetivo 40x.
Resultado
Esquematice lo observado en cada preparación.
Tinción de Gram Tinción de cápsula

Malassezia pachydermatis Cryptococcus neoformans
149
UNAM
Observación de muestras de pelo con la lámpara de Wood
1.- El profesor proporcionará una muestra de pelo. Con la luz

apagada, irradiar la muestra con luz ultravioleta y observar si hay
fluorescencia de color verde amarillento (sospechosa de Microsporum
canis).
Observación microscópica directa de muestras de pelo con KOH

al 15%
1.- Sobre un portaobjetos limpio, colocar de dos a tres pelos de la

muestra proporcionada al equipo.
2.- Depositar una gota de KOH al 15% (aclarante) sobre el pelo y

colocar encima un cubreobjetos.
3.- Dejar reposar la preparación 10 minutos.
4.- Transcurrido el tiempo, observar los pelos al microscopio utilizando

el objetivo 10x y 40x regulando el diafragma para hacer contrastes.
Resultado
En una muestra positiva se observan conidias que dan una refringencia

verdosa dentro del pelo (endotrix o tricofítica) o en la periferia del
mismo (ectotrix o microspórica).
150
UNAM
Esquematice lo que observe en la preparación.
Observación de preparaciones con macroconidias de

Miscrosporum y Trichophyton.
1.- Colocar en el microscopio las preparaciones proporcionadas por el

profesor.
2.- Observar la muestra utilizando los objetivos de 10x y 40x e

identificar las características de las macroconidias de los géneros
Microsporum y Trichophyton.
151
UNAM
Resultados
Esquematice las estructuras observadas en cada preparación.
Microsporum sp. Trichophyton sp.
Discusión
152
UNAM
Conclusiones
Autoevaluación
1.- Anota ¿cuáles son los géneros de dermatofitos que afectan a los
animales?
2.- ¿Cuáles son los métodos rápidos de identificación de

dermatofitos?
3.- Escribe cuál tinción puedes utilizar para observar levaduras.
153
UNAM
4.- Anota las pruebas de laboratorio para poder identificar a Candida

albicans.
5.- Escribe dos medios de cultivo selectivos para Candida albicans.
6.- Anota qué muestras puedes enviar para el diagnóstico de

Malassezia pachydermatis en caninos.
Referencias
1.- Castañón,L.(2016, enero 4).Candidiasis o candidiosis,

Recuperado de
http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/micologia/candi
dosis.html
2.- Castellá,G., Abarca,L. & Cabañes,F.(2008). Criptococosis y
animales de compañía. Revista Iberoamericana de Micología, 25.
Recuperado de http://www.reviberoammicol.com/2008-
25/S19S24.pdf
3.- Guevara,M., Urcia,F. & Casquero,J. (2007). Manual de
procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los
principales hongos oportunistas causantes de micosis humanas.
154
UNAM
Recuperado de http://es.slideshare.net/AraceliAhumada/manual-
hongos
4.- Llovo,J. & Ponton,J. Diagnóstico microscópico de las micosis.
Asociación Española de Micología
http://www.guia.reviberoammicol.com/Capitulo14.pdf
5.- López, M.R. y col. 2004. “Micología médica, procedimientos para
el diagnóstico de laboratorio”.Editorial. Trillas, México.
6.- Rivas,A (2011, julio). Aspectos zoonóticos de la dermatofitosis
canina y felina. Revista del Colegio de Médicos Veterinarios de
Lara,2, 29-30 Recuperado de
http://revistacmvl.jimdo.com/suscripci%C3%B3n/volumen-
2/dermatofitosis/www.veterinaria.org/revistas/redvet/n050508/0508
09.pdf
155
UNAM
Práctica 12: Identificación de hongos filamentosos

contaminantes productores de micotoxinas.
Objetivo
El alumno identificará los géneros más importantes de hongos

filamentosos contaminantes y productores de micotoxinas en
preparaciones fijas.
Introducción
Las esporas reproductivas de algunos hongos se encuentran

ampliamente distribuidas en el ambiente, una cantidad considerable de
esporas forman parte del polvo que se mantiene en la superficie de
diferentes objetos. Bajo ciertas condiciones de humedad y
temperatura, las esporas pueden dar origen a colonias miceliales
(mohos) indeseables en lugares como laboratorios, hospitales,
bodegas, silos o instalaciones pecuarias. Los sitios en donde hay moho
se contaminan con millones de esporas reproductivas aumentando
considerablemente su carga en el polvo. En sitios altamente
contaminados basta con un poco de humedad en instalaciones o
equipos (refrigeradores, estufas, microscopios o equipos de anestesia
inhalada entre otros) para que se desarrollen nuevamente mohos y se
repita el ciclo.
156
UNAM
En el ámbito veterinario, la contaminación por hongos puede traer

diferentes consecuencias indeseables como micosis oportunistas,
contaminación de granos para alimentación animal y la presencia de
micotoxinas en los alimentos. Debido a su crecimiento lento y a su baja
exigencia nutricional, los hongos crecen en alimentos donde el
crecimiento bacteriano es poco probable. Condiciones como: bajos
niveles de pH, baja humedad, alto contenido en sales o carbohidratos,
baja temperatura de almacenamiento, la presencia de antibióticos, o la
exposición del alimento a la irradiación, pueden permitir el crecimiento
de hongos. Por lo tanto, pueden ser un problema potencial en
alimentos lácteos fermentados, frutas, bebidas de frutas, especias,
oleaginosas, granos, cereales y sus derivados.
Los granos forrajeros como el maíz, el sorgo y la cebada pueden

contaminarse con hongos de los géneros Fusarium, Alternaria,
Claviceps y Penicillum (entre otros) antes de la cosecha (hongos de
campo) o bien, pueden contaminarse pos-cosecha en almacenaje
principalmente por Aspergillus y Penicillum (hongos de almacén).
Cuando ya los granos están deteriorados por sobre-almacenaje, se
pueden contaminar con algunos hongos como Aspergillus fumigatus,
Rhizopus spp. y Mucor spp., entre otros. La contaminación de los
granos con hongos produce su deterioro y depreciación, sin embargo,
la consecuencia más grave de la presencia de hongos es la producción
de micotoxinas en los granos que al ser consumidas por los animales,
deterioran seriamente su salud.
157
UNAM
En esta práctica se estudiarán las características morfológicas de tres

géneros de hongos contaminantes comunes: Aspergillus, Penicillum y
Mucor, los dos primeros, importantes productores de micotoxinas.
Aspergillus sp.
Descripción de estructuras morfológicas del género:
− Hifa: unidad anatómica fundamental del hongo filamentoso, se

forman a partir de la germinación de una conidia. Aquellas que
se dividen en células individuales se denomina septadas y las
que no se dividen se conocen como aseptadas o cenocíticas.
− Conidióforo: hifa especializada o prolongación de la misma, que
soporta a las fiálides y conidias.
− Vesícula: prolongación del conidióforo en forma de burbuja.
− Métula: rama del conidióforo que da origen a fiálides.
− Fiálide: Son células conidiogénicas en forma de botella que
nacen del micelio. Las conidias emergen del interior de las
fiálides (fialoconidias) y son expulsadas cuando alcanzan su
madurez.
− Conidia: estructura de reproducción asexual originada a partir de
estructuras especializadas. Comúnmente se les llama esporas.
158
UNAM
Figura 1.- Características morfológicas del género Aspergillus (Modificado de

http://www.fba.org.ar/panel-gestion/InformeResultado/MI/mi12.htm)
Aspergillus es un género de hongos que se encuentra distribuido a

nivel mundial, especialmente durante el otoño e invierno en el
hemisferio norte. Varias especies de este género pueden causar
aspergilosis de vías respiratorias en bovinos y aves principalmente, así
como aborto micótico en rumiantes. La severidad de la aspergilosis
depende del estado inmunológico de los animales afectados.
Por otro lado, algunas especies del género producen micotoxinas en

granos para la alimentación animal (cuadro 1). Las aflatoxinas son las
micotoxinas más conocidas del género, son producidas principalmente
por A. flavus y A. parasiticus en granos como el maíz y frutos como el
159
UNAM
cacahuate. Otras micotoxinas relacionadas a este género son

ocratoxina producida por A. ochraceus y patulina producida por A.
clavatus.
ESPECIE CARACTERÍSTICAS CABEZA CONIDIAL
Colonia granulosa o pulverulenta

color verde gris.
Aspergillus
Conidióforos largos y cenocíticos,
clavatus
vesícula de gran tamaño con
aspecto claviforme que alrededor
posee solo una serie de fiálides.
Produce patulina.
Colonia plana, polvosa,

aterciopelada de color verde
amarillento brillante.
Aspergillus flavus
Vesículas esféricas con una o
dos series de fiálides en ángulo
de 360°. Hongo más importante
productor de aflatoxinas.
Colonia plana, polvosa, seca,
aterciopelada de color verde con
un halo blanco y ocasionalmente
rosa.
Aspergillus
fumigatus Conidióforos cortos y cenocíticos.
Vesículas subclávicas con una
serie de fiálides en un ángulo
aproximado de 180°.
Contaminante de granos
almacenados por largo tiempo.
Colonia plana, granulosa y de

color negro.
Conidióforos largos y cenocíticos.

Aspergillus niger Vesículas subesféricas con dos
series de fiálides en ángulo de
360°. Conidios negros. Hongo
contaminante de granos en
campo.
Cuadro 1.- Algunas especies de Aspergillus spp. contaminantes
y productores de micotoxinas.
160
UNAM
Penicillium spp.
Se pueden encontrar básicamente las mismas estructuras que en el

género Aspergillus, microscópcamente se observan ramificaciones del
conidióforo, las cuales soportan las métulas dándole una apariencia de
un pincel. Las ramificaciones pueden ser de uno (simple o
monoverticilado) o hasta de tres niveles (poliverticilado). Las fiálides
tienen forma de botella y los conidios son esféricos (figura 2). Las
cabezas conidiales ramificadas con métulas largas y conidios en
cadenas tienen una apariencia de “manos de esqueleto” que distingue
fácilmente al género (figura 3).
Figura 2.- Características morfológicas del género Penicillium (Modificado de

http://mycota-crcc.mnhn.fr/site/genreDetail.php?lang=eng&num=33&n=Penicillium)
El género Penicillum es ubicuo y está conformado por 354 especies

reconocidas. Algunos como P. notatum y P. chrysogenum son
productores de penicilina, muchas otras especies son contaminantes
161
UNAM
comunes de diferentes sustratos como granos, frutas, pajas, cueros,

etc. Son hongos contaminantes de almacén de granos forrajeros en
los que pueden producir micotoxinas como patulina, ocratoxina y
aflatoxinas. Las colonias son polvosas de apariencia aterciopelada de
color verde.
Figura 3.- Cabezas conidiales de Penicillum spp.
Mucor spp.
− Esporangióforo: hifa especializada que sostiene al

esporangio.
− Columela: estructura vesicular que se forma por prolongación
del esporangióforo y se encuentra dentro del esporangio.
− Esporangio: estructura membranosa en forma de bolsa o
saco, en cuyo contenido se alberga a las esporangiosporas.
− Esporangiosporas: esporas que se encuentran dentro de una
membrana o esporangio, cuando estas alcanzan su madurez,
la membrana se debilita y se liberan (figura 4).
162
UNAM
Figura 4.- Características morfológicas del género Mucor.

(Modificado de www.mold.ph/mucor.htm).
Género de hongos que se encuentran en el suelo, plantas, frutas y

vegetales en descomposición. Es ubicuo y un contaminante común de
laboratorio, sin embargo, puede producir infecciones en el hombre,
anfibios y ganado vacuno y porcino.
Figura 5.- Esporangio de Mucor sp.
163
UNAM
Medios de cultivo.
Para que un hongo crezca en un medio de cultivo se requiere una

fuente de carbono orgánico y de nitrógeno. Los medios de cultivo
para hongos tienen un pH ácido (5.6) para inhibir el crecimiento
bacteriano.
MEDIO DE CULTIVO CARACTERÍSTICAS
− Medio básico para el aislamiento de dermatofitos de

muestras cutáneas y levaduras de hisopados
vaginales.
Agar dextrosa Sabouraud − No recomendado como medio de asilamiento primario
(SDA) para hongos dimórficos.
− Al 2% se emplea para el subcultivo de hongos aislados
de medios enriquecidos para permitir la esporulación y
la morfología típica del hongo.
− Medio enriquecido que permite el crecimiento de la

Agar dextrosa papa
mayor parte de los hongos.
− Generalmente es agar dextrosa Sabouraud adicionado

con cicloheximida o cloranfenicol para inhibir el
Agar micosel o micobiótico
crecimiento de hongos y bacterias contaminantes.
− Empleado para el aislamiento primario de dermatofitos.
Agar Czapek − Para el subcultivo de hongos del género Aspergillus.
− Medio no selectivo que permite el crecimiento de

Agar infusión cerebro- cualquier hongo.
corazón (BHI) − Utilizado para el aislamiento primario de hongos
saprófitos y dimórficos.
Cuadro 2.- Medios más comunes para el cultivo de hongos.
Que el alumno identifique los géneros Aspergillus, Penicillium y

Mucor con base en sus estructuras morfológicas.
164
UNAM
Procedimientos
Material por grupo:
• Papel limpialentes

✓ Preparación fija de Aspergillus clavatus.
✓ Preparación fija de Aspergillus flavus.
✓ Preparación fija de Aspergillus fumigatus.
✓ Preparación fija de Aspergillus niger.
✓ Preparación fija de Penicillium spp.
✓ Preparación fija de Mucor spp.
✓ Microscopio óptico.
1. Colocar la preparación fija en el microscopio.

2. Observar los objetivos 10x y 40x.
3. Identificar las estructuras de cada género.
4. Ilustrar en el círculo correspondiente.
165
UNAM
Resultados
Ilustra las estructuras más importantes para la identificación que

observaste en cada caso.
Aspergillus clavatus Aspergillus flavus
Aspergillus fumigatus Aspergillus niger
166
UNAM
Penicillium spp. Mucor spp.
Discusión
Conclusiones
167
UNAM
Autoevaluación
1.- ¿Cuáles géneros de hongos contaminan el grano antes de la

cosecha?
2.- ¿Cuáles géneros de hongos contaminan el grano después de la

cosecha?
3.- Anota cuatro géneros de hongos productores de micotoxinas.
4.- ¿Cuál es la principal especie de hongo que produce aflatoxinas?
168
UNAM
5. Anota tres medios de cultivo utilizados para hongos miceliales.
Referencias
1.- Acharya, T. Common Fungal Culture Media and their uses.

http://microbeonline.com/common-fungal-culture-media-uses/
2.- Arenas G., Roberto 2014. Micología médica ilustrada. 5ª. Edición.
McGraw-Hill Interamericana Editores. México, D.F.
3.- Bonifaz,A. 2015.Micología médica básica. Quinta edición. McGraw-

Hill Interamericana Editores. México, D.F.
4.- Díaz, G.A. Fundamentos y técnicas de análisis microbiológicos.

Laboratorio de diagnóstico clínico 2ºcurso. Madrid
5.- Llovo,J. & Ponton,J. Diagnóstico microscópico de las micosis.

Asociación Española de Micología
http://www.guia.reviberoammicol.com/Capitulo14.pdf
Recursos electrónicos
6.- http://www.ugr.es/~cjl/hongos.pdf
7.- http://www.mycology.adelaide.ed
169
UNAM
Práctica 13: Determinación de micotoxinas en

granos y alimentos para animales.
Objetivo
El alumno comprenderá la importancia de las micotoxinas presentes

en granos o alimentos para consumo animal.
Introducción
Las micotoxinas son metabolitos secundarios producidos por algunos

hongos filamentosos, su ingestión, inhalación o absorción cutánea
puede producir intoxicaciones agudas o crónicas. Las micotoxinas de
mayor impacto en la salud animal son aflatoxinas, citrinina,
diacetoxiscirfenol, ocratoxina, rubratoxina, tricotecenos, ácido oxálico,
penitren A, zearalenona y fumonisinas entre otras. En general, estas
micotoxinas provienen de tres géneros de hongos: Aspergillus,
Penicillum y Fusarium.
Los efectos tóxicos de las micotoxinas son variables dependiendo de

su estructura química, concentración y duración de la exposición. En
los animales, el efecto varía según la especie afectada, la edad, el sexo
y la susceptibilidad individual, incluso algunas intoxicaciones pueden
causar la muerte de animales y personas. Los efectos sobre la salud
incluyen alteraciones endocrinas, inmunosupresión, hepatotoxicidad y
carcinogenicidad por lo que el crecimiento, la reproducción y la
producción de los animales se ven disminuidos cuando consumen
170
UNAM
alimentos contaminados con micotoxinas por periodos prolongados.

Además, algunas micotoxinas pueden acumularse en los tejidos o
pueden ser secretadas en productos como la leche, lo cual,
compromete la salud de los consumidores de productos de origen
animal.
Se sabe que los costos de la alimentación animal representan entre el

60% y 70% de los gastos en una unidad de producción pecuaria, por
lo que es de suma importancia utilizar materias primas de primera
calidad en la elaboración de los alimentos para garantizar la ausencia
de micotoxinas o cuando menos, que contengan concentraciones
mínimas permisibles de las mismas. Debido a su importancia, en esta
práctica haremos referencia específicamente a las aflatoxinas.
Las aflatoxinas son un grupo de metabolitos sintetizados por los

hongos Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, Aspergillus niger y
Penicillum spp., siendo las dos primeras especies las de mayor
importancia. De manera natural, se producen las aflatoxinas B1, B2,
G1 y G2, de estas se producen por biotransformación más de 20
variantes diferentes, entre las que se encuentran las aflatoxinas M1,
M2, 1, Q1 y aflatoxicol. La aflatoxina B1 es la más tóxica y frecuente.
La aflatoxina M1 es un metabolito hidroxilado de la aflatoxina B1,
secretada por la glándula mamaria en la leche de los animales que
consumen alimentos contaminados con B1.
La cantidad permitida de aflatoxinas en México está regulada por la

NOM-188-SSA1-2002: “Productos y Servicios. Control de aflatoxinas
en cereales para consumo humano y animal”. Las especificaciones de
171
UNAM
esta norma indican que la concentración máxima en alimentos para

consumo animal varía de 100 a 300 μg/kg según la especie, mientras
que las normas europeas sólo permiten una concentración 0.1 μg/kg.
Lo anterior limita las exportaciones de granos o alimentos para
animales a la unión europea cuando no se cumple con estas
especificaciones.
Por lo anterior, se recomienda monitorear, controlar la presencia y los

niveles de aflatoxinas en los alimentos como parte de los controles de
la inocuidad alimentaria. En esta práctica se realizará una
demostración cualitativa de la presencia de aflatoxinas en alimentos
para animales y humanos utilizando cromatografía en capa fina, el cual
es un método sencillo, práctico y que permite detectar a las cuatro
principales aflatoxinas.
Que el alumno sea capaz de determinar la presencia de aflatoxinas en

granos y alimentos destinados para el consumo.
Procedimientos

✓ Balanza granataria.
✓ Licuadora con vaso pequeño.
✓ Lámpara de luz ultravioleta de onda larga (350 nm).
✓ Matraces 50 ml.
✓ Probetas de 100 ml.
172
UNAM
✓ Vaso de precipitado 50 ml.

✓ Embudos de vidrio o plástico.
✓ Pipetas.
✓ Tubos capilares.
✓ Toallas desechables.
✓ Papel filtro Whatman # 3 o 4.
✓ Granos (entero y quebrado), cacahuate a granel, mazapán u otros
cereales.
✓ Etanol al 80%.
✓ Agua destilada.
✓ Cloruro de sodio.
✓ Papel cromatográfico.
✓ Frasco ámbar chico.
✓ Solución de corrimiento (cloroformo/acetona/agua).
Detección cualitativa de aflatoxinas en granos por luz ultravioleta.
El método de luz ultravioleta para determinar la presencia de

micotoxinas, específicamente aflatoxinas, es un método presuntivo. Se
basa en la capacidad que tienen las aflatoxinas de emitir fluorescencia
azul (aflatoxinas B1 y B2) o verde (aflatoxinas G1 y G2) cuando son
expuestas a luz ultravioleta. Al exponer los granos sospechosos de
contaminación a una emisión de luz ultravioleta de 365 nm, mostrarán
una fluorescencia con tonalidades amarillo-verdosas o azules según el
tipo de aflatoxinas presentes, sin embargo, no se considera una prueba
definitiva debido a que otros metabolitos como el ácido kójico
producido por los hongos toxigénicos al combinarse con peroxidasas
de los granos, también producen sustancias fluorescentes. Por lo
173
UNAM
anterior, es necesario llevar a cabo un método de extracción de

micotoxinas de la muestra que permita detectar su presencia.
1.- Colocar los granos de maíz sobre una caja de Petri.
2.- Con la luz apagada, exponer los granos de maíz a la luz ultravioleta
y observar cuidadosamente.
3.- Registrar si hay fluorescencia.
Resultados
MUESTRA DE ALIMENTO TIPO DE FLUORESCENCIA

(AZUL O VERDE-AMARILLENTA)
Cromatografía en capa fina para la determinación de aflatoxinas

en alimentos.
1. Pesar 25 g de la muestra en un vaso de licuadora y agregar 2.5 g de

NaCl.
2. Agregar al vaso 50 ml de etanol al 80%.
3. Cubrir el vaso de la licuadora y licuar por 2 minutos.
4. Vaciar la mezcla sobre un embudo utilizando como filtro la toalla
desechable para retirar los restos gruesos.
174
UNAM
5. Realizar un segundo filtrado del extracto utilizando papel filtro

Whatman.
6. Tomar unas gotas del extracto filtrado con un tubo capilar y poner
una gota en el papel cromatográfico en un punto y secar. Repetir
esta operación en el mismo punto del papel entre 5 y 10 veces para
concentrar el contenido del extracto en el papel.
7. Colocar el papel filtro con la muestra concentrada dentro de la
solución de corrimiento.
8. Dejar que la solución de corrimiento suba por capilaridad por el papel
filtro con la muestra. Vigilar constantemente para evitar que la
solución de corrimiento salga por el otro extremo del papel
cromatográfico (es conveniente trazar una línea con lápiz a medio
centímetro de cada extremo del papel cromatográfico).
9. Terminado el corrimiento, secar al aire el papel cromatográfico unos
minutos y observarlo bajo la luz ultravioleta de onda larga (365 nm).
Resultados
PRESENCIA DE BANDAS
MUESTRA DE ALIMENTO
FLUORESCENTES
175
UNAM
Disposición de residuos.
El material (maíz, fruta, alimento terminado, papel filtro) será manejado

como residuo de desecho, el cual será depositado en el bote de
basura.
El metanol al 80% se recolectará en un contenedor para ser diluido con

agua común, para su posterior eliminación.
En el caso de que al alumno se le proporcione alimento contaminado

ex profeso con aflatoxina, ese material será inactivado por 24 h en
cloro al 3%.
Precaución: En caso de trabajar con material contaminado ex profeso

es muy importante usar todo el tiempo guantes de hule y cubre bocas.
Esto será indicado por el profesor.
Discusión
176
UNAM
Conclusiones
Autoevaluación
1.- ¿Cuál es la NOM vigente que habla de la concentración permitida

de aflatoxinas?
2.- ¿Cuáles son los principales géneros de hongos toxigénicos?
3.- Anote cinco micotoxinas de interés veterinario y humano.
177
UNAM
4.- ¿Cuál es la importancia de las micotoxinas en la salud animal y

humana?
5.- Debido a los efectos adversos que tienen las micotoxinas sobre la
salud ¿cuáles son las medidas preventivas a establecer para evitar la
contaminación de los alimentos?
Referencias
1.- Bryden, W. L. Mycotoxin contamination of the feed supply chain:

Implications for animal productivity and feed security. Animal Feed
Science and Technology 2012;173(1): 134-158.
2.- Flores-Flores ME, Lizarraga E, López-de-Cerain A, González-

Peñas E. Presence of mycotoxins in animal milk: a
review. Food Control 2015;53:163-176.
178
UNAM
3.- NORMA Oficial Mexicana NOM-188-SSA1-2002, Productos y

Servicios. Control de aflatoxinas en cereales para consumo humano y
animal. Especificaciones sanitarias.
4.- Richard JL. Some major mycotoxins and their mycotoxicoses – an

overview.InternationalJournal of Food Microbiology 2007;119:3-10.
Weidenboerner M. Encyclopedia of food microbiology. Berlin. Springer-

Verlag. 2010.
Recursos Electrónicos
5.- European food safety authority

http://www.efsa.europa.eu/en/topics/topic/mycotoxins
6.- Mycotoxins info blog (Con aplicación para IOS y ANDROID)
http://www.mycotoxins.info/myco_info/myco_info.html
7.- Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la

Agricultura (FAO) http://www.fao.org/docrep/u3550t/u3550t0e.html
AOAC Oficial Method 972.26 “Aflatoxinas en maíz” (año 2010).
179
UNAM
Práctica 14: Evaluación de desinfectantes en

diferentes superficies.
Objetivo
El alumno evaluará la acción de algunos desinfectantes sobre

diferentes superficies, diferentes microorganismos y variando el tiempo
de exposición.
Introducción
La desinfección es un proceso de eliminación parcial de la carga

microbiana de un objeto, área o superficie, en el que generalmente no
se eliminan formas resistentes (esporas) y se lleva a cabo con el fin de
reducir a un mínimo el riesgo de contaminación o de infección.
Los procesos de desinfección se realizan con sustancias químicas

llamadas desinfectantes. Existe una gran variedad de desinfectantes
con diversos mecanismos y espectros de acción antimicrobiana, es
decir, existen aquellos que son predominantemente bactericidas,
viricidas, fungicidas, etc. Cuando se utiliza un desinfectante se debe
tener en cuenta que existen varios factores que afectan a su
desempeño como son:
• Tipo y concentración del agente químico.

• Tiempo de contacto.
180
UNAM
• Naturaleza del objeto o superficie a desinfectar.

• Temperatura.
• Concentración de microorganismos.
• Tipo de microorganismos.
El tiempo de contacto es quizá una de las variables más importantes

en el proceso de desinfección. Por lo general se ha podido observar
que, a una concentración dada de desinfectante, la mortalidad de los
microorganismos aumenta con el tiempo de contacto. La
concentración es otro factor importante que puede ser afectada por la
estabilidad química del desinfectante y su volatilidad. Algunos
desinfectantes como el alcohol o el cloro no son estables
químicamente cuando hay presencia de materia orgánica en el objeto
a desinfectar o bien, el alcohol permanece poco tiempo en
concentraciones eficaces debido a su rápida evaporación. La
porosidad de la superficie a desinfectar puede alterar la eficacia del
proceso, generalmente es más fácil desinfectar las superficies
completamente lisas que las rugosas o porosas, debido a que en estas
últimas, el desinfectante no permea adecuadamente a toda la
superficie.
Finalmente, la naturaleza de los microorganismos también es otro

factor importante, existen bacterias que pueden ser resistentes a
ciertos desinfectantes como Pseudomonas spp. al cloruro de
benzalconio o las micobacterias al alcohol. En general los hongos
presentan mayor resistencia que las bacterias a los desinfectantes.
181
UNAM
Que el alumno compruebe la eficacia de un desinfectante

considerando factores como el tiempo de exposición, el tipo de
superficie y de microorganismo.
Procedimiento
Material por grupo:
✓ Caja de Petri estéril con un fragmento de madera, papel aluminio

y cartón en su interior.
✓ Tres tubos con caldo BHI.
✓ Tubo con solución salina fisiológica.
✓ Cultivo microbiano en caldo (24 horas).
✓ Tubo 0.5 del nefelómetro de McFarland.
✓ Solución desinfectante a probar en frasco gotero.
✓ Una jeringa insulínica.
✓ Una jeringa de 3 ml.
✓ Pinza de disección.
1.- Ajustar con la solución salina fisiológica la concentración del cultivo

microbiano al tubo 0.5 del nefelómetro de McFarland.
182
UNAM
2.- Abrir la caja de Petri estéril a pie de mechero, separar los tres
fragmentos con la pinza (previamente flameada), colocar a cada
fragmento 0.1 ml de la solución estándar de microorganismos e incubar
durante 5 minutos.
3.- Pasado el tiempo de incubación, agregar a cada superficie una gota

de solución desinfectante y dejar actuar durante 1 o 10 minutos sobre
cada fragmento según le indique el profesor a cada equipo.
4.- Pasado el tiempo de desinfección tomar cada fragmento con

pinzas, sacudir ligeramente para quitar el exceso de humedad,
posteriormente, colocar cada fragmento en un tubo de caldo BHI y
rotular.
5.- Incubar los tubos de caldo BHI a 37°C durante 24 horas.
Resultados
Para la lectura de los resultados se interpretará cada tubo como

positivo o negativo. Los tubos positivos se categorizarán en turbidez
ligera (+), moderada (++) o densa (+++), los tubos que no tengan
turbidez aun después de ser agitados serán negativos (-).
183
UNAM
Con base en los resultados obtenidos por todo el grupo, llene el

siguiente cuadro e interprete los resultados:
TURBIDEZ
DESINFECTANTE TIEMPO DE
MICROORGANISMO
(CONCENTRACIÓN) EXPOSICIÓN
ALUMINIO MADERA CARTÓN
Discusión
184
UNAM
Conclusiones
Referencias
1.- Kahrs R.F. Principios generales de la desinfección. Rev. sci. tech.

Off. Int. Epiz., 1995,14 (1), 143-163.
Recursos electrónicos:
2.- http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/documentos/capitulo9.html
185
UNAM
Manual de Bacteriología y Micología

Fue producido gracias al Proyecto PAPIME PE207817 "Elaboración de un
manual digital de Bacteriología y Micología con la implementación de dos nuevas
prácticas para la modernización de la enseñanza a estudiantes de veterinaria"
186

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES

MARCO ANTONIO MUÑOZ GUZMÁN

PARTICIPANTES DE LA PRIMERA REVISIÓN

FERNANDO CERÓN TÉLLEZ

Reglamento específico del Laboratorio de Bacteriología y Micología. 6

Práctica 1: Bioseguridad y manejo de residuos biológico-infecciosos. 7

Práctica 3: Toma y envío de muestras para estudios bacteriológicos. 22

Práctica 4: Preparación de medios de cultivo para bacterias. 33

Práctica 5: Técnicas de siembra para el aislamiento de bacterias y 42

Práctica 7: Pruebas primarias de identificación bacteriana. 70

Práctica 8: Identificación bioquímica de enterobacterias. 85

Práctica 9: Identificación rápida de bacterias (API 20E®) y evaluación de 108

Práctica 11: Identificación de levaduras y dermatofitos de importancia 137

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN

REGLAMENTO ESPECÍFICO DEL LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA Y

8.- Queda prohibida la entrada con mascotas al laboratorio.

9.- El incumplimiento de cualquiera de los incisos señalados en el reglamento general o

Revisado y aprobado: 28 de julio de 2017.

PROFESORES DEL CLAUSTRO

Práctica 1: Bioseguridad y manejo de residuos

Dar a conocer a los estudiantes de la asignatura Bacteriología y

La bioseguridad se puede entender como el conjunto de medidas y

Que el estudiante conozca y aplique el manejo básico de residuos

Las normas y recomendaciones que a continuación se enlistan han

1.- Todos los involucrados en las PBMV deben conocer la ubicación y

3.- El cabello largo debe recogerse hacia atrás de modo que no

5.- No es recomendable usar lentes de contacto durante las prácticas,

6.- Está totalmente prohibido fumar e ingerir alimentos o bebidas

7.- Queda prohibido pipetear con la boca; si se requiere, debe

8.- Al inicio y al final de cada práctica debe limpiarse la superficie de

9.- La mesa de trabajo debe mantenerse libre de libros, mochilas,

10.- Debe evitarse el contacto de las manos con la boca durante el

11.- Debe desecharse todo material de vidrio quebrado o estrellado.

12.- Debe informarse inmediatamente a los profesores de la práctica

Manejo de Residuos Peligrosos Biológico-Infecciosos (RPBI)

En 2003 la Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales

De la NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002 se desprenden las

14.- Si durante el desarrollo de una práctica se obtienen muestras

15.- Las muestras biológicas deben recolectarse o depositarse en

16.- Si ocurre algún derrame de muestra biológica, debe desinfectarse

17- Agujas o lancetas usadas deben colocarse en contenedores

18.- Cualquier otro material potencialmente contaminado debe

Figura 1.- Símbolo universal para identificación

Tomado de la Guía de Cumplimiento de la Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002.

1.- Identifica tres escenarios del desempeño profesional de un MVZ

2.- ¿Qué es un residuo peligroso biológico-infeccioso?

4.- ¿Qué instituciones del gobierno federal regulan el manejo de

5.- ¿Qué instrumento legal regula la disposición de los residuos

1.- Reglamento General para los Laboratorios. FES-Cuautitlán,

2.- Programa Académico de la asignatura de Microbiología y

3.- Manual de Prácticas de Laboratorio de Bacteriología y Micología.

4.- Guía de Cumplimiento de la Norma Oficial Mexicana NOM-087-

El alumno conocerá los métodos de esterilización más utilizados en los

Aplicará el método de esterilización con calor húmedo para materiales

La esterilización es un término absoluto (no existen grados) que implica

En esta práctica nos centraremos en el método de calor húmedo

MÉTODO PRINCIPIO USOS

Esterilización por calor

El calor es el medio físico más sencillo y seguro para esterilizar

En la esterilización por calor hay que diferenciar básicamente dos

metálico. No se usa este método para medios de cultivo y líquidos en

Por otra parte, la esterilización con calor húmedo emplea un sistema