PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DEL

ECUADOR

ESCUELA DE BIOANÁLISIS
Carrera de Microbiología

Asignatura: Ficología

MANUAL DE LABORATORIO DE FICOLOGÍA

(MICROORGANISMOS FOTOSINTÉTICOS)

Dr. Ever Morales Avendaño

Proyecto Prometeo-SENESCYT 2012
AGRADECIMIENTO

Mi agradecimiento a la profesora Verónica Luna, Coordinadora de la asignatura Ficología

de la carrera de Microbiología de la Escuela de Bioanálisis de la PONTIFICIA
UNIVERSIDAD CATOLICA DEL ECUADOR por su cooperación y motivarme en todo
momento para hacer realidad el presente MANUAL DE LABORATORIO DE
FICOLOGÍA

A mi personal del Laboratorio de MICROORGANISMOS FOTOSINTÉTICOS de la

Facultad Experimental de Ciencias de la UNIVERSIDAD DEL ZULIA de VENEZUELA,
por su apoyo en el suministro de datos para la estructuración del Manual.

A todos los estudiantes del primer curso de FICOLOGÍA dictado en la Escuela de

Bioanálisis de la PUCE, y cuya asignatura ha sido incluída como obligatoria en la carrera
de Microbiología, de dicha Escuela. Su interés y deseos de aprendizaje constante durante
las actividades de laboratorio, han permitido enriquecer la información formulada en este
Manual de Ficología relacionado con la bioprospección, aislamiento, cultivo, bioquímica y
biotecnología de microorganismos fotosintéticos.

Al PROYECTO PROMETEO DE LA SECRETARIA DE EDUCACION

SUPERIOR, CIENCIA, TECNOLOGÍA E INNOVACIÓN DEL ECUADOR
(SENESCYT) por haberme dado la oportunidad de cooperar con el desarrollo
de la investigación y docencia sobre ecología, cultivos y biotecnología algal y
ambiental con microalgas y cianobacterias, en instituciones de Educación
Superior y Centros de Investigación del Ecuador.

2
INTRODUCCIÓN

El presente Manual de Laboratorio de Ficología constituye una herramienta técnica y de

aprendizaje sobre la biología, ecología, bioquímica, cultivo y biotecnología de
microorganismos Fotosintéticos que los estudiantes de la carrera de Microbiología deben
explorar como parte del conocimiento y experiencia sobre la diversidad de los
microorganismos tanto heterotróficos como autotróficos, que en este caso corresponde a las
microalgas, cianobacterias y bacterias fotosintéticas.

Las actividades prácticas orientan al estudiante al conocimiento de la diversidad

morfológica, metabólica y de hábitat que presentan estos microorganismos fotoautotróficos.
La secuencia de experiencias en el laboratorio conlleva a un proceso de aprendizaje que se
inicia con las metodologías para la colecta de muestras, pasando por el proceso de
aislamiento, selección de medios de cultivos, adaptación a las condiciones de laboratorio,
hasta su cultivo en medios sólidos y liquídos. Incluso, se ilustra la diversidad microbiana
con el modelo experimental de la Columna de Winogradsky para la comparación de grupos
funcionales en relación a gradiente de iluminación, aireación y nutrientes. Además, de
adquirir destrezas en el aislamiento y cultivo de los microorganismos observados.

Entre otros de los aspectos esenciales de las prácticas se contempla el aprendizaje del
montaje de cultivos de acuerdo a la tecnología de adición o no de sustratos o de la
renovación del cultivo diaria para la obtención de biomasa microalgal como paso previo a
la aplicación de bioprocesos inherentes a la producción de pigmentos, exopolisacáridos,
proteínas, enzimas, remoción de contaminantes, etc que se exploran en el campo de
biotecnología ambiental, agroindustrial o farmaceútica.

Las técnicas de extracción de pigmentos, proteínas, lípidos, carbohidratos,

exopolisacáridos, determinación de peso seco, a partir de cultivos de microalgas y
cianobacterias, corresponden a aspectos básicos para, la investigación en biotecnología
algal como otras de las orientaciones académicas del estudiante de la carrera de
Microbiología de la PUCE. En cuanto a la extracción de pigmentos liposolubles se
contemplan las metodologías de espectrofotometría, HPLC, cromatografía de capa fina y
por fluorescencia.

Como anexo se incluye una clave taxonómica de los principales géneros de microalgas y
cianobacterias identificados en cuerpos de aguas del Ecuador y que sirve de referencia para
orientar a los estudiantes en el reconocimiento de géneros de estos microorganismos
fotosintéticos.

3
OBJETIVO GENERAL:

Adquirir destrezas en el manejo de metodologías para el aislamiento, cultivo y extracción

de macromoléculas de bacterias fotosintéticas, cianobacterias y microalgas.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

Manejar las metodologías utilizadas para el aislamiento y cultivo de bacterias

fotosintéticas, cianobacterias y microalgas.
Capacitar al estudiante en la identificación de los diferentes grupos de
microorganismos fotosintéticos mediante el uso de claves, imágenes fotográficas y
elaboración de catálogo de las cepas aisladas.
Comparar el efecto de diferentes parámetros ambientales sobre el crecimiento de los
microorganismos fotosintéticos en condiciones de laboratorio.
Establecer diferencias entre los sistemas de cultivos continuos, semicontinuos y
discontinuos utilizados bioprocesos.
Relacionar el fundamento de las técnicas de extracción de macromoléculas, según la
naturaleza bioquímica de las mismas y capacidad metabólica de cada
microorganismo fotosintético.
Elaborar curvas de crecimiento y determinar sus parámetros cinéticos para
establecer comparaciones de acuerdo al efecto de distintos parámetros ambientales.

RECOMENDACIONES:

Para cada actividad práctica se exige al final la presentación de un reporte, el cual

debe incluir lo siguiente:

1. Resumen de un párrafo sobre el fundamento de la práctica que se realizó.

2. Descripción de los resultados, incluyendo su discusión de acuerdo a gráficos, tablas,
figuras o fotografías.

4
 3. Conclusiones: su conocimiento sobre el fundamento de la práctica, así como el
protocolo en sí deben ser suficientes para que se concluya cuáles pueden ser los
resultados esperados.
4. En caso de que algunos resultados no sean los esperados, discuta en la sección de
resultados las posibles causas que originaron tales efectos. E incluya cual habría
sido el resultado esperado.

Medidas de seguridad

1.-Es indispensable el uso de mandil de manga larga

2.- Es absolutamente prohibido comer, tomar, fumar o usar aparatos electrónicos ajenos a
las prácticas durante las sesiones de laboratorio.
3.- Se aconsejael uso de lentes de seguridad y guantes de vinil o látex, para aquellas
prácticas que requiera el uso de reactivos, como en el caso de extracción de carbohidratos,
proteínas, lípidos. Además, es indispensable el uso de campana de extracción para estas
prácticas.
4.- El estudiante deberá estar familiarizado con las normas generales de trabajo en los
laboratorios de la Universidad.
5.-No olvidar lavarse las manos al salir del laboratorio.
6.-Al finalizar las prácticas donde se utilice el microscopio, cuidar de apagarlo antes y
cubrirlo con la funda.
7.-Esperamos que este manual y el curso de Ficología motiven su interés
por la investigación y contribuya a enriquecer su conocimiento en la carrera de
Microbiología.

5
Indice

Introducción

Contenido Página
Práctica N°1: “Colecta de muestras. Identificación y aislamiento de
microorganismos fotosintéticos a partir de muestras de aguas y de sedimentos”….....7

Práctica N° 2:“Estrategias metodológicas para estudio de la diversidad,

sucesión ecológica y aislamiento de microorganismos fotosintéticos.
Columna de Winogradsky” como
modelo experimental………………………………………………………………….19

Práctica N° 3: Uso de medios de cultivos comerciales y artesanales,

genéricos y selectivos para cultivo de microorganismos fotosintéticos………………28

Práctica N° 4: Recuento celular………………………………………………………46

Práctica N° 5: Determinación de parámetros cinéticos del crecimiento en

microorganismos fotosintéticos. Elaboración de curva de crecimiento……………….52

Práctica N° 6: Extracción y cuantificación de pigmentos liposolubles

a partir de microalgas y cianobacterias………………………………………………...64

Práctica N° 7: Extracción y determinación de pigmentos hidrosolubles a

partir de cianobacterias y microalgas rodofitas……………………………………..…82

Práctica N° 8: Sistema de cultivos discontinuos, discontinuos

alimentados y semicontinuos…………………………………………………………..84

Práctica N° 9: Análisis de proteínas. Método espectrofotométrico…………………..90

Práctica Nº 10: Análisis de carbohidratos. Método espectrofotométrico……………..94

Práctica N° 11: Análisis de lípidos. Método espectrofotométrico……………………..97

Práctica N° 12: Análisis cualitativo y cuantitativo de exopolisacáridos

cianobacterianos…........................................................................................................ 100

Anexo: Clave de identificación de ciertos géneros de microalgas y cianobacterias

observados en embalses de la provincia de Pichincha-Ecuador……………………….104

6
 PRÁCTICA N° 1

“COLECTA DE MUESTRAS. IDENTIFICACIÓN Y AISLAMIENTO

DE MICROORGANISMOS FOTOSINTÉTICOS A PARTIR DE
MUESTRAS DE AGUAS Y DE SEDIMENTOS”.

Introducción:
Esta guía presenta las instrucciones sobre metodologías de muestreos en diferentes
ambientes naturales, de aislamiento y de cultivos iniciales a fin de abordar estudios
ecológicos, taxonómicos, fisiológicos y de biotecnología de microalgas, cianobacterias y
bacterias fotosintéticas en condiciones de laboratorio.

Se consideran estrategias metodológicas para comenzar con el monitoreo de identificación

de microorganismos observados y tomando en cuenta el orden de abundancia y variación
de la población conforme va pasando el tiempo de colecta y según la adición de diferentes
medios de cultivos, que también influencian la diversidad y población de microalgas y
cianobacterias especialmente.

El procesamiento de las muestras tanto de aguas, como de sedimentos o de suelos puede

depender de la procedencia de las mismas. Bien se si se tratan de muestras obtenidas en
lagunas, embalses, aguas termales, medios hipersalinos, aguas residuales, de superficies
rocosas, de suelos, etc. En este sentido, el uso de los primeros medios de cultivos y de su
concentración. Así como, de la intensidad luminosa y fotoperíodo, temperatura, aireación,
son variables ambientales, esenciales que se deben tomar en cuenta a fin de preservar o dar
comienzo al proceso de adaptación de las diferentes cepas de microorganismos
fotosintéticos en el laboratorio.

Por otra parte, se inserta la metodología empleada para el estudio de la diversidad

microbiana observada en Columnas de Winogradsky en relación al gradiente de luz,
aireación, sustratos inorgánicos y orgánicos, y de compuestos sulfurados, esenciales para
inducir el crecimiento de bacterias verdes y rojas dependientes o no del azufre. Y
posteriormente, la de cianobacterias y de microalgas, en las zonas de la columna con mayor
incidencia de luz y presencia de condiciones aeróbicas. De igual modo, en dicha columna
se logrará observar la diversidad, sucesión y dominancia de algunos de los tres grupos de

7
microorganismos fotosintéticos conforme se varían las condiciones ambientales y de
nutrientes a lo largo de dicha columna. En este sentido, tales condiciones cambiantes
contribuirán a la detección de microalgas, cianobacterias y de bacterias fotosintéticas,
susceptibles de ser aisladas y adaptadas en condiciones de laboratorio.

De acuerdo a las fases de trabajo en el laboratorio para el aislamiento y posterior cultivo o

de manera simultánea de las cepas de estos microorganismos, se requiere el entrenamiento
para la colecta de las muestras, caracterización de las mismas, su observación al
microscopio y seguimiento de la variabilidad de las diferentes taxas, métodos de
aislamiento y de purificación de cada una de estas y su posterior estudio sobre el efecto de
diferentes medios de cultivo para su crecimiento.

Se describen a continuación, las instrucciones para la colecta de muestras, empleo de la

columna de Winogradsky, aislamiento y purificación de las cepas a ser obtenidas para
ingresarlas a la colección o cepario del laboratorio. Es importante destacar que, los
procedimientos pueden variar de acuerdo a las características de cada especie, del tipo de
muestra y de los medios e instrumentos que cada operador tiene a su disposición.

Objetivos:
1. Considerar las técnicas de colecta de muestras y según las condiciones ambientales
y aspectos geográficos del hábitat a monitorear.
2. Valorar las metodologías para el procesamiento de las muestras en el laboratorio, a
fin de obtener una mayor eficiencia de la supervivencia de los microorganismos
fotosintéticos mantenidos en las muestras.
3. Seleccionar según el grupo de microorganismos fotosintéticos, los medios de
cultivos más adecuados y selectivos, que contribuyan a incrementar el crecimiento
de los mismos, para su posterior aislamiento.
4. Comparar las metodologías de aislamiento y de purificación para la toma de
decisiones al momento de mejorar dichos procesos.
5. Estimar la diversidad, dominancia y abundancia de los taxas de este grupo de
microorganismos en cada muestra para estudios ecológicos y fisiológicos.
6. Determinar según las técnicas de aislamiento, el número de especies aisladas en
comparación al número observado al inicio de la presente actividad práctica.

8
I: Colecta de muestras

La metodología para proceder al aislamiento y cultivo de bacterias fotosintéticas,

cianobacterias y microalgas, conlleva a la selección previa de sitios de muestreos con la
finalidad de dar inicio al procesamiento de muestras, bien sea, tomadas de cuerpos de
aguas, sedimentos costeros o de lagunas, suelos e inclusive de ambientes extremófilos.
Entre los hábitats que podemos tomar en cuenta para tales actividades son las siguientes:

I.1-Sitios a ser considerados para muestreos:

1. Ambientes hipersalinos: lagunas saladas, salmueras.

2. Humedales naturales o artificiales.
3. Ríos, lagos, costas marinas, pozos de agua, lagunas, charcos temporales.
4. Ambientes termófilos.
5. Suelos inundados, arrozales, manglares.
6. Superficies rocosas, de concreto, vidrio, pintura.
7. Lechos de tuberías, alcantarillados, escorrentías.
8. Aguas residuales urbanas, industriales, agropecuarias, caseras
9. Embalses, reservorios, tanques de agua para consumo humano
10. Lagunas destinas a actividades de acuicultura.

I.2.-Materiales necesarios para la colecta de muestras:

a.-Frascos de vidrio con tapa de diferentes tamaño.

b.-Espátulas de diferentes tamaño.
c.-Red de fitoplancton (colecta de volúmenes de agua en lagunas, embalses).
d.-Guantes
e.-Botella o envase con agua potable.
f.-Marcador de vidrio
g.-balde o recipiente (colecta de agua a orillas de cuerpos de aguas).
h.-Bolsas plásticas (muestras de microalgas filamentosas o de cianobacterias sobre
sedimentos).
i.-Envase de poliestireno (traslado y preservación de muestras).
j.-pHmetro y termómetro ambientales.

9
 I.3.- Materiales para procesamiento de muestras en condiciones de
laboratorio:
a.- Cajas Petri
b.- Pipetas Pasteur plásticas y de vidrio.
c.- Medios de cultivos para microalgas y cianobacterias (BG11, ALGAL, BBM,
Fertilizante foliar)
d.- Microscopio, cubreobjeto y portaobjeto.
e.- Lámpara fluorescente.
f.-Tubos de ensayo con tapa y gradilla.
g.- Cilindro graduado de 100, 250 y 500 ml.
h. -Papel filtro.

II: Procesamiento de las muestras:

Una vez colectadas las muestras y trasladadas al laboratorio se procede a colocarla bajo
iluminación y posteriormente observar al microscopio la presencia de los
microorganismos para ese momento. En este caso se debe elaborar un registro de las
mismas, tanto de las identificadas como de las desconocidas. Posteriormente, se
recomienda distribuir la muestra, bien sea de agua, sedimentos, lodos o suelos a cajas
Petri, o frascos pequeños de vidrio para adicionarles medios de cultivos diluídos (entre
10 a 50%) y dejar otras muestras sin nutrientes.

Cuando se observan abundante euglenofitas, cianobacterias con heterocistos o bacterias

fotosintéticas, se recomienda utilizar medios de cultivos selectivos para estos grupos a
fin de proceder a su aislamiento lo más pronto.

Para aquellas muestras con presencia de depredadores de microorganismos

fotosintéticos de tamaño mayor de las microalgas, se recomienda eliminarlos mediante
filtrado a través de un tamiz con una luz de malla apropiada y proceder al aislamiento
en un corto período de tiempo.

Para el estudio de variación de la población de microalgas y de cianobacterias en

función del tiempo y de acuerdo a las condiciones establecidas de iluminación,
fotoperiodo, nutrientes y temperatura; se procede a cubrir información para cada
muestra inicial y luego según el tipo de medio de cultivo añadido a cada submuestra en
caja Petri, tubo de ensayo o frasco y de acuerdo a los siguientes ejemplos de una Tabla
(1) para información inicial de cada muestra y de otra Tabla (2) de registro de presencia
de microalgas y cianobacterias, según medio de cultivo utilizado en función del tiempo.

10
 De igual manera se presenta la Tabla 3, correspondiente a valorar las microalgas o
cianobacterias que puedan predominar según las condiciones de mantenimiento en el
laboratorio:

Tabla 1: Información inicial de cada muestra colectada:

Número o código de cada Muestra/Fecha
Variables 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Procedencia
Tipo de muestra
color
olor
pH
Temperatura
Volumen/peso
Microalgas
Cianobacterias
Protozooarios

Tabla 2: Microorganismos fotosintéticos en submuestras, según medio de cultivo y

fecha de observación.
Muestra Caja Petri/frasco/Tubo de ensayo
N°/ código Con o sin medio de cultivo: BG11/ALGAL/Fertilizante/Bristol/BBM, etc
Fecha de observación
Fecha: Fecha: Fecha: Fecha: Fecha: Fecha: Fecha:
1
2
3
4

Tabla 3: Orden de abundancia, según muestra, medio de cultivo y tiempo de

incubación.
Muestra Caja Petri/frasco/Tubo de ensayo
N°/ código Con o sin medio de cultivo: BG11/ALGAL/Fertilizante/Bristol/BBM, etc

0 día 5 días 10 días 15 días 20 días 25 días 30 días

1 C1>C2>C3 C3>C5>C8 C2>C4>C5
2 C4>C2>C3
3
4
Nota: registrar el número de cepas (C 1, C2, C3….) y la abundancia estimada en cada tiempo de
observación. No todas las taxas que se presentan al inicio del monitoreo serán observadas durante
todo el período de observación.

11
III: Aislamiento
La finalidad de aislar microalgas es la de obtener cultivos monoespecíficos o monoalgales
(cuando se trata de una sola especie o un solo tipo de microalga o cianobacteria). Para el
caso de los cultivos monoclonales es cuando se obtienen cultivos monoespecíficos a partir
de una célula, filamento, hormogonio, acineto o quiste).

Es de indicar que ambos tipos de cultivos contienen bacterias asociadas a estas cepas
aisladas y que le son beneficiosas, en virtud de que muchas de ellas establecen una relación
de simbiosis o de interacción positiva con la microalga o cianobacteria.

Los métodos de aislamiento dependerán de las dimensiones, movilidad y morfología;

siendo los más utilizados el de la micropipeta, placas de agar, diluciones sucesivas y el uso
de medios de cultivos selectivos. No obstante, es recomendable combinar dos o más de
estas técnicas, para una mayor eficiencia y obtención más rápida del microorganismo
aislado.

En muchas ocasiones existen una interacción muy significativa entre dos o más microalgas
o entre cianobacterias; lo cual ocasiona inversión de tiempo y de estrategias para poder
lograr la separación entre las cepas. Pero, el uso simultáneo de técnicas de aislamiento y de
medios selectivos puede contribuir al éxito en cuanto al aislamiento. En este caso, si las
cepas van a ser utilizadas para estudios de fertilización de suelos, uso de consorcios en
biorremediación, se pueden mantener dichos consorcios y en función de las condiciones de
cultivos se podrá evidenciar la competencia, dominio o en algunos casos aislamiento de
algunos de las cepas fuertemente asociadas.

En todos los casos, los aislamientos se realizan verificando los resultados de la secuencia de
operaciones con la ayuda de un microscopio.

a.- Aislamiento con pipeta:

Este método se utiliza para separar microalgas mayores a 10 μm de diámetro en forma de

quistes, células vegetativas, dinoflagelados, formas coloniales o filamentosas (Hoshaw y
Rosowski, 1973; Matsuoka y Fukuyo, 2000; Andersen y Kawachi, 2005).

El método consiste en aislar una microalga con la ayuda de una pipeta Pasteur con punta
reducida y/o con un capilar. Una gota que proviene de una muestra de fitoplancton se
coloca en un portaobjeto (laminilla) y se observa al microscopio, bajo el cual las células de
interés se succionan por capilaridad en la micropipeta y se transfieren a un portaobjetos
limpio o a una lámina excavada con una gota de agua de mar estéril.
12
 El procedimiento se repite, “lavando” la célula en medio o agua estéril hasta cuando no se
observan contaminantes y la gota contiene un solo tipo de células, que requiere
generalmente al menos cinco transferencias sucesivas.
Una vez realizadas las transferencias, la célula aislada se puede colocar en una placa con
pocillos múltiples o en un tubo de ensaye con 2 - 5 mL de medio de cultivo estéril. Esta
técnica se recomienda para microorganismos que no sean sensibles a la manipulación.

b.- Diluciones seriadas:

Este método se utiliza cuando la microalga que se desea aislar tiene un tamaño inferior a 10
μm de diámetro y es muy útil para aislar las especies que son más abundantes en la muestra
(Guillard, 1973; Andersen y Kawachi, 2005).

Antes de iniciar las operaciones de aislamiento, es necesario estimar la concentración

celular de la especie de interés, con el fin de calcular el número de diluciones necesario
para reducir la concentración a unas pocas células/mL.
Generalmente se toma 1 mL de la muestra original y se agrega a un tubo de ensayo que
contiene 9 mL de medio de cultivo estéril.

El número de diluciones dependerá de la densidad celular de la microalga o del número de

filamentos de cianobacterias, si es el caso, que contenga la muestra que se desea aislar y el
intervalo de dilución que se utiliza normalmente es de 10 -3 a 10-6, dependiendo de la
densidad poblacional.

Cuando las poblaciones son bajas, se recomienda utilizar placas con pocillos múltiples con
capacidad de 250 μL, y diluciones sucesivas de 1:10, 1:100, 1:1000 y 1:10000. Las
transferencias se van realizando en cada una de las diluciones, y al mismo tiempo se pueden
ir observando los resultados en el microscopio invertido y/o estereoscopio.

c.-Aislamiento en placas de agar:

Esta técnica es una de las más utilizadas desde el inicio del proceso de aislamiento porque
permite la separación gradual de especies, bien sean unicelulares o filamentosas. Es decir,
se irán re-aislando a medida que se van pasando a otros medios con agar. Este método
también se emplea para purificar cultivos contaminados con otros microorganismos.

No todas las especies se pueden mantener en medio sólido, especialmente especies

flageladas y algunas diatomeas, pero esta técnica suele dar buenos resultados con especies
bentónicas, clorofitas y cianobacterias.

13
Procedimiento:
1.- El agar a una relación de 1.5-2.0 % (w/v) disuelto en el medio nutritivo, para
microalgas (ALGAL, F2, BRISTOL, fertilizante©, BBM) o para cianobacterias (BG11o
para las fijadoras de nitrógeno o BG11 completo para las no fijadoras).

2.-Se inoculan una o dos gotas, en las cajas con medio sólido, que se esparcen con un asa
para bacteriología o con una varilla de vidrio doblada, previamente esterilizadas.

3.- La caja se cubre con su tapa, se le recubre con una cinta de parafilm, se invierte y se
coloca en un ambiente con temperatura y luz controladas.

4.-Se incuba durante unas semana o más, dependiendo de la velocidad de crecimiento del
microorganismo y de las condiciones ambientales.

5.-Posteriormente se observa al microscopio invertido y/o estereoscopio y con la ayuda del

asa se seleccionan las colonias libres de otros microorganismos, que se transfieren a otra
caja de Petri.

6.- Pueden transferirse a medios líquidos en subcultivos sucesivos para su purificación, de

tal manera que en cada dilución se reduzca el número de organismos en una gota. Esta
técnica es recomendable combinarla con la de diluciones y con la de transferencia en placa
de agar o tubo inclinado para obtener cultivos clonales (a partir de una sola colonia o
célula) y poder establecer el cultivo monoespecífico.

7.-Esta tarea se realiza las veces que sea necesario hasta asegurar el éxito del aislamiento de
un solo tipo de microalga y para lograrlo con mayor seguridad se recomienda utilizar esta
técnica en combinación con la de diluciones seriadas que se indicó anteriormente.

IV: Métodos de Purificación de Microorganismos fotosintéticos

previamente aislados.

Estos métodos se utilizan para eliminar o por lo menos diluir otros microorganismos
generalmente bacterias, presentes en la muestra o en las cepas ya aisladas. La forma más
sencilla es mediante la separación de las células algales y de las bacterias por medio de
centrifugación. Es recomendable probar este método antes de utilizar otras técnicas, que
son más susceptibles de causar daños celulares.

14
1.- Lavado por centrifugación:
Se llena un tubo estéril con un cultivo en crecimiento exponencial. Se centrifuga a
2000rpm/45-90 seg. El tiempo y la velocidad de centrifugación pueden variar dependiendo
de la especie y del organismo contaminante. La centrifugación debe permitir que sedimente
una parte de las células más pesadas (microalgas). Mientras que, las células de menor peso
(bacterias) permanecen en suspensión (Guillard, 2005). Se elimina el sobrenadante y las
algas se resuspenden en agua o medio estéril.

2.-Uso de Antibióticos:
Se han utilizado varios antibióticos y mezclas de ellos para la purificación de cultivos
algales (Tabla 4). Se sugiere probar diferentes concentraciones con el fin de verificar cual
es la concentración mínima efectiva, ya que también las microalgas y cianobacterias,
pueden resultar susceptibles a este tipo de tratamiento. Después de incubar los cultivos
entre 24 a 48 h, bajo condiciones adecuadas, se transfiere asépticamente a medio de cultivo
estéril y sin antibióticos y se observan los cultivos.

Tabla 4. Antibióticos empleados para purificar cultivos de microalgas.

ANTIBIÓTICOS mg/ L MICROALGAS REFERENCIAS
Penicilina G 100 Tolerado por Guillard, 2005
Sulfato de 25 varias
dihidrostreptomicina 25 especies
Sulfato de
gentamicina
Eritromicina 700 Chlorella Tomisek et al.,
1957
Neomicina 5 Chlamydomonas Foter et al., 1953
Nostoc
Scenedesmus
Penicilina 0.1 Anabaena Galloway y
2.0 variabilis Kraus, 1959
Microcystis Palmer y
Maloney, 1955
Estreptomicina 0.1 A. variabilis Galloway y
10 Chlamydomonas Kraus, 1959
2-4 Nitzschia Foter et al., 1953
47 Leal, 1990
Penicilina 23
Estreptomicina G
Penicilina 0.166 Castellvi, 1971
Estreptomicina 0.050

15
3.-Ejemplo de aislamiento y separación de microorganismos heterótrofos
y fotosintéticos empleando diferentes métodos, tales como, antibióticos,
centrifugación, lisis osmótica y radiación UV.

Caso: Separación de bacterias halofíticas, cianobacterias y de la microalga

Dunaliella sp., a partir de una muestra de agua colectada en una laguna
hipersalina.

Este ejemplo ilustra el uso de diferentes métodos de aislamiento cuando en una muestra con
una diversidad microbiana, se requiere obtener cada una de las cepas aisladas para estudios
posteriores. En este caso a partir de un consorcio conformado por las cianobacterias:
Aphanothece halophytica, Spirulina subsalsa; la microalga, Dunaliella y las bacterias
halofíticas: Halobacterium halobium, Halobacterium spp., Stephanoptera gracilies y Vibrio
spp.

16
4.- Axenización sin uso de antibióticos:

En muchos casos la separación de las bacterias asociadas a las microalgas o cianobacterias,

no ameritan uso de antibiótico, sino mediante procesos de aislamiento sucesivos en agar
hasta comprobar su axenización. Una vez que la cepa este axenizada es inoculada en un
medio organotrófico (Cid y col., 1992) conformado por: extracto de levadura (5.0 g/L),
peptona (1.25 g/L) y glucosa (2.5 g/L). Esta prueba es rigurosa porque si hay presencia de
bacterias, el medio se torna turbio como signo de crecimiento bacteriano y por lo tanto, las
cepas que han sido axenizadas de microalgas, podrán mantenerse en dicho medio de una
manera permanente.

5.-Uso de cicloheximida para aislar cianobacterias a partir de cultivos con presencia de

eucariotas como protozooarios, El uso de este inhibidor consiste en causar efecto letal de
todos los organismos eucariotas presentes en la muestra, a fin de mantener solo a las
cianobacterias, en este caso. Su uso se recomienda a una concentración de 100µ/L y debe
manipularse con sumo cuidado por tener propiedades cancerígenas.

V: Resultados obtenidos con los diferentes métodos de aislamiento.

Las estrategias de aislamiento a tomar en cuenta y a partir de las muestras procesadas

dependerán del grado de adaptación, medios de cultivos genéricos y selectivos utilizados,
del crecimiento obtenido en medios sólidos y del cumplimiento de los métodos a seguir
para obtener éxito en el proceso de aislamiento.

Al final de las actividades de laboratorio relacionadas con las técnicas de aislamiento el

estudiante debe registrar en una tabla de resultados (Tabla 5), los taxas de microorganismos
observados al inicio de la fase de procesamiento de las muestras y comparar con los
microorganismos aislados al culminar con los objetivos planteados en la práctica de
aislamiento.

En virtud de que no todas las microalgas y cianobacterias son fácilmente aisladas mediante
las técnicas utilizadas, también se registraran consorcios en los cuales permanecen
fuertemente asociados microalga-microalga, microalga-cianobacteria o cianobacterias-
cianobacteria.

17
Tabla 5: Registro definitivo de microorganismos fotosintéticos aislados.
Muestra MOF observados MOF aislados en MOF MOF asociados
(Número/código) al inicio medio líquido aislados en en consorcios
(fecha) (fecha) medio sólido (fecha)
(fecha)

Bibliografía:

ABALDE, J., Cid, A., Fidalgo, P., Torres, E. y Herrero, C. (1995). Microalgas: Cultivo
yAplicaciones. Universidade da Coruña. 210 págs.

Band, C. 2000. Capítulo 1: Aislamiento, purificación y mantenimiento de cepasde

microalgas. Métodos y herramientas analíticas en la evaluación de la biomasa microalgal.
Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste de México-CIBNOR.

GUILLARD, R.R.L. (2005). Purification Methods for Microalgae.En: Algal Culturing

Techniques.Andersen, R.E. (ed.), Elsevier Academic Press, China, 117-132 pp.

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GONZÁLEZ, M.A., Parra, O.O. y Cifuentes, A.S. (1995). Técnicas de Cultivo de

Microalgas en Laboratorio. En: Manual de Métodos Ficológicos. Alveal, K., Ferrario, M.E.,
Oliveira, E.C. y Sar, E. (eds.), Universidad de Concepción, Chile. 219-250 págs.

STEIN, J.R. (ed.) (1973). Handbook of Phycological Methods: Culture Methods and
Growth Measurements. Cambridge University Press, UK, 448 pp.

18
 PRÁCTICA N° 2

“ESTRATEGIAS METODOLÓGICAS PARA ESTUDIO DE LA

DIVERSIDAD, SUCESIÓN ECOLÓGICA Y AISLAMIENTO DE
MICROORGANISMOS FOTOSINTÉTICOS, MEDIANTE EL USO DE
LA COLUMNA DE WINOGRADSKY”

Introducción:
El estudio de las comunidades microbianas en condiciones de laboratorio puede realizarse
fácilmente en una columna de Winogradsky, la cual simula un microecosistema o
microambiente que ilustra cómo los microorganismos ocupan microespacios altamente
específicos de acuerdo con sus requerimientos de carbono, energía y oxígeno. Así como, la
interdependencia, metabólica de un microorganismo con respecto a otro; de tal forma que
se posibilita el crecimiento de otros y viceversa.

Las columnas de Winogradsky, deben su nombre al microbiólogo ruso que las utilizó por
primera vez, y se preparan con muestras de suelo colectadas en ambientes húmedos en
cilindros de vidrio o de plástico. Estas pueden ser enriquecidas con compuestos orgánicos e
inorgánicos y finalmente son expuestas a una fuente de luz natural o artificial. En ellas se
observa que a partir de 3 ó 4 semanas de incubación aumenta la diversidad de
microorganismos, y que de acuerdo con sus características fisiológicas se establecen en las
diferentes zonas a lo largo de la columna. De esta forma, el resultado es una columna
estratificada (zonas de diferente color) tanto en el suelo como en el agua, donde cada
estrato se relaciona con un proceso químico-biológico.

Los tres estratos o zonas corresponden anaerobio, el microaerofílico y el aerobio (Fig. 1), y
en los cuales se desarrollan comunidades microbianas específicas:

1.-Zona anaeróbica:
Se localiza en el fondo de la columna y con crecimiento de dos tipos de organismos: los
que fermentan la materia orgánica y los que realizan la respiración anaerobia. Ambos
descomponen la materia orgánica y dan lugar a la formación de ácidos orgánicos, alcoholes
y H2 .

19
El nivel más bajo de esta zona se caracteriza por formar un ambiente con alta concentración
de H2S, aparecen varios grupos diferentes de bacterias, dependiendo del sedimento o suelo
seleccionado. Entre estas se pueden identificar a:

a.- Amoebacter (bacterias púrpura del azufre portadoras de vesículas de gas, las cuales
aparecen formando una banda de color rosado).

b.- Clostridium: para el caso en que se hay incluido restos de celulosa y en condiciones
estrictamente anaeróbicas.

c.- Desulfovibrio : representante de las bacterias reductoras del azufre y las cuales utilizan
el sulfato, u otras formas parcialmente oxidadas de azufre como el tiosulfato, generando
grandes cantidades de H2 S y que al reaccionar posteriormente con compuestos férricos
producen S2Fe, que da color negro. Es por esto que los sedimentos acuáticos son
frecuentemente negros.

2.-Zona microaerofílica:
En esta zona el crecimiento se visualiza bajo la forma de dos bandas estrechas, por encima
del sedimento y con presencia de concentraciones reducidas de H 2S. Las bacterias
fotosintéticas identificadas son las siguientes:

a.-Verdes del azufre (Chlorobium): se caracterizan por procesar los sulfatos a azufre y
aparecen entre una franja verdosa.

b.- Gallionella: procesan el Hierro formando una capa negra que se forma justamente por
debajo de la anterior.

c.- Bacterias púrpuras del azufre (Chromatium): caracterizada por su color rojo-púrpura.
Estas bacterias del azufre, verdes y púrpuras, obtienen energía de las reacciones luminosas
y producen sus materiales celulares a partir de CO 2.

c.- Bacterias púrpuras no del azufre (Rhodospirillum y Rhodopseudomonas): anaerobios

fotoorganótrofos que sólo pueden realizar la fotosíntesis en presencia de una fuente de
carbono orgánico.

3.-Zona aerobia:
La parte superior de la columna de agua puede contener abundantes poblaciones de
bacterias de diferentes tipos, eucariotas como flagelados, ciliados, amebas, lo que les
permite moverse y establecerse en nuevas áreas. De igual manera se desarrollan las

20
microalgas y cianobacterias procedentes directamente del agua o del barro utilizado
originalmente en el montaje de la columna.

De acuerdo al tipo de muestra se podrán observar una diversidad de estos dos grupos o una
especificidad; según nutrientes y otras condiciones de mantenimiento de la columna. Esto
significa que se puede proceder al proceso de aislamiento de los mismos. Generalmente se
detecta crecimiento abundante de diatomeas, a veces clorofitas o euglenofitas. Y con el
tiempo de incubación se apreciará la denominada sucesión ecológica, que consiste en la
aparición de abundancia y predominio de ciertos grupos, según el grado de adaptación a
esas condiciones y estrategias de competencia de las especies.

En la presente actividad práctica, los estudiantes colectaran muestras de diferentes

ambientes acuáticos para ser utilizadas como inóculo de microorganismos tanto
heterotróficos como fotoautotróficos y así como también de nutrientes existentes en dichos
sedimentos o suelos y el posterior enriquecimiento con medios de cultivo, SNa 2, u otros
nutrientes.

OBJETIVOS.

Mediante el empleo de una columna de Winogradsky, el estudiante logrará:

Aplicar e interpretar los conocimientos de las diferentes técnicas utilizadas para la

caracterización de microorganismos a lo largo de la columna.

Diferenciar los grupos microbianos presentes en un microambiente, especialmente

al de bacterias fotosintéticas, cianobacterias y microalgas.

Relacionar la diversidad microbiana presente en un microambiente con algunas de

sus características fisiológicas.

Explicar las causas que originan la sucesión de microorganismos observada en

función de los requerimientos de carbono, energía, oxígeno y otros nutrientes a lo
largo del tiempo.

Aislar bacterias fotosintéticas, cianobacterias y microalgas observadas a lo largo de

la columna, bien sea en la superficie o profundidad del sedimento, columna de agua,
biofilm formado en la pared del vidrio y en la superficie superior del agua.

Determinar existencia de abundancia y dominancia de especies fotosintéticas.

Integrar los resultados obtenidos en los diferentes tiempos del muestreo de la

columna.

21
Figura 1. Zona anaeróbica, microaerofílica y aeróbica identificadas, gradientes de
concentraciones de compuestos sulfurados y oxígeno a lo largo de la columna de
Winogradsky.

I.-PROCEDIMIENTO PARA EL MONTAJE DE LA COLUMNA:

1. Colectar una cantidad de suelo, lodo o barro ricos en materia orgánica, de un

volumen aproximado de 150 mL. Remover las piedras, ramas o partículas grandes
del material en estudio.

2. Seleccionar cilindros graduados preferiblemente de una capacidad de 500mL.

22
 3. Adicionar luego, el agua de la muestra, para el caso de que haya sido colectada de
un estanque, laguna, etc.

4. Esta agua puede mezclarse con medio de cultivo para microalgas o cianobacterias
en una proporción de 1:1, o con un 10-30% del medio, hasta alcanzar la capacidad
máxima de volumen del cilindro.

5. Resuspender el material con una varilla de vidrio hasta que por densidades se
depositen todos los componentes. A veces, el exceso de arcilla o compuestos
coloidales no permiten una deposición total del sedimento (Fig. 2).

Figura 2: Columna en proceso de maduración (izquierda) y columna recién

empaquetada (derecha).

6. Registrar el aspecto final de la columna (color del sedimento y del líquido, olores).

7. Para colectar muestras de la columnas, se recomienda amarrar uno o mas

portaobjetos con muescas para mantenerlos en cada nivel de la columna (inferior,
intermedio y superior) a fin de que se depositen o que colonicen algunos
microorganismos dichas superficies y así permitir una mejor observación e
identificación de los mismos.

8. Incubar a temperatura ambiente (25 a 30°C) cerca de una ventana para que reciba
iluminación o bajo una lámpara fluorescente con una intensidad luminosa reducida.

23
II.- INSTRUCCIONES PARA EVALUAR LOS CAMBIOS FÍSICOS,
QUÍMICOS Y DE LA BIOTA PRESENTE EN LA COLUMNA.

1.- Observar la columna y registrar, en la Tabla 1, los cambios físicos producidos con
respecto al aspecto inicial.

2.- Tomar muestras de los diferentes niveles de la columna, con una pipeta de vidrio,
iniciando en la superficie y terminando en la zona más profunda. Esto se realiza para
describir las variaciones en la composición microbiana fotosintética a diferentes tiempos.

3.- Hacer al menos 2 preparaciones de cada una de las muestras. Tener cuidado de enjuagar
la pipeta con agua corriente entre las distintas tomas de muestra y colocar la muestra al
microscopio para su observación. Para el caso de iniciar aislamientos introducir una
pequeña muestra en un tubo de ensayo no estéril con medio de cultivo, dependiendo del
microorganismo que se desee separar.

4.- Registrar y esquematizar en la Tabla 2, los microorganismos observados. Las bacterias,

cianobacterias y microalgas no identificadas deben de ser caracterizadas morfológicamente
para contribuir a su clasificación posterior.

5.-Comparar los esquemas, de acuerdo a las observaciones realizadas en las Tablas 1 y 2,

e identificar los cambios físicos que tienen lugar en la columna a lo largo del tiempo y
describir la sucesión de los microorganismos.

6.- Registrar las características microscópicas y fisiológicas de los microorganismos

presentes en la columna de Winogradsky después de la cuarta semana de incubación
(Tabla 3).
7.- Para el caso de que el tiempo de estudio sobre diversidad microbiana fotosintética sea
superior a un mes, se continuará registrando la presencia de bacterias, microalgas y
cianobacterias, con la finalidad de ir demostrando la sucesión ecológica y de verificar los
microorganismos que resulten los más adaptados a las condiciones finales del estudio.

8.- Integrar los resultados obtenidos en los diferentes tiempos del muestreo.

24
III.- REGISTRO DE RESULTADOS EN CADA UNA DE LAS TABLAS:

TABLA 1. Observaciones físicas de la columna de Winogradsky por semana.

Semana Zona de la Observaciones (sedimentación, color uniforme o presencia de
columna bandas, formación de burbujas, olor característico, zooplancton, larvas,
etc.)
1

X: de acuerdo al período de observación.

Tabla 2. Observaciones en las primeras cuatro semanas de la columna de

Winogradsky.
Semana Requerimiento Diversidad* Diversidad Orden
de Oxígeno: Zona superior, de morfológica De abundancia
intermedia e inferior microorganismos

25
 6

Nota: Para cada zona se debe tomar muestras y observar: diversidad de especies, morfológica
y abundancia, o desaparición de especies.

Tabla 3. Características microscópicas y fisiológicas de los microorganismos

presentes en la columna de Winograsky, al final del período de estudio.
Requerimiento Diversidad de Géneros Cepas aisladas
Semana de Oxígeno: Zona superior, microorganismos. representativos por
intermedia e inferior Características orden de abundancia
fisiológicas**

Nota: características fisiológicas: presencia de organismos amilolíticos, fijadores de nitrógeno, solubilizadores

o mineralizadores de fósforo, formadores de biofilms, etc.

26
IV.- RECOMENDACIONES PARA LA PRESENTACIÓN DE LAS
CONCLUSIONES:
1.-Se debe de ratificar si hubo diversidad de los microorganismos y si esta fue observada
durante todo el período de estudio.

2.-Indicar los microorganismos más abundantes en cada zona aeróbica, microaerofílica y

anaeróbica.

3.-Si hubo depredación por parte de protozoarios, larvas y otros representantes del
zooplancton.

4.-Indicar la semana a partir de la cual se inició el proceso de sucesión ecológica, o cambio

de las poblaciones de microorganismos fotosintéticos; además de los que fueron mas
competitivos.

5.-Reportar grupos con características fisiológicas resaltantes, tales como fijadores de

nitrógeno, formadores de biofilm, flagelados.

6.-Reflejar que la técnica de la columna de Winogradsky puede ser utilizada para el

aislamiento de bacterias verdes o púrpuras, cianobacterias y microalgas.

7.- Expresar de forma integrada el aprendizaje en cuanto: al manejo de técnicas

microbiológicas, comprensión de la ecología microbiana, monitoreo de sucesión ecológica,
importancia de la formación del gradiente de luz, oxígeno y de compuestos sulfurados, para
el establecimiento de una diversidad en función de estas variables ambientales.

Bibliografía
Atlas, R. y Bartha, R . 2001. Ecología Microbiana y Microbiología Ambiental. 4ª Edición.
Ed. Addison Wesley
López, J. 2008. La Columna de Winogradsky. Un ejemplo de Microbiología Básica en un
Laboratorio de Educación Secundaria. Revista EUREKA sobre la enseñanza de la
Educación de las Ciencias, 5 (3): 373-376. Cádiz-España.

Madigan, M., Martinko, J. y Parker J. 1997. La Herencia de Winogradsky. En “Brock”:

Biología de los Microorganismos. 8 a Edición. Prentice Hall. Pp 493.
Vullo, D., Wachsman, M., Alche, L. 2000. Microbiología en Práctica. Manual de técnicas
de laboratorio para la enseñanza de Microbiología Básica y Aplicada. Primera edición,
Editorial Atlante S.R.L., Buenos Aires.

Estudio de la diversidad microbiana en un microambiente. Guía para la interpretación de la

diversidad y sucesión microbiana en una columna de Winogradsky. ME1515 - 2011/1 -
Práctica 7.

27
 PRÁCTICA N° 3
"USO DE MEDIOS DE CULTIVOS COMERCIALES Y
ARTESANALES, GENÉRICOS Y SELECTIVOS PARA CULTIVO DE
MICROORGANISMOS FOTOSINTÉTICOS"

Introducción
El cultivo de todo tipo de microorganismo amerita del uso de medios nutritivos para su
crecimiento, mantenimiento, y para estudios bioquímicos, clínicos, biotecnológicos y
ambientales, bien sea en medio líquido o en medio sólido. Muchos de estos medios de
cultivo son formulados para grupo de microorganismos con características fisiológicas
comunes. Así mismo, cada medio de cultivo varía en sus concentraciones y naturaleza
química de los nutrientes, existiendo algunos que son utilizados sobre agua destilada, agua
dulce, agua de mar e incluso en otras aguas enriquecidas en nutrientes.

En cuanto al estudio de bacterias fotosintéticas, cianobacterias y microalgas, se han

diseñado medios genéricos; lo cuales contienen todos los nutrientes y en especial a las
fuentes de C, N y P; además de los oligoelementos. No obstante, también se han descrito
diferentes medios selectivos; cuyos componentes químicos estimulan el crecimiento de
ciertos grupos funcionales de estos microorganismos, y en cambio inhiben la presencia de
otros, por falta de algún nutriente esencial, exceso o por la adición de fuentes de donadores
de electrones o fuentes de carbono que solo favorecen al grupo de microorganismos que
solo es dependiente de tales requerimientos.

Esta guía de Laboratorio incluye diversos medios de cultivos para los tres grupos de
microorganismos fotosintéticos y que dependiendo del hábitat de cada uno de ellos, se
tomaran en cuenta las condiciones fisicoquímicas y ambientales de su entorno natural al
momento de seleccionar los medios de cultivos que pueden favorecer un crecimiento
sostenido de cada uno de estos.
Se recomienda altamente, considerar la concentración de los nutrientes esenciales y de
oligoelementos que puedan ser esenciales para cada microorganismo. Esto es con la
finalidad de establecer si el cultivo va ser limitante, suficiente o excesivo en cuanto a N, C,
P o algún oligoelemento.

28
De igual manera, es necesario determinar la relación N/C, N/P, Si/N para cada uno de los
grupos. Para el caso del Silicio, solo se puede considerar para las diatomeas y si son
marinas, estimar la concentración de silicatos, además de las de nitrógeno y fosfato.
Incluyendo también los nutrientes adicionados, si el agua de mar ha sido enriquecida con
algún medio de cultivo.

Consideraciones a tener presente al momento de diseñar formulaciones

para medios de cultivos o utilizar los recomendados:

1. La concentración de sales dependerá del hábitat de procedencia del organismo

(agua dulce, suelo, ambientes marinos, hipersalinos, aguas sulfatadas,
carbonatadas, termales, aguas residuales, etc).
2. La composición y concentración de los componentes iónicos mayoritarios tales
como el K, Mg, Na, Ca, sulfato y fosfato.
3. Al ser el crecimiento altamente dependiente de la disponibilidad de nitrógeno, se
deben estimar las fuentes de nitrógeno; tales como nitrato, amonio o urea. En el
caso de cianobacterias fijadoras de nitrógeno no es necesaria la presencia de estas
fuentes.
4. La fuente de carbono más comúnmente utilizada es el CO2 gaseoso suministrado en
la aireación de los cultivos, o adicionalmente a partir de diferentes proporciones con
el aire (0,03-5%). Otra fuente es el bicarbonato o el carbonato, todo dependerá del
pH de cultivo óptimo del organismo.
5. El pH de procedencia o el que se ha reportado como óptimo para algún
microorganismo específico.
6. Presencia de elementos traza y el uso de agentes quelantes (citrato y EDTA).
7. El uso de vitaminas, para muchas algas marinas.

Clasificación de medios de cultivos para microorganismos fotosintéticos:

Generalmente se utilizan los de Medios de cultivo definidos: caracterizados por incluir la

concentración y fórmula de cada uno de los componentes. Estos son preparados a partir de
soluciones stock previamente mezcladas. Las alícuotas de estas soluciones son medidas y
agregadas a un volumen dado de agua.

29
 En algunos casos los componentes indicados son pesados y agregados directamente al
volumen de agua destilada, quedando así preparado el medio. Los procedimientos
incorrectos pueden causar precipitaciones, especialmente de los nitratos y fosfatos. Las
soluciones stock pueden prepararse y almacenarse en frio por largo tiempo, para lo cual se
recomienda el uso de recipientes con tapa de vidrio.

Estos medios son también denominados sintéticos; los cuales pueden ser comerciales o
prepararse en cada laboratorio. Entre las ventajas se incluyen, el de ser fáciles de realizarse,
reconstituirse y de conservarse en el laboratorio.

El otro grupo de medios de cultivos, son aquellos en los que no se conocen el contenido
específico de cada uno de sus componentes y corresponden a los no definidos o complejos.

Entre las variedades de estos medios de cultivos se incluyen los siguientes:

Los basados en agua naturales enriquecidas con suplemento mineral. Por ejemplo,
el agua dulce o el agua de mar natural con diferentes nutrientes químicos.
Derivados de residuos de origen animal o vegetal.
Aguas s residuales urbanas, agropecuarias o industriales, si su contenido no está
afectado por metales pesados o compuestos tóxicos. Generalmente, están deben de
haber sido procesadas mediante tratamiento secundario y terciario.
Extractos de productos agrícolas procesados o biodegradados; tales como fracciones
solubles de tubérculos, frutas, semillas, harinas.
Extractos de suelos enriquecidos con algunos nutrientes.
Medios organotróficos elaborados en laboratorio con inclusión de extracto de
levadura, glucosa, peptona, hidrolizados de proteínas, sueros procedentes de
queserías, etc.

Descripción de diferentes medios de cultivos (agua dulce):

I.-Para microalgas y cianobacterias de agua dulce, se debe tomar en cuenta elpH del medio,
las concentraciones de los macronutrientes y la composición de micronutrientes, la fuente
de nitrógeno, los posibles factores orgánicos o de crecimiento para el enriquecimiento y
la fertilización de aguas de río o de lago, con medios de naturaleza artificial o, de
composición química conocida.

30
Medios de cultivos:

1. MEDIO BEIJERINCK (pH 6.8):Se compone de 3 soluciones stock de macronutrientes

y una de micronutrientes.

Los macronutrientes se preparan en tres soluciones stock (I, II, III) y la de micronutrientes
(Stock IV), se disuelven uno por uno en 100ml de agua tibia, luego el pH se ajusta a 5 con
KOH granulado. La solución final debe tener un pH 6,5 y considerar que el hierro precipita
en pH 7; lo cual hará poco disponible su asimilación por parte de las microalgas.

SALES CONCENTRACIÓN
Stock I (g/L) (100ml/L)
NO3NH4 1.5
PO4K2 0.2
SO4Mg.7H2O 0.2
Cl2Ca 0.1
Stock II (g/L) (40ml/L)
PO4H2K 9.07
Stock III (g/L) (60ml/L)
PO4HK2 11.61
Stock IV (g/L) (1.0 ml/L)
BO3H3 1.0
SO4Cu.5H2O 0.15
EDTANa2 5.0
SO4Zn.7H2O 2.2
Cl2Mn.4H2O 0.15
Mo7O24(NH4)6.7H2O 0.1

2. MEDIO BOLD BASAL (pH 6, 6 ) o SOLUCIÓN BRISTOL: Se compone de 1

solución stock de macronutrientes y 4 de micronutrientes.

SALES CONCENTRACIÓN
Stock I (g/400mL) (60ml/L)
Macronutrientes
NO3Na 10.0
PO4HK2 3.0
SO4Mg.7H2O 0.2
Cl2Ca.2H2O 8.0
PO4H2K 7.0
ClNa 1.0
Stock II: Micronutrientes (g/L) (1.0 ml/L)
EDTA.Na2 50.0
KOH 21.0
(g/L) (1.0 ml/L)

31
SO4Fe.7H2O 4.98
H2SO4 1.0

BO3H3 (g/L) (1.0 ml/L)

11.42
Stock III: Trazas (g/L) (1.0 ml/L)
SO4Zn.7H2O 8.8
Cl2Mn.4H2O 1.44
MoO3Na 0.71
SO4Cu.5H2O 1.57
(NO3)2Co.6H2O 0.49

3. MEDIO CHUN Nº 10 (pH 6,5 - 7,0): se incluyen las sales conforme por orden de
aparición en la fórmula; por lo que se recomienda seguir la secuencia propuesta para la
mezcla.

SALES CONCENTRACIÓN
Stock I (g/L)

(NO3)2Ca 0.04
PO4HK2 0.01
SO4Mg.7H2O 0.025
CO3Na 0.02
SiO3Na2 0.025
Cl3Fe 0.8

4a.-MEDIO BG-11 (RippKa et al, 1979): medio selectivo para cianobacterias, con
presencia de nitrato (BG11) y sin nitrógeno (BG11o) más selectivo para las fijadoras de
nitrógeno. En caso de que se trate de cultivar cianobacterias marinas, se utilizará agua de
mar enriquecida con el medio o agua destilada con ClNa a 35UPS (3,5%).

Solución 1a (para 1 l de solución)

Reactivo Cantidad (g)
NaNO3 150
MgSO4 . 7H2O 7
CaCl2 . 2 H2O 3,6

Solución 1b (para 500 ml de solución) sin nitrógeno

Reactivo Cantidad (g)
MgSO4 . 7H2O 7
CaCl2 . 2 H2O 3,6

32
Solución 2 (para 1 l de solución)
Reactivo Cantidad (g)
K2HPO4 . 3 H2O 4
EDTA 0,1
Na2CO3 2

Solución 3 (para 1 L de solución)

Reactivo Cantidad (g)
Ácido cítrico 0,6
Citrato de amonio 0,6

Solución 4 (para 1 L de solución)

Reactivo Cantidad
H3BO3 2,86 gr
MnCl2 . 4H2O 1,81 gr
ZnSO4 . 7H2O 0,22 gr
NaMoO 4. 5H2O 0,39 gr
CuSO4 . 5H2O 0,8 gr
Co(NO3)2. 6H2O 0,05 gr
FeCl3 0,22 gr
La mezcla para un litro de medio es:

1 A o B (para con o sin nitrógeno): 10 mL

2 10 mL
3 10 mL
4 1 mL

4b.-MEDIO BG110 : contenido de sales en mM y µM.

Na2CO3 0,2 mM H3BO3 46 µM

MgSO4 0,3 mM MnCl2 9,1 µM
CaCl2 0,24 mM Na2MoO4 1,6 µM
K2HPO4 0,2 mM ZnSO4 0,8 µM
ácido cítrico 28,5 µM CuSO4 0,3 µM
citrato férrico-amónico (17% Fe) 6 mgl-1 CoCl2 0,2 µM
Na2-EDTA 2,4 µM

Para medio sólido se utiliza Bacto-Agar a concentración final 1% p/v. Éste se

autoclava, en la mitad de volumen final, por separado de los nutrientes y se mezcla
con los mismos antes de verterlo en las cajas Petri
33
 OTRAS CONSIDERACIONES PARA LA PREPARACIÓN DE MEDIOS DE
CULTIVOS PARA CIANOBACTERIAS:

La composición de diferentes medios de cultivo de cianobacterias de agua dulce,

difieren principalmente en sus contenidos de nitrógeno combinado, fosfato, tipo de
quelante y en la concentración y/o forma de hierro. Algunos de los medios difieren
marcadamente en su complejidad y/o concentración de sus metales traza.

Para el aislamiento y mantenimiento de especies de cianobacterias fijadoras de

nitrógeno la fuente de nitrógeno combinado (NaNO 3, KNO3) se ha de reemplazar
por el cloruro correspondiente (aunque no siempre se haga) y no olvidar añadir
alguna sal de molibdeno.
Si lo que se necesita es obtener grandes rendimientos celulares se necesitará un
medio enriquecido (Kratz y Mayers).
Si el propósito es dilucidar los rasgos morfológicos, citológicos y fisiológicos que
son característicos en poblaciones naturales se ha de usar un medio bajo en
nutrientes.
Para que se desarrollen los acinetos se utilizará un medio deficiente en fósforo;
también servirá para la formación de pelos en especies de Calothrix. Por el contrario
un exceso de fósforo favorecerá el desarrollo de hormogonios en algunas especies
de cianobacterias.

Al variar la concentración de nitratos del medio original se pueden obtener mejores

resultados al aislar cianobacterias de hábitat naturales.
Evitando la presencia de citratos se evita la aparición de H 2O2, tremendamente
tóxico.
Como regla general, se han de usar medios con contenidos bajos (o incluso que
carezcan) de metales traza, mejor que aquellos con un exceso de estos metales que
en algunos casos pueden resultar tóxicos (Cu). Esto es debido a que incluso las sales
más puras contienen impurezas de metales pesados u otros contaminantes que son
especialmente inhibitorios en especies de ambientes oligotróficos.

34
 El uso de fosfato como tampón del medio no es aconsejable ya que las
concentraciones necesarias para esta función son inhibitorias para muchas especies
y es utilizado como nutriente.
Se aconseja la inclusión de Ni y Se ya que se han demostrado como esenciales para
algunas cianobacterias.

El medio BG-11 permite el crecimiento de una gran variedad de cianobacterias de

suelo y agua dulce y se utiliza habitualmente para el mantenimiento de colecciones.
Este medio utiliza concentraciones de nitrato muy altas y concentraciones de fósforo
relativamente bajas (la relación molar en el medio es de 99:1).Sin embargo, la
concentración de nitratos suele disminuirse. BG-110 carece totalmente de nitratos y
se usa para el crecimiento de cianobacterias fijadoras de nitrógeno.

El medio ALLEN y ARNON contiene altas concentraciones de nitratos (sal sódica y

potásica) y moderadas concentraciones de fósforo (10:1). Este medio se ha diseñado
para conseguir altos rendimientos celulares. Por lo general, cuando se realizan
cultivos líquidos se utiliza diluido a 1/1, 1/8 e incluso a 1/16. En cultivos sólidos se
suele mantener la composición original. Para crecer las cianobacterias en
condiciones de fijación de nitrógeno se elimina la solución de nitratos.

Para la preparación de medios sólidos se ha de evitar la esterilización del medio de

cultivo (BG-11) con el agar, ya que se ha demostrado que se producen tóxicos. Para
otros medios quizás no sea el caso, pero sería aconsejable esterilizar el medio de
cultivo y el agar en soluciones separadas (al doble de su concentración) y mezclarlas
solo después de enfriar alrededor de 45ºC.

5.-MEDIO JORDÁN:

El agua necesaria para preparar el medio de cultivo debe ser limpia; el agua potable
es conveniente, pero si contiene demasiado cloro se debe airear; y se le agrega cierta
cantidad de sales que le den las características de agua salobre necesaria para el
crecimiento de Spirulina.

El medio de cultivo se obtiene disolviendo las siguientes sales minerales en el agua:

35
 INGREDIENTES G/L

Bicarbonato de sodio 8
5
ClNa
2
Nitrato potásico (o salitre)
1
Sulfato dipotásico
0,1
Fosfato monoamónico
0,2
Sulfato de magnesio (MgSO4.7H2O)
Solución de hierro ( 10 g de Fe/L) 0,1

Cal (si el agua es muy poco dura) 0,02

Nota: Todas las sales son agrícolas.

6.-MEDIO EUGLENA:
Acetato de sodio 1g
Extracto de carne 1g
Bactotriptona 2g
Extracto de levadura 2g
CaCl2.2H2O 10 mg
Nota: completar hasta un litro de agua destilada. Para medio sólido se utiliza bactoagar a una
concentración final de 1% p/v. El pH debe estar entre 5-6.

7.-Medio extracto de suelo:

La muestra de tierra no debe contener aplicaciones de fungicidas ni de insecticidas y la
menor cantidad de arcilla.

Instrucciones: mezclar un volumen de tierra en dos volúmenes de agua estilada y

autoclavar de 40 a 60 minutos o hervir por más de 60 minutos agitando constantemente.
Dejar el caldo en reposo durante la noche y luego filtrar. El extracto obtenido y la tierra son
altos contaminantes, por lo que deben manejarse con extremo cuidado en el laboratorio.

El extracto de suelo también suele utilizarse como medio de cultivo para euglenofitas y en
este caso se toma 1,0 gramo de suelo o lodo donde habitan estas microalgas, se le añade 0,5
g de carbonato de sodio y luego se diluye en 100 ml de agua, se le agrega un frijol y luego
se autoclava. El sobrenadante es colectado y guardado en refrigeración para su uso (Gloria
Garduño/México, comunicación personal).

36
Recomendaciones:

 Los medios enriquecidos tienen la ventaja de estimular el crecimiento de un gran

número de especies de microalgas. Si estos, son muy orgánicos corren el riesgo de
contaminarse con bacterias e incluso hongos, más fácilmente que los inorgánicos.

 La fuente de nitrógeno generalmente se lo introduce como nitrato y a veces como

amoníaco, urea o amino ácidos.

 Para el caso del medio BOLD BASAL o BRISTOL se puede reemplazar la fuente
de nitrato por la de amonio y en su defecto, se puede preparar un solución stock de
urea con 54 g / l en agua destilada y luego se utiliza 10ml de esta solución, como
fuente de nitrógeno para reemplazar al nitrato en dicho medio Bold Basal.

 Las vitaminas como cianocobalamina, biotina y tiamina son requeridas por muchas
microalgas cuando crecen en cultivos axénicos. Ellas son usadas en muy bajas
concentraciones y almacenadas en solución stock bajo congelación y pueden ser
autoclavadas o filtradas al medio esterilizado. Estas son esenciales en los cultivos
axénicos (libre de bacterias); mientras que, al estar presentes, como en los cultivos
monoespecíficos cumplen la función de suplir vitaminas directamente al cultivo.

Grupo de microorganismos fotosintéticos que pueden ser cultivados con los medios de
cultivos indicados:
Medios definidos Grupos de Microorganismos fotosintéticos
BEIJERINCK clorofíceas
BOLD BASAL clorofíceas, crisofíceas, rodofíceas, cianobacterias
CHU N°10 diatomeas, clorofíceas, crisofíceas, cianobacterias
Enriquecidos clorofíceas, crisofíceas, rodofíceas, cianobacterias
BG11 cianobacterias

37
Descripción de diferentes medios de cultivos (marino):

El agua de mar es de por sí un medio propicio para el crecimiento de miccroalgas y

cianobacterias marinas. Este es un medio natural complejo provisto de más de 50 elementos
conocidos (componentes) y un elevado número de compuestos orgánicos variables. Este
medio marino generalmente es fortalecido cuando se le añaden nutrientes como el
nitrógeno, el fósforo, el hierro y otros.

Consideraciones:

El uso de estabilizadores (buffers) del pH no tóxicos y quelantes han facilitado la

esterilización por calor de los medios marinos, sin que éstos se precipiten. Los
aparatos de filtración son en muchos casos convenientes para esterilizar estos
medios debido a la rapidez y facilidad con que se lo hace.

Las dificultades encontradas en el desarrollo de los cultivos algales están a menudo

relacionadas con los problemas de aislamiento, manipulación, incubación y
situación fisiológica del organismo.

Los reactivos empleados en la preparación de un medio pueden ser del grado

reactivo o grado técnico, dependiendo de la calidad del cultivo que se va a realizar.
Los químicos de grado reactivo (QP) se usan en la preparación de medios para
cultivo menores o para estudios más rigurosos o que demanden tal grado de pureza.
Estos medios tienen elevado costo, a diferencia de los que se preparan con grado
técnico y se usan mayormente en cultivos masivos.

Los micronutrientes se usan para enriquecer medios marinos y mayormente se

utilizan el zinc, manganeso, molibdeno, cobalto, cobre y el hierro. Es conveniente
usar sales hidratadas para facilitar su dilución cuando se prepara la solución de
metales traza.

Estos metales son agregados en forma quelada, siendo el Na 2EDTA el principal

quelante y con el que se evitan precipitados durante la combinación de las sales. El

38
 cobalto, cobre, manganeso, molibdeno y zinc se los puede preparar por separado
como soluciones stock primarias y diluídas, para luego formar una solución stock.

Otra forma de preparar la solución stock de metales traza es con el 80 o 90% del
volumen de agua destilada requerida, disolver primeramente el Na 2 EDTA y a
continuación el hierro, luego se irán disolviendo uno a uno los metales restantes y
agitando constantemente.

Los micronutrientes orgánicos más utilizados son las vitaminas cianocobalamina,

biotina y tiamina HCl. Estas pueden combinarse para formar una sola solución stock
de trabajo y se puede ajustar el pH entre 4.5 y 5.5, lo cual permite su autoclavado y
preservación posterior bajo congelación

Algunas sales no se preparan como soluciones stock debido a su baja solubilidad

(NaCl, SO4 Mg, KCl y SO4Na2. El nitrógeno es agregado como NaNO3. El
amoníaco como cloruro de amonio (ClNH 4) en un máximo de 0.1 mM/L debido a
su toxicidad para algunas especies.

Buena parte del nitrógeno puede volatilizarse durante el autoclavado, por lo que las
soluciones estériles se agregan asépticamente luego de que el medio se ha enfriado.
La úrea se descompone cuando se la calienta y debe ser agregada por filtración
estéril. Algunos aminoácidos también se degradan cuando son autoclavados en el
medio.

Cuando se cultivan diatomeas se procede a utilizar el Si, como elemento esencial

para la pared celular y es agregado como solución de metasilicato de sodio
(SiO3Na2) y debe disolverse aparte y acidificado a pH 2 con HCl concentrado para
luego formar la solución stock. De esta manera no se precipita al añadirlo al medio
de cultivo.

39
 El uso de buffers o tampones queda restringido, debido a que muchos de estos
pueden ser tóxicos y más cuando se utilizan concentraciones mayores. Además,
algunos son utilizados como fuente de carbono por las bacterias asociadas a las
microalgas y cianobacterias. Se recomienda monitorear el pH con soluciones de
HCl y de NaOH. Cuando se amerite el uso de tampones para estudios sobre efecto
del pH, se procederá a evaluarlos antes de dichos experimentos (Morales y col.
2002).

MEDIOS DE CULTIVOS MARINOS:

1.-MEDIO NAVÍCULA:

Ingredientes Concentración
NaNO3 1,18 mM
K2HPO4 77 mM
Na2SiO3 0,86 mM
Triptona 1 g/l

2.-MEDIO WALNE (1966).- medio usado para un gran número de microalgas.

Solución básica de nutrientes: (g/L)
Cl3Fe.6H2O 1,3
MnCl2.4H2O 0,36
BO3H3 33,6
Na2.EDTA 45
PO4H2Na.2H2O 20
NO3Na 100
Solución metales traza 1 ml: (mg/L)
Cl2Zn 2,1
Cl2CO.6H2O 2,0
NH4 Mo7O24.4H2O 0,9
SO4Cu.5H2O 2,0
Agregar 1 ml. de ésta solución por cada litro de agua
salada a enriquecer.
Solución de vitaminas: (mg)
Cianocobalamina (B12) 10
Tiamina HCl (B1) 200
Biotina (vit. H) 10
Esta solución debe ser acidificada a pH 4.5 antes de
autoclavarse. Agregar 0.1 ml. por cada litro de agua
salada.
Nota: es necesario acidificar ésta solución con HCl para obtener un líquido claro

40
3.-MEDIO “F/2” GUILLARD (1968).
Los nutrientes y el agua salada son autoclavados juntos después del ajuste del pH a 7.4.
Solución básica de nutrientes: (g/L)
PO4H2Na.2H2O 5
NO3Na 75
SiO3Na2.9H2O 15-30 mg
(El silicato es sólo para diatomeas
Solución metales traza 1 ml: (mg/L)
SO4Zn 0,022
Cl2CO.6H2O 0,01
Na2 Mo4.2H2O 0,006
SO4Cu.5H2O 0,01
MnCl2.4H2O 0,18
Cl3Fe.6H2O 3,15
Na2.EDTA 4,36
Agregar 1 ml. de ésta solución por cada litro de agua salada
a enriquecer.
Solución de vitaminas: (mg)
Cianocobalamina (B12) 0,5
Tiamina HCl (B1) 0,1
Biotina (vit. H) 0,5
Esta solución debe ser acidificada a pH 4.5 antes de
autoclavarse. Agregar 0.1 ml. por cada litro de agua salada.

4.-MEDIO ERDSCHREIBER (1927).

Este medio sencillo es utilizado para aislamiento y mantenimiento y ha sido usado para
algas unicelulares. El agua salada y los aditivos son esterilizados por separado y luego
combinados asépticamente. El Fe.EDTA y otros metales traza junto con las vitaminas
pueden reemplazar al extracto de suelo.

Solución básica de nutrientes cantidad

NO3Na 100,30-199,75 mg
PO4HNa2 7,90-19,80 mg
Extracto de suelo 50,0mL
Nota: Por cada litro de agua salada a ser enriquecida.

41
5a.-MEDIO ALGAL ANALÍTICO INDUSTRIAL (Fábregas et al.,1984).

Macro/microelementos Concentración Cantidad

(Mm) (mg.L-1)
SOLUCIÓN 1
ZnCl2 1,0 27,258
MnCl2.2H2O 1,0 39,582
NaMoO.4H2O 1,0 48,388
CoCl2.6H2O CuSO4 0,1 4,7586
CuSO4 0,1 3,1722
EDTA Nota: disolver en 200 mL de agua destilada 374,0
SOLUCIÓN 2
C6H5FeO.7H2O 20 1051,88
Disolver en 100 mL de agua.
SOLUCIÓN 3
Tiamina 7,0
Biotina 1,0
Cianocobalamina B12 0,6
Disolver la tiamina en 98 mL de agua destilada acida
(pH 4,5-5). Adicionar las otras vitaminas (Biotina y
Cianocobalamina B12)
SOLUCIÓN 4
2000 34,000
NaNO3 100 2,400
NaH2PO4
Disolver en 600 mL de agua destilada.
Nota: Las soluciones deberán ser autoclavadas y mezcladas en frío en un volumen
final de 1 Litro. Para iniciar un cultivo con una concentración de NaNO 3 en 4 Mm
se tomarán 10 mL de la solución stock y se adicionarán a 1L de agua de mar.

42
5b.-Medio ALGAL ALTO RENDIMIENTO (Fábregas, Ronson, J. y Otero, A. , 2011)
Macro/microelementos Concentración Cantidad
(Mm) (mg.L-1)
SOLUCIÓN 1
ZnCl2 1,0 27,258
MnCl2.2H2O 1,0 39,582
NaMoO.4H2O 1,0 48,388
CoCl2.6H2O CuSO4 0,1 4,7586
CuSO4 0,1 3,1722

MgSO4.7H2O 0,1 49,30

CaCl2 1,0 22,20
SiO2 1,0 12,02
SeO2 1,0 22,19
Na2SO4 0,1 2,84
EDTA
Disolver en 200 mL de agua destilada 514,0
SOLUCIÓN 2
C6H5FeO.7H2O 20 1051,88
Nota: disolver en 100 mL de agua destilada
SOLUCIÓN 3
7,0
Tiamina 1,0
Biotina 0,6
Cianocobalamina B12
Nota: disolver la tiamina en 98 mL de agua
destilada acida (pH 4,5-5). Adicionar las
otras vitaminas (Biotina y Cianocobalamina
B12)
SOLUCIÓN 4
2000 34,000
NaNO3 100 2,400
NaH2PO4
Nota: disolver en 600 mL de agua
destilada.
Nota: el medio de cultvo ALGAL DE ALTO RENDIMIENTO fue formulado en base a
investigación realizada (2010) y al cual se le ha añadido: Ca, Mg, Se, Si y S.

43
 6.-Medio Dunaliella.
Solución base (4X) (mM)
KCl 20
MgCl2.6H2O 20
Na2SO4 20
CaCl2.2H2O 0,8
Microelementos (1000x)
MnCl2.4H2O 7
CuCl2.2H2O 1
CoCl2.6H2O 1
(NH4)6Mo7O24.4H2O 1
NaNO3 5
NaCl 0,5 (solido)/3M (liquido)
KH2PO4 0,2
NaHCO3 50mM
3+
Fe -EDTA (1000x) 2µM
FeCl3.6H2O 2 µM
NaEDTA 5 µM
Nota : Esterilizar por autoclave (el KH2PO4 y el NaHCO3 se autoclavan por separado).
Para medio sólido se utiliza Agar a concentración final 1% p/v. Éste se autoclava, en la
mitad de volumen final, por separado de los nutrientes y se mezcla con los mismos
antes de verterlo en las cajas Petri.

ACTIVIDADES DE LA GUÍA PRÁCTICA:

1.-Comparar los diferentes medios de cultivo tanto de agua dulce como marino, en cuanto
a los macroelementos, oligoelementos y presencia de vitaminas, cuando sea el caso.
2.-Determinar la concentración de N, P, Si, S (mM) en cada medio y la relación N:P.
Concentraciones <4mM N, se consideran limitantes, concentraciones entre 4 y 8mM N, se
registran como suficientes; mientras que superiores a estas, entre 9 y 12mM, ya son
excesivas o superfluas.
3.-Las relaciones N: P entre 10 y 20, se consideran suficientes para la producción de
biomasa microalgal.
4.-Cual de los medios de cultivos contiene excesiva concentración de N?.
5.-Considerar la selección y concentración de las sales de hierro, puesto que la que
ocasiona los problemas de precipitación en los medios de cultivo.

44
6.-Indicar medios de cultivos incluídos en el grupo de medios complejos o indefinidos.
Que desventajas pueden presentar en relación a los medios definidos?.
7.- A que se denominan medios de cultivos enriquecidos?. Y de ejemplos.
8.- Cuales son las ventajas de utilizar amonion y urea en los medios de cultivo?
9.-Por qué el Si es esencial para el aislamiento y cultivo de diatomeas?
10.-Son las vitaminas necesarias para ser incluidas en cualquier medio de cultivo

lllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll
Bibliografía:

Boone, D., Castenholz, R y Garrity, G. 2001. Bergey`s Manual of Systematic Bacteriology.

Second Edition. Vol 1: The archaea and the deeply branching and phototrophic bacteria.

Delporte, C., Castro, G. y Navarro, A. 2008. PRACTICO N° IV BIOTECNOLOGÍA EN

MICROALGAS: Nutrición Algal.UNIDAD DE INVESTIGACIÓN. Universidad de Chile.

Fábregas, J., Abalde, J., Herrero C., Cabezas, B., and Veiga, M. 1984. Growth of the
marine microalgae Tetraselmis suecica in batch cultures with different salinities and
nutrient concentrations. Aquaculture 42: 207-215.

Leganés, F., Bolaños, L., Mateo, P., Quesada, A. y Perona, E. Curso sobre Técnicassnicas
Experimentales en Biología Vegetal. Licenciatura en Ciencias Biológicas. Universidad Autónoma de
Madrid. España.
Medios de cultivo. 2009. Instituto de Biología Vegetal y Fotosíntesis. Universidad de Sevilla.

Morales, E., Rodríguez, M., García, D., Loreto, C. y Marco, E. 2002. Crecimiento,
producción de pigmentos y exopolisacáridos de la cianobacteria Anabaenasp. pcc 7120 en
función del pH y CO2. INTERCIENCIA, 27 (7): 373-378.

Rippka, R., J. Deruelles, J. Waterbury, M. Herdman and R. Stanier. 1979. Generic

assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria. J. Gen.
Microbiol. 111: 1-61.

45
 Práctica N° 4:
"RECUENTO CELULAR"

Introducción:

Los microorganismos fotosintéticos comprenden a las bacterias púrpuras, bacterias verdes,

cianobacterias y microalgas. De acuerdo a su tamaño celular, morfología y agrupamiento en
forma de colonias o filamentos se pueden seleccionar la metodología para determinar su
población o densidad a partir de muestras colectadas en el medio ambiente y en cultivos
líquidos.

Para el caso de las bacterias fotosintéticas se recomienda el método de turbidez a una

longitud de onda seleccionada o el recuento de unidades formadoras de colonias en medio
sólido. La cuantificación de las cianobacterias está determinada por su morfología. Es decir,
las unicelulares o coloniales de un bajo número de células, como en Chroococcus, pueden
ser monitoreadas mediante el uso de cámara de recuento celular. Mientras que, las
filamentosas por peso seco, contenido de clorofila, ficocianina, ficoeritrina, o en algunos
casos mediante turbidez, cuando la población es homogénea en cultivos líquidos.

Las microalgas unicelulares flageladas o no mótiles y los cenobios pueden ser cuantificadas
también por cámara de recuento celular e incluso si los cultivos son de igual manera,
homogéneos se podrá estimar su población por turbidez, pero complementando con otros
métodos de cuantificación de biomasa (peso seco, clorofila).

Por otra parte, hay que tomar en cuenta si las muestras colectadas de cuerpos de aguas, o de
sedimentos, suelos y de cultivos líquidos contienen alto número de microalgas o
cianobacterias o una baja densidad de los mismos. En tal sentido, se recurre a las siguientes
metodologías cuando se seleccionan muestras con baja densidad de organismos:

Filtración:Uso de filtros de membranas para concentrar las células de fitoplancton,

permiten observar los organismos con aumentos relativamente altos y analizar un rango
específico en el tamaño de células, debido a la existencia de una gran variedad en cuanto al
tamaño de poro de los filtros.
46
En microscopio de Epifluorescencia: microorganismos Autótrofos y heterótrofos.

Centrifugación:permite concentrar fitoplancton, empleando una centrifugadora. Se debe

controlar la velocidad de centrifugación para evitar la ruptura celular y/o perdida de
flagelos.

Sedimentación: Es el método más conocido es el que implica el uso del microscopio

invertido. La técnica consiste en dejar sedimentar una muestra en un cilindro de
sedimentación. De manera tal, que después de cierto tiempo, todos los organismos
presentes en la muestra se encuentran en la base de vidrio de la cámara de sedimentación.
El cilindro se separa de la cámara, que tiene una altura menor que la distancia focal del
condensador, y luego se observan los organismos con el microscopio invertido

1. RECUENTO CELULAR: Cámaras de recuento

Esta técnica es utilizada cuando se disponen de suficiente población de células en una

muestra colectada y concentrada o en una muestra obtenida a partir de cultivos. De tal
manera, que el recuento al microscopio debe ser efectivo y reproducible; por lo cual es
importante saber seleccionar el tamaño de la muestra, la dilución, el tipo de cámara de
recuento, el objetivo del microscopio y la técnica de llenado de la cámara.

En algunos casos, puede ser necesario corroborar el volumen de la cámara que se está
utilizando. Para realizar el recuento celular se han diseñado diferentes cámaras que
contienen un volumen determinado de muestra entre una lámina y una laminilla rígida
(cubreobjeto especial) colocada sobre plataformas laterales a una altura establecida
(Alfonso y Leal, 1998).

Una de las más usadas para cultivos de microalgas es el hematocitómetro de 0.1 mm de

profundidad con reglilla de Neubauer (Figura 1). En cambio, para microalgas de mayores
dimensiones, como muchos dinoflagelados, los tipos de cámara que se utilizan más
comúnmente son: de Sedgwick-Rafter o el hematocitómetro de 0.2 mm de profundidad
con reglilla de Fuchs-Rosenthal. En la Tabla 1 se dan las principales características de las
cámaras más comunes utilizadas para la determinación de la densidad celular
(Células/mL).

47
Tabla 1. Nombre comercial, volumen útil de recuento, profundidad, objetivos usados,
tamaño de las células en la muestra e intervalo de densidades celulares recomendables
para las cámaras más comunes utilizadas para el recuento celular de
microorganismos (Guillard y Sierracki, 2005).
Nombre Volumen Profundidad Area Objetivos Tamaño cél/mL
(μL) (mm) (mm2) Celular (μm)

Petroff Hauser 0.2 0.02 10 40-100 0.5 - 5 106– 108

Speirs Levy 0.4 0.2 2 10-20 5-75 104-106
Hematocitómetro 0.9 0.1 9 20 2-3 104-107
(Neubauer
Hematocitómetro 3.2 0.2 16 10-20 5-75 104-106
(Fuchs-
Rosenthal)
Palmer Maloney 100 0.4 250 10-45 5-150 102-105
Sedgwick-Rafter 1000 1 1000 2.5-10 50-500 30-104

2. Descripción de la cámara de Neubauer:

En la mayoría de los laboratorios, la cámara de recuento que se utiliza es el

hematocitómetro de 0.1 mm de profundidad con reglilla de Neubauer, la cual consta de 9
cuadrados con lados de 1 mm (área total de recuento = 0.9 mm2). Cada uno de los cuales
corresponde a un volumen de 0.1 μL. Los cuatro extremos están subdivididos en 16
cuadros pequeños (Figura 1). El cuadro central contiene 25 cuadros, cada uno con un área
de 0.04 mm2 (0.2 mm x 0.2 mm), a su vez divididos en 16 cuadros más pequeños (Fig. 1).

Para células más grandes de 6 μm y con cultivos relativamente poco concentrados, se

recomienda que el recuento se haga en los cuatro cuadros marcados como A, B, C y D;
aunque en varios laboratorios se prefiere contar por lo menos un cuadro adicional,
seleccionado al azar.
Cuando las células son pequeñas y la concentración de los cultivos es muy alta, se pueden
utilizar cinco cuadros menores del cuadro central marcado con X.

48
Figura 1. Cuadrantes de la cámara de Neubauer de 9 mm2.

3. Fórmula para determinar el recuento celular:

DC = N x104x (F.d)

DC = densidad celular (x10 4 cél/mL)

N = promedio de células presentes en 1 mm 2(0.1 μL). Este número de células se divide de

acuerdo al número de cuadrantes contados.

Por ejemplo, si se contaron 245 en los 4 cuadrantes de una de las dos cámaras, entonces
4
la población de células corresponde a: 61,25x10 cél/mL.

104= factor de conversión de 0.1 μL a 1 mL

F.d = factor de dilución (cuando se considera necesario diluir la muestra).

F.d: (Vol i.+Vol. F/vol. i)

Nota: Si se toma 1 mL de muestra de un cultivo o de una muestra ambiental y 9 mL de agua

destilada para diluir. El volumen total es 10 mL y el factor de dilución es = 10.

49
4. Protocolo para el recuento celular con cámara de 0.1 mm (Neubauer)

Instrucciones:

a) Agitar el cultivo para permitir que las células tengan una distribución homogénea.

b) Tomar una muestra de 1 mL y colocarla en un tubo previamente lavado y seco. Agregar

una gota de lugol para fijar las células.

Nota: Preparación de la solución de lugol: (Solución A: pesar 10 g de KI y disolver en 100 mL de

agua destilada. Solución B: pesar 5 g de I2 cristalino y disolver en 10 mL de CH3COOH. Mezclar
ambas soluciones (A+B), agitar bien y mantener en frasco ámbar).

c) Cuando el cultivo está muy concentrado (>10 6 cél/mL) se diluye la muestra con agua de
mar o destilada (según sea el caso).

d) El tubo se agita y se succiona una muestra con una pipeta Pasteur de punta corta o
mediana.

e) Se llena la cámara con el cubreobjeto ya puesto, colocando la punta de la pipeta Pasteur

al frente del cubreobjeto especial. Dejar reposar por un minuto hasta que las células tengan
una distribución adecuada (no agrupada). Para los modelos que no tienen muesca, colocar
la gota cerca del margen del cubreobjetos, procurando que no se expanda a la parte superior
del mismo.

f) Generalmente se enfoca la cámara con el objetivo 10X aunque en ocasiones cuando se

trata de células pequeñas se utiliza el de 40X. Esto facilita la identificación de las células,
discriminando los residuos y demás objetos con tamaño similar a la especie que se está
cultivando.

g) El registro se hace contando las células que quedan dentro de cada una de las cuadrículas
marcadas como A, B, C y D indicadas en la Figura 1. En el caso de las células que tocan las
líneas de demarcación entre cuadros, se cuentan solamente las que tocan dos de los cuatro
lados, seleccionados al azar.

50
h) Para tener un recuento más preciso, se usan tres o más submuestras de cada muestra y
con éstas se calcula la concentración media. Además, se recomienda contabilizar células en
ambas cámaras.

i) Para calcular la concentración celular (cél/mL) se utiliza la fórmula indicada

anteriormente.

j) Con los datos de concentración celular (cél/mL) de cada recuento en tiempos sucesivos
(generalmente a intervalos de 24 h) se obtiene la curva de crecimiento graficando en el eje
de las “Y” los valores de concentración y en el eje de las “X” el tiempo (en días). También
es importante determinar la tasa de crecimiento (μ), el tiempo de generación o de
duplicación (tg) y el número de duplicaciones (n).

Bibliografía:
Arredondo, B. y Voltolina D. 2000, Métodos y herramientas analíticas en la evaluación de
la biomasa microalgal. Capítulo 2: Concentración, recuento celular y tasa de crecimiento.

Arredondo V., Cordero, B., Herrero, C. y Abalde, J. 1997. Manual de Técnicas

Bioquímicas Aplicadas en Ficología. Manual de Prácticas del Ier. Curso Teórico Práctico:
Aplicaciones Biotecnológicas del Cultivo de Microalgas. La Paz, Baja California Sur,
México. Septiembre 1-5, 1997.40 págs.

Guillard, R. y Ryther, J. 1962. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana

Hustedt and Detonula confervacea (Cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology 8:
229-239.

Guillard, R. 1973. Division rates. En: Handbook of Phycological Methods. Stein,

J.R. (ed.). Cambridge University Press, Cambridge, 289-312 pp.

Guillard, R. y Sieracki, M. 2005. Counting cells in cultures with the light microscope. En:
Algal Culturing Techniques. Andersen, R.A. (ed.). Elsevier Academic Press, 239-252 pp.

51
 PRÁCTICA N° 5

"DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS CINÉTICOS DEL

CRECIMIENTO EN MICROORGANISMOS FOTOSINTÉTICOS.
EJERCICIOS PARA LA ELABORACIÓN DE CURVA DE
CRECIMIENTO. DETERMINACIÓN DE PESO SECO".
Introducción:

El crecimiento microbiano puede ser determinado mediante diferentes métodos de

cuantificación de su biomasa. Entre los más utilizados se encuentran los siguientes:
a. Turbidez mediante espectrofotometría a una longitud de onda indicada.
b. Peso seco.
c. Recuento celular (x106 cel/ml) o de colonias (UFCx10 6/ml) en medio sólido.
d. Clorofila a, para el caso de cianobacterias y microalgas.
e. Ficocianina o ficoeritrina, para el caso de cianobacterias.
f. Citometría de flujo.

En la presente actividad práctica se presentan diversos resultados obtenidos a partir de

cultivos de microorganismos en función de diferentes parámetros ambientales. Para lo cual
es necesario determinar la velocidad de crecimiento (µ: div-1) y el tiempo de duplicación
(minutos, horas o días).

El primer paso a seguir corresponde a la inclusión de los resultados respectivos en una hoja
de cálculo (EXCEL) y luego se procede a la elaboración de una gráfica de la curva de
crecimiento; en la cual el eje “Y” corresponde al parámetro de crecimiento seleccionado en
cada experimento; mientras que en el eje de las “X “se indica la edad del cultivo (horas,
días).

Para la determinación de µ se requiere seleccionar dos puntos de muestreo, uno de los

cuales coincide con un valor menor (X1) y el otro con un valor superior (X2 ). Mientras que,

52
t1 y t2 corresponden al tiempo indicado para X1 y X 2. Luego para determina µ se aplica la
siguiente fórmula:

µ= Ln (X2-X1)/t2-t1

Una vez obtenida µ se procede a determinar el tiempo de duplicación (td), para lo cual se
utiliza la siguiente fórmula:

td = Ln2/ µ ln2= 0.693

Objetivo:

1. Determinar parámetros cinéticos de crecimiento (µ y td) y discutir resultados en relación

a la curva de crecimiento obtenidas de diversos cultivos de microorganismos fotosintéticos.

Instrucciones:
1.-Se presentan varias tablas con datos sobre crecimiento de cianobacterias y microalgas en
función de variables independientes, a partir de las cuales debe introducir la data en el
PROGRAMA EXCEL de computación a fin de elaborar las gráficas respectivas que
describen la curva de crecimiento para cada caso.

2.-Para cada gráfica seleccionar la fase exponencial a partir de la cual se van a ubicar
valores de edad de cultivo con sus respectivos valores de crecimiento (densidad celular,
peso seco, absorbancia, clorofila). De tal manera que, uno de estos pu ntos representará el
inicio o el valor más bajo de la fase exponencial y el otro punto corresponderá al valor más
elevado o el final de esta fase de crecimiento.

3.-Aplicar la ecuación para determinar la pendiente de la recta que corresponde a “µ” a la

constante de crecimiento del microorganismo y luego, a partir de este valor estimar “Td”,
que explica el tiempo de duplicación en términos de tiempo (minutos, horas o días).

4.-Cada uno de estos parámetros cinéticos de crecimiento obtenidos para cada curva, deben
de ser comparados entre los diferentes tratamientos, a fin de discutir el que haya inducido el
mejor crecimiento, y los valores más elevados de “µ” y el menor tiempo de duplicación.

5.- Para efectos de enriquecer la información obtenida para cada curva de crecimiento, se
debe seleccionar los valores obtenidos en fase estacionaria con la finalidad de comparar el
tratamiento que produjo el mayor crecimiento. Estos valores son los tomados en cuenta

53
para los análisis estadísticos para valorar la producción de biomasa por parte de cada
microalga o cianobacteria.

6.-A continuación se registran tablas de resultados obtenidas en diferentes estudios

sobre crecimiento de microalgas y cianobacterias:

Problemas:

1. Crecimiento mediante turbidez (750nm) de la cianobacteria Anabaena en función de la

fuente de Carbono (CO2).

EC (días) Bajo CO2 Alto CO 2

2 0,839 0,943
4 1,564 1,724
6 2,454 2,517
7 2,98 2,776
8 3,16 2,964
9 3,432 3,116
10 3,68 3,5
11 3,608 3,532
12 3,464 3,484
14 3,72 3,596
15 3,484 3,712
EC: edad del cultivo

2. Data de crecimiento (x10 6 cel/ml) de la microalga Chlorella según intensidad luminosa

EC (días) I (2Klx) II (4 Klx) III (8Klx)

0 1 1 1
3 12,55 18,3 27,7
6 52,4 98 131,25
9 213,3 131,6 137,3
12 224,5 183,5 212,3
15 219,8 229,6 218,7
19 241,5 200,6 223,35
21 255,4 210,3 303,85
24 210 212,2 273,3
27 244,6 224,8 195,6
30 248,2 190,9 203,6
33 205,4 188,9 145,0
36 243,3 232,6 171,85

54
3. Crecimiento mediante turbidez (750nm) de la cianobacteria Pseudabaena en función del
medio de cultivo.

BG11c (25%) BG11o- ALGAL(6mM) ALGAL(8mM)

1 0,104 0,108 0,123 0,106
3 0,262 0,254 0,282 0,333
5 0,410 0,337 0,479 0,513
7 0,451 0,383 0,684 0,657
9 0,388 0,347 0,809 0,748
11 0,460 0,381 0,881 0,790
13 0,446 0,312 0,922 0,819
15 0,478 0,367 0,904 0,825

4. Crecimiento mediante turbidez (750nm) de la cianobacteria Synechocystis a diferentes

salinidades (%).

E. C. (días) 0% 1,5% 2,0% 3,5%

1 0,051 0,091 0,097 0,088
4 0,159 0,294 0,284 0,228
7 0,286 0,448 0,482 0,314
9 0,394 0,526 0,542 0,404
12 0,766 0,624 0,547 0,504
14 0,704 0,695 0,648 0,481
16 0,504 0,660 0,606 0,414
19 0,515 0,698 0,641 0,437
22 0,368 0,666 0,600 0,428
26 0,418 0,671 0,541 0,388
29 0,388 0,657 0,503 0,368

5. Crecimiento mediante turbidez (750nm) de la cianobacteria Synechocystis con NaHC03

(mM).

ABSORBANCIA NaHCO3
EC (días) Control 5 mM 10 mM 15 mM
0 0,080 0,080 0,080 0,080
3 0,103 0,114 0,115 0,123
6 0,106 0,120 0,140 0,180
9 0,180 0,350 0,410 0,410
12 0,364 0,626 0,685 0,667
15 0,532 0,764 0,820 0,810
18 0,810 0,900 0,940 0,915

55
 21 0,910 0,960 0,980 0,960
24 0,970 0,980 1,010 1,000
27 1,020 1,020 1,050 1,030
30 0,990 1,020 1,040 1,020
33 0,933 0,997 1,021 1,013

6.- Efecto del acetato (mM) sobre el crecimiento (Abs 750nm) de la cianobacteria
Synechocystis.

ACETATO
EC CONTROL 1mM 5mM 10mM
0 0,080 0,080 0,080 0,080
3 0,330 0,490 0,497 0,540
6 0,517 0,628 0,666 0,659
9 0,676 0,80 0,838 0,838
12 0,818 0,863 0,963 0,936
15 0,924 0,938 1,007 0,979
18 0,919 1,017 1,077 1,043
21 0,960 1,044 1,094 1,063
24 0,967 1,023 1,012 1,037
27 0,959 1,021 1,016 1,033
30 0,944 1,017 0,989 1,024

7. Influencia de la salinidad (%) sobre el crecimiento (750nm) de la cianobacteria

Synechococcus sp.

EC (días) 2,5 3,5 6,5 7,5 10

0 0,070 0,080 0,080 0,080 0,080
3 0,256 0,265 0,269 0,189 0,020
6 0,529 0,530 0,540 0,379 0,050
9 0,680 0,717 0,643 0,483 0,100
14 0,886 0,874 0,751 0,583 0,158
16 0,954 0,932 0,838 0,675 0,255
18 0,980 0,991 0,885 0,730 0,315
20 0,986 1,013 0,924 0,768 0,420
22 0,996 1,012 0,954 0,798 0,450
24 1,000 1,012 0,960 0,818 0,475
28 0,533
30 0,551
33 0,584
36 0,615
39 0,671

56
8. Crecimiento de la microalga Rhodosorus marinus (x106 cel mL-1) en función de la
concentración de NaNO3 (mM).

EC (dias) 4mM 8mM 12mM

0 1 1 1
3 2,45 1,92 2,23
6 5,68 4,99 3,46
9 12,86 11,16 9,47
12 22,46 19,37 16,71
15 34,59 20,09 18,37
18 36,06 24,34 24,15
21 30,73 24,91 33,66
24 26,72 25,16 25,32

9.- Crecimiento de la microalga Rhodosorus marinus (x106 cel mL-1) en función de la

intensidad luminosa (Klux).

EC (días) 2 Klux 4 Klux 6 Klux 8 Klux 12 Klux

0 1 1 1 1 1
3 1,02 1,19 0,95 1,34 1,05
6 2,05 3,55 2,83 4,44 2,41
9 1,21 3,15 4,25 7,50 6,88
12 4,96 10,61 11,03 12,69 10,36
15 5,45 13,40 18,82 24,64 15,05
18 9,58 21,39 29,78 31,61 21,49
21 17,40 27,48 38,34 38,60 25,18
24 24,99 39,39 40,15 36,49 38,83
27 23,45 48,00 37,59 36,99 31,89
30 33,95 47,76
33 39,85 46,11

10.- Crecimiento (x106 cel mL-1) de la microalga Rhodosorus marinus en función del
volumen de cultivo.

Control
EC (0,3 L) 1,5L 6L
0 1 1 1
3 0,80 0,95 1,44

57
 6 4,40 4,08 1,75
9 9,54 7,66 5,09
12 20,94 13,35 8,90
15 30,28 24,02 15,64
18 34,65 31,40 22,00
21 36,71 34,56 26,04
24 35,04 36,08 27,87
27 36,54 27,89

11. Crecimiento (750 nm) de la cianobacteria Nostoc LAUN 0015 en función de la

concentración de NaNO3 (mM).

DIA 0mM 2 mM 4mM 8mM 12mM

0 0,060 0,060 0,060 0,060 0,060
3 0,080 0,101 0,099 0,102 0,112
6 0,158 0,195 0,209 0,219 0,204
9 0,295 0,328 0,370 0,389 0,366
12 0,404 0,359 0,395 0,487 0,477
15 0,423 0,439 0,457 0,586 0,558
18 0,468 0,508 0,500 0,624 0,646
21 0,511 0,534 0,516 0,671 0,709
24 0,613 0,646 0,629 0,711 0,743
27 0,676 0,680 0,602 0,747 0,752
30 0,745 0,719 0,662 0,763 0,759

12. Crecimiento en peso seco (mg mL -1) de la cianobacteria Nostoc LAUN 0015 en función
de la concentración de NaNO3 (mM).

DIA 0mM 2 mM 4mM 8mM 12mM

0 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20
3 0,224 0,332 0,338 0,416 0,440
6 0,561 0,603 0,616 0,709 0,618
9 0,943 0,907 0,940 0,853 0,948
12 1,228 1,270 1,348 1,303 1,372
15 1,318 1,560 1,715 1,883 1,878
18 1,220 1,613 1,663 2,300 2,260
21 1,453 2,088 1,760 2,803 2,540
24 1,820 2,580 2,090 2,998 2,723
27 1,933 2,655 2,450 2,978 3,310
30 2,203 2,775 2,148 3,070 3,578

58
13.- Crecimiento de la microalga Phaeodactylum tricornutum (x106 cel /ml) en cultivos
semicontinuos a una tasa de renovación del 10 y 50% (v/v).

EC (días) 10% 50%

D.cel. D. Cel.
0 1.0 1.0
2 12.3 12.9
4 26.7 28.2
6 48.5 47.25
7 62.48 25.6
10 83.9 20.15
11 56.3 38.7
12 41.58 21.23
13 41.5 19.0
15 43.67 17.6
16 45.47 13.64
17 58.78 17.86
18 40.23 18.87
20 74.72 21.61
21 60.12 17.72
22 79.88 22.76
23 65.02 16.64
24 61.79 22.3
25 56.55 24.35
26 59.35 22.95
27 55.72 22.5
28 57.25 21.4
30 57.72 22.83
31 58.9 20.86
32 62.48 19.2
33 62.47 18.3
34 65.99 17.8
35 51.32 20.33
36 56.87 19.22
38 63.88 22.56
40 59.36 25.25
42 60.57 20.78

59
Recomendaciones:
Para cada tabla de resultados elaborar una discusión para proponer conclusiones en relación
al efecto de la variable independiente (s) estudiada sobre el crecimiento (densidad celular,
peso seco, clorofila, absorbancia).

METODOLOGÍA PARA CUANTIFICAR CRECIMIENTO MEDIANTE

EL MÉTODO DE PESO SECO

Esta técnica se considera para complementar las variables de crecimiento, tales como
turbidez, recuento celular o clorofila. No obstante, es muy recomendable para microalgas y
cianobacterias filamentosas, debido a que estas en muchos casos no producen cultivos
homogéneos como hacerle seguimiento por turbidez, ni tampoco son susceptibles a ser
cuantificadas por el número de células. Es por ello que esta variable dependiente es tomada
en cuenta para cuantificar la producción de biomasa como producto del crecimiento del
cultivo.

Metodologías:

I.-Peso seco mediante uso de filtros, envases, tubos de ensayo o de papel aluminio
para calcular biomasa según diferencias de peso:

a.-Se centrifuga el cultivo, luego se decanta el sobrenadante, se concentra la biomasa y se

adiciona a un envase, papel aluminio, previa determinación del material de su peso
constante en estufa entre 60-70 ºC.
b.-La muestra es colocada en la estufa a esta temperatura y hasta la obtención del peso
constante y luego por diferencia de peso entre el valor con la muestra y el del material
vacio se estima el peso de la biomasa.
c.-Se recomienda realizar esta determinación entre 3 y 5 replicas para poder establecer un
promedio más real del valor de la muestra.
d.-Este análisis puede realizarse para seguir el crecimiento de la microalga o cianobacteria
hasta fase estacionaria y permite complementar los resultados obtenidos por otros métodos
de cuantificación del crecimiento.

60
II.- Determinación de Peso Seco mediante el uso del SISTEMA DE FILTRACIÓN
(MANIFOLD):

a.- Para determinar el peso seco se extraen de 2 mL de cada réplica por triplicado de los
cultivos y se filtran al vacío en un Sampling Manifold según la metodología descrita por
Utting (1985).
b.-Cada filtro FG/2 es previamente lavada para eliminar el exceso de fribras sueltas y luego
secado hasta peso constante y colocado en un envase elaborado con papel aluminio.
c.-Se recomienda el uso de pinzas para trasladar cada filtro a su respectivo envase de
aluminio y estos se mantendrán en un desecador.
d.- En cada orificio del disco MANIFOLD se colocara el filtro respectivo para la muestra
seleccionada y por succión del sobrenadante por la bomba al vacío será deshidratada cada
muestra y luego transferidos a la estufa entre 60-70 para su secado hasta peso constante.
e.-Luego de obtenido el peso constante será determinado el valor del peso de cada muestra
por sustracción del valor del peso del filtro respectivo antes de la adición de la muestra.

A B

Figura : Sistema de filtración para peso seco (A). Filtros conteniendo los filtrados
de la biomasa microalgal (B).

f.-Para las muestras de biomasa marinas, es decir cultivadas con agua de mar o con la
adición de ClNa, se requiere la adición o lavado con formiato de amonio al 1% para
descartar el contenido de sales respectivos para cada muestra.

61
Bibliografía:

Jeffrey, S. y Humphrey, G. 1975. New spectrophotometric equations for determining

chlorophylls a, b, c1 and c2 in higher plants, algae and natural population. Biochen.
Physiol. Pflanzan. 167: 191-194.

Jonte Lorena. 2008. Producción de exopolisacáridos y pigmentos a partir de cultivos de la

cianobacteria marina Phormidium sp. Tesis de Maestría en Microbiología. Universidad del
Zulia, Venezuela.

Molina L., Jonte L., Mora R., Ortega J. y Morales E. 2007. Influencia de la salinidad sobre
el crecimiento de la microalga Rhodosorus marinus (Rhodophyta) en cultivos discontinuos.
Revista de la Facultad de Agronomía-LUZ, 24(1): 249-253

Rosales N., Loreto C., Bermúdez J. y Morales E. 2004.Intermediate renewal rates enhance
the productivity of the cyanobacterium Synechococcussp. in semicontinuous cultures.
Cryptogamie Algologie, 25(2): 207-216.

Rosales-Loaiza N., Avendaño D., Otero A. y Morales E. 2008. Crecimiento, producción de

pigmentos y proteínas de la microalga Dunaliella viridis (Chlorophyta) en cultivos
semicontinuos. Boletín del Centro de Investigaciones Biológicas, 42 (3): 323-334.

Strickland, J. y Parsons, T. 1972. A practical handbook of seawater analysis. Bull. Fish.

Res. Bd. Canada. 167: 1-310.

Utting S. 1985. Influence of nitrogen availability on the biochemical composition of three

unicellular marine algae of commercial importance. Aquacul. Engin., 4: 175-190.

62
 GUÍA PRÁCTICA N° 6

"EXTRACCCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PIGMENTOS

LIPOSOLUBLES A PARTIR DE MICROALGAS Y
CIANOBACTERIAS".

Introducción

El contenido de clorofila y de carotenoides son rutinariamente utilizados bomo

bioindicadores de crecimiento microalgal y de la presencia de fitoplancton en ecosistemas
acuaticos. Asimismo, la identificación y cuantificación de estos pigments se realiza
mediante metodologías analíticas tales como la espectrofotometría, fluorometría,
espectrofluorometría y HPLC (Jeffrey et al. 1997). No obstante, cada una de estas técnicas
presentan sus ventajas y desventajas, pero con el mismo fundamento de que cada método
requiere una solubilización de los lípidos y lipoproteinas de las membranas tilacoidales en
presencia de la mezcla o adición del solvente orgánico (Wright et al. 1997). Por lo tanto, el
grado de precisión y eficiencia en la extracción de los pigmentos liposolubles están
influenciados por la técnica y solvente utilizado.

Es de tomar en consideración que la eficiencia de extracción depende de la estructura de la

pared celular, poder de penetración del solvente y de sus propiedades de solvatación. Así
como del periodo de incubación para la extracción, y el tipo de técnica de disrupción
celular a utilizar (Wright et al. 1997). Por otra parte, cada método o combinación de estos
puede reducir la efectividad en la extracción de los pigmentos. Por ejemplo, períodos
largos de extracciones puede incrementar la formación de productos de la degradación e
isómeros de estos pigmentos. Además, de que el efecto del calor y de la sonicacion también
inducen la degradación de productos y también la estimulación de la clorofilasa (Wright et
al. 1997).

63
Figura 1: Espectro de absorción de pigmentos fotosintéticos en microalgas y
cianobacterias. Cada pigmento liposoluble presenta un máximo de absorción en el espectro de luz
visible y por lo tanto, se han seleccionado las longitudes de onda a las cuales pueden ser cuantificados.

Entre los solventes más utilizados se tiene a la acetone; sin embargo no logra extraer muy
bien a los pigmentos polares y mientras que la actividad de la clorofilasa puede incrementar
con el contenido de agua (Wright et al. 1997). En cambio, el metanol es un excelente
solvent para la extracción de los pigmentos de clorofitas, pero poco eficiente para los de
cianobacterias y diatomeas; aunque tiene tendencia a promover la alomerizacion de
producots. En cuanto a la N, N-dimethyl formamida (DMF) y al Dimetilsulfóxido (DMS)
se consideran muy eficientes para la extracción of pigmentos de microalgas, cianobacteria
y clorofitas cocoides de pared celular muy resistentes.

64
MÉTODOS DE CUANTIFICACIÓN DE PIGMENTOS LIPOSOLUBLES:

I.-Método espectrofotométrico mediante el uso de la mezcla de acetona:

metanol (2:1).

La determinación del contenido de clorofila y carotenoides se realiza en todos los casos

directamente sobre cultivos frescos y por duplicado.

Método:

1.-Se toma un 1 ml de cultivo en un tubo de reacción de 2 mL de capacidad (Eppendorf),

luego se centrifuga a 5500 r.p.m. durante 15 minutos.

2.-Se descarta el sobrenadante con una pipeta Pasteur de cuello largo. Los pigmentos se
extraen del pellet mediante la adición de 1 ml de acetona: metanol 2:1 (v/v), acetona o
metanol dependiendo el tipo de microalga. Este procedimiento se realiza con poca luz para
evitar la foto oxidación de la clorofila.

3.-Los extractos son luego clarificados mediante centrifugación y el sobrenadante es

agregado en tubos de vidrio de 2.5 ml de capacidad ajustando el volumen con una solución
del solvente utilizado. El volumen del extracto a medir debe preverse dado que el volumen
de las cubetas de cada espectrofotómetro varia.

4.-Seguidamente se mide la absorbancia (A) de las muestras a las siguientes longitudes de

onda: 470-480nm (carotenoides), 630nm (Chl c), 647-650nm (Chl b) y 663-665nm (Chl
a) en un espectrofotómetro contra un blanco de la mezcla de solventes utilizada.

Determinación de Clorofilas en microalgas:

La concentración de Clorofila a, b y c se obtiene a partir de las ecuaciones propuesta por

Jeffrey & Humphrey (1975):

Chl a (µg/mL)= [(11,93*A664)-(1,93*A647)*vol. extracto(mL)]/vol. Muestra (mL)

Chl b (µg/mL)= [(20,36*A647)-(5,50*A664)*vol. extracto(mL)]/vol. Muestra (mL)

65
 Clorofila a y c:

Chl a ( g/mL)= [(11,93*A663)–(0,64*A630)*vol. extracto(mL)]/vol. Muestra

Chl c ( g/mL)= [(27,09*A630)–(3,63*A663)*vol. extracto(mL)]/vol. Muestra

Determinación de Clorofila a en cianobacterias:

Chl a ( g/mL)= [(13,14*A665)*vol. extracto (mL)]/vol. Muestra (mL)

Determinación de carotenoides en microalgas y cianobacterias

Para la determinación del contenido celular de carotenoides se utilizó la ecuación propuesta

por Strikland y Parsons (1972):

Carotenoides ( g/mL) = [(A480 x 4) x (vol. extracto]/vol. muestra)

II.-Determinación de Clorofila a y carotenoides en cianobacterias en

presencia de metanol:
Método:

1. Extraer una muestra entre 1 o 2 mL de un cultivo de cianobacteria. En caso de que

un cultivo no tenga aun suficiente población por la baja pigmentación verde-
azulada, se tomaran entre 4-5 mL.
2. La muestra luego se transfiere a un tubo de ensayo o a un falcon cónico y se
centrifuga a temperatura ambiente a 4-5.000 rpm durante 5min.
3. Remover el 90% del sobrenadante con una pipeta Pasteur y añadir la cantidad
equivalente de metanol al 100% hasta alcanzar un concentración del solvente en un
90%.
4. Mezclar en un vortex hasta resuspender el pellet o sedimento.

66
 5. Colocar entre 5 min a media hora en el refrigerador para lograr una mejor
extracción o en su defecto por 24 horas y luego centrifugar a las mismas
condiciones.
6. En caso de que aún no ha habido una alta extracción se procede a extraer la fase
metanólica para guardarla bajo refrigeración. Después volver a resuspender el
sedimento aun pigmentado con otros volúmenes de metanol, agitar en voltex y
volver a depositar a 4 grados para acelerar la extracción.
7. Al observar el sedimento incoloro es signo de que ha ocurrido una completa
extracción y los volúmenes obtenidos se mezclan considerando el volumen total
para la cuantificación final del extracto metanólico.
8. Proceder a hacer lectura en el espectrofotómetro utilizando metanol 90% como
blanco contra las muestras con el extracto metanólico a 665 nm.

Fórmula de cuantificación:

Chla: (A665 x 12.7) vol. extracto (mL)]/vol. Muestra (mL)

9. Esta fórmula está basada en el coeficiente de extinción de 78.74 litro/gr/cm de Chl

a in metanol al 90%. Mientras que el valor de 12.7 y es producto de haber
multiplicado 1/78.74 x 10 3.
10. El volumen del extracto corresponde al extraído después de centrifugar la muestra
en presencia del solvente y el volumen de muestra es el que fue extraido del
volumen de cultivo.
11. El contenido de carotenoides es cuantificado mediante la fórmula:

Carotenoides ( g/mL) = (A480 x 4) x (vol. extracto/vol. muestra)

67
III.-Extracción de pigmentos liposolubles a partir de microalgas
charofitas y clorofitas filamentosas.
Método:

1. Se toma 1.0 gramo de muestra de biomasa de microalgas filamentosas

(Oedogonium, Spyrogyra, Zygnema, Ulothrix, Mogeoutia) y se adiciona 10 mL de
solvente orgánico (eter, metanol, acetona o mezcla de estos. Luego se macera,
homogeniza o se tritura y el extracto es centrifugado para clarificar la fracción
solubilizada con el solvente.
2. Si aún permanecen filamentos pigmentados se le adiciona otro volumen del solvente
hasta que se haya logrado una extracción completa de la muestra.
3. Una vez acumulados todos los extractos obtenidos después de adiciones sucesivas
de solventes se procede a centrifugar para separar todos los restos celulares de la
muestra y así proceder a ser analizada en el espectrofotómetro.
4. Las fórmulas para la determinación de las clorofilas y carotenoides serán aplicadas
según el solvente utilizado para la extracción.

IV.-Extracción de clorofila a partir del fitoplancton colectado en cuerpos

de aguas.
Esta técnica permite estimar la biomasa colectada en una muestra de agua de acuerdo a la
concentración de clorofila a (Nusch y Palme, 1975).
Método:
1. Se procede a filtrar 1-10L de muestra dependiendo de la población del fitoplancton
y mediante el uso del sistema de filtración con una bomba de vacío.
2. El filtro de papel whatman o de fibra de vidrio se introduce en un tubo de ensayo
con tapa de rosca y se le adiciona el volumen adecuado de etanol.
3. A fin de mejorar la extracción de los pigmentos liposolubles se mantienen en
refrigeración durante 24 horas.
4. Al asegurarse de una completa extracción se procede a centrifugar el extracto a
5000rpm durante 10 minutos para luego proceder a su lectura a 665 y 750 nm en
un espectrofotómetro.
5. Dichas lecturas se realizan antes y después de acidificar con HCl 0,4 M hasta
obtener un pH de 2,6-2,8.

68
 6. La concentración de clorofila-a en mg m-3 se estima empleando la siguiente
fórmula:

Clorofila-a (mg m -3)= 29,6(Ab–Aª)v

Vxl

Donde:

Ab = absorbancia del extracto original medido a 665 nm, menos la absorbancia a 750 nm.

Aª = absorbancia a 665 nm después de la acidificación menos la absorbancia a 750 nm

después de la acidificación.

V = es el volumen de agua filtrada (en litros).

v = es el volumen de etanol utilizado para la extracción (en ml).

l = es la longitud del paso de luz en la cubeta del espectrofotómetro (1cm).

V.-Cálculo de la biomasa algal:

Para ello analizaremos el contenido en pigmentos existentes. En nuestro caso,
procederemos a la determinación de la clorofila a para lo cual realizaremos una extracción
selectiva, con acetona al 90%, y posteriormente se cuantificara por técnicas de
espectrofotometría utilizando un espectrofotómetro de red de diodos MultiSpec-1501 de
Shimadzu.

El proceso de extracción de clorofilas (ya sea de core o de filtro), se realiza añadiendo 5 ml

de acetona al 90% que rompe las membranas. Posteriormente se guardan éstas en oscuridad
y en frío (4ºC) durante 24 horas. Una vez pasado el tiempo, se centrifugan las muestras
(10.000r.p.m, 10 minutos), luego se recoge el sobrenadante, y se realiza un espectro de los
pigmentos desde 350 a 750 nm.

Se procede a repetir el proceso hasta 3 veces para asegurar la total extracción. Finalmente,
se anotan los valores de absorbancia (ABS) a 665 nm (pico de absorción de clorofila a) y
750 nm (medida de la turbidez de la muestra). Una vez medidas las muestras, se procede a
la acidificación del extracto (añadiendo 100 μl de HCL 1N) para eliminar las feofitinas
presentes y se procede a repetir las medidas del espectro.

69
La determinación cuantitativa de la concentración de la clorofila se realiza a partir de
la ecuación:

[Clorofila a(mg/l)]= [(D.O.665 mn – D.O.750 mn) – (D.O.665 ma – D.O.750 ma)]* 26.7.

Donde: D.O: densidad óptica; mn: muestra normal sin añadir HCL ; ma: muestra acidificada
después de añadir 100 μl de HCL.

Finalmente se realiza el sumatorio de todas las extracciones para obtener un valor de

clorofila a total.

Tabla 1.- Fórmulas para cuantificación de clorofila a, b y carotenoides

(Lichtentaler, 1987) según el solvente utilizado.
Solvente Fórmula
Dietileter Ca = 10.05x A662 - 0.766 xA644
Cb=16.37 xA644 - 3.140 xA662
Cx+c = 1000x A470-1.280x Ca - 56.7 Cb/230
Metanol Ca=15.65x A666 - 7.340x A653
Cb=27.05 xA653 - 11.21x A666
Cx+c = 1000x A470 - 2.860 xCa - 129.2
Cb/245
Acetona Ca = 11.75x A662 - 2.350x A645
Cb = 18.61x A645 - 3.960 xA662
Cx+c = 1000 xA470 - 2.270 xCa - 81.4 Cb/227
Ca = Clorofila a, Cb = Clorofila b, Cx+c = carotenoides

II.-Método Fluorométrico:
Este método se utiliza para muestras in vivo, como por ejemplo en extractos de epiliton; ya
que es necesario que los pigmentos estén activos para ser detectados mediante un
fluorómetro( BBE MOLDAENKE-KIEL, Alemania). Este utiliza diodos emisores de luz
(LED’s) para la excitación de los pigmentos fotosintéticos, cada uno de los cuales emite a
longitudes de onda diferentes (Rodríguez, 2004).

Los distintos grupos algales presentan un comportamiento diferente frente a la emisión de

luz de cada LED, de tal forma que se puede obtener un espectro de excitación característico
de cada uno. Cada espectro es comparado con los patrones almacenados en el fluorómetro,
siendo así posible la diferenciación.

70
 Las longitudes de onda emitidas por cada LED son:
a.- 450 nm, correspondiente al máximo de excitación de las clorofilas a y b, siendo los
pigmentos mayoritarios de las algas verdes (Chlorophyceae).

b.- 525 nm, correspondiente al máximo de excitación del pigmento xantofila fucoxantina,
característico de las diatomeas (Bacillariophyceae), y del pigmento xantofila peridina,
propio de los dinoflagelados (Dinophyceae).

c.- 570 nm, correspondiente al máximo de excitación del pigmento ficoeritrina,

característico de las algas criptofitas (Cryptophyceae) y de algunas cianobacterias.

d.-590 nm y 610 nn, correspondiente al máximo de excitación del pigmento ficocianina,

característico de las cianobacterias (Cyanophyceae).

Para el caso de grupos de microorganismos fotosintéticos la lectura final del fluorómetro

corresponde a la concentración total de clorofila a aportada por cada grupo algal,
obteniéndose así los siguientes valores:

a.- μg (Chl-a total)·l-1

b.-μg (Chl-a de algas verdes)·l -1

c.- μg (Chl-a de cianobacterias)·l -1

d.- μg (Chl-a de diatomeas y dinoflagelados)·l-1

e.- μg (Chl-a de criptofitas y cianobacterias con ficoeritrina)·l-1.

Método:

Se prepara una dilución del extracto de epiliton de cada piedra tomando 0,5 ml del mismo y
añadiendo 25 ml de medio BG110 (dilución 1:51). Los resultados obtenidos con las
medidas del fluorómetro se transformaron posteriormente para expresarlos en μg Chl a de
cada grupo·(cm de piedra) -2.

III.-Método mediante HPLC:

En cromatografía de líquidos pueden distinguirse 5 formas de separación de acuerdo

al tipo de fase estacionaria (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH, 1999):
Fase inversa (Fase reversa). La fase estacionaria es de naturaleza no polar
(hidrofóbica), mientras que la fase móvil es un líquido polar, como son mezclas de agua y

71
metanol o acetonitrilo. Aquí los componentes no polares se retendrán por más tiempo en la
columna.
Par iónico. La fase estacionaria es la misma que en fase inversa, la diferencia es que se
agregan reactivos de par iónico a la fase móvil para modificar la polaridad de los
componentes de la muestra.
Fase normal. La fase estacionaria es de naturaleza altamente polar, y la fase móvil es no
polar (hexano, tetrahidrofurano, otros).

A.-PROCEDIMIENTO DE EXTRACCIÓN Y ANÁLISIS PARA MUESTRAS

MARINAS

a.-Toma de muestra y almacenamiento

1.-El volumen de muestra a filtrar depende de la concentración de fitoplancton esperada en

la muestra. En lagunas costeras, de 0.5 a 1.5 L son generalmente suficientes; mientras que
en aguas oceánicas se usan en general entre 3 y 5 L.

2.- Se recomienda utilizar filtros de fibra de vidrio Whatman GF/F, con capacidad de
retención de partículas de 0.7 μm, ya que la fibra ayuda a romper las células durante la
trituración y no se disuelve en el solvente.

3.-Para prevenir la acidificación de la muestra, se agregan de tres a cinco gotas de una

suspensión saturada de MgCO3 .

4.- Durante la filtración se debe eliminar la mayor cantidad de agua posible y, una vez
terminado, el filtro se remueve del soporte, se dobla y se envuelve en papel aluminio o se
coloca en tubos criogénicos para su almacenamiento a –20 °C.

5.-Si la muestra procede de un cultivo de microalgas, se sugiere centrifugar de 10 a 20 mL

de cultivo a 4000 rpm por10 min a 15 ºC y eliminar el sobrenadante.

b.-Extracción de la muestra

a) Para muestras concentradas en filtros, se macera con una varilla de vidrio

utilizando un baño con hielo para reducir el calentamiento de la muestra.
b) (Para muestras de cultivo puros es necesario sonicar en un baño con hielo
durante 30 a 45 seg, para favorecer la extracción de los pigmentos.
c) Agregar de 3 a 4 mL de acetona grado HPLC, dejar reposar a -20 ºC durante
24 h para favorecer la total extracción de los pigmentos.

72
 d) El tubo debe estar protegido de la luz para evitar que la muestra se degrade.
Se recomienda utilizar papel aluminio.
e) Después de las 24 h, las muestras se transfieren a una temperatura de 10 ºC y
se dejan reposar hasta alcanzar esta temperatura y posteriormente se
centrifugan a 4000 rpm durante 20 min a 10 ºC.
f) Con una pipeta Pasteur de vidrio limpia (de preferencia nueva y enjuagada
previamente con acetona) se recupera el extracto de pigmentos y se coloca
en un vial o tubo eppendorf de 2 mL para su análisis por HPLC.
c.- Identificación
Los pigmentos presentes en las muestras de microalgas se identifican bajo dos criterios:
comparando los tiempos de retención y los espectros de absorción.

d.- Cuantificación de pigmentos

La concentración de los pigmentos presentes en las muestras se calcula integrando el área
bajo la curva, la cual es directamente proporcional a la concentración de los estándares.
Para calcularla concentración de pigmentos se utilizan las siguientes ecuaciones
(dependiendo si se parte de una muestra liofilizada o de un volumen demuestra filtrada):

Pigmento = (Am .FR) .(VE/VI)/ P

Pigmento = (Am .FR ). (VE/VI)/ V

Pigmento = ng/g

Pigmento = ng/mL

En donde:

Pigmento = clorofilas y/o carotenos

Am = Área del pico de la muestra (mAU.s)

Astd= Área del pico del estándar (mAU.s)

FR = Factor de respuesta

FR = concentración del estándar (ng) / área del estándar (mAU.s)

VE = Volumen de acetona utilizado para la extracción (μL)

VI = Volumen de muestra inyectado (μL)

73
P = Peso de la muestra en (g)

V = Volumen de muestra filtrada (mL)

e.-A manera de ejemplificar los cálculos para la cuantificación de pigmentos,

presentamos datos de un cultivo discontinuo de Tetraselmis suecica en medio f/2
(Guillard y Ryther, 1962), cosechado a los 7 días. Datos importantes para la
cuantificación de la clorofila a:

a) Volumen de cultivo filtrado (Vf) = 10 mL

b) Volumen de extracción (acetona) (VE) = 3 mL (3000 μL)

c) Volumen de inyección (Vi) = 13.33 μL

d) Concentración del estándar = 80.375 ng

e) Area del estándar de chla (Astd) = 293.81781 mAU.s

f) Area de pico de chla de la muestra (Am) = 796.18726 mAU.s

De acuerdo a la ecuación definida en el apartado anterior:

Clorofila a = (A . FR) . (VE/VI)/ Vf

FR= Factor de respuesta: concentración del estándar (ng) / área del estándar (mAU . s)

FR = 80.375 ng / 293.81781 mAU .s

FR = 0.2722775 ng

Sustituyendo en la ecuación de Clorofila a tenemos:

Clorofila a = (Am . FR) . (VE/VI)/ Vf

Clorofilaa = [(796.18726 mAU . s) . (0.2722775 ng)] .(3000 μL/ 13.33 μL) / 10 mL

Clorofila a = 4878.856 ng/mL

74
IV.-MÉTODO PARA LA EXTRACCIÓN DE PIGMENTOS
LIPOSOLUBLES A PARTIR DE LA MICROALGAS Chroomonas.
1.-Para la extracción de clorofila, caroteno y aloxantina se utiliza acetona y metanol (2:1)
grado HPLC, con la misma metodología indicada para análisis de estos pigmentos mediante
espectrofotometría.

2.-Los extractos resultantes deben ser posteriormente clarificados mediante centrifugación a

14000 r.p.m. y el sobrenadante colectado purificado en filtros de 0,25 de diámetro de
poro.

3.-El filtrado obtenido es almacenado en una vial con tapa y protegido de la luz hasta su
inyección en el cromatógrafo.

4.-El HPLC utilizado fue un Hewlett Packard serie 1100, con un detector de Onda Variable

Figura 2: Equipo de HPLC utilizado para la identificación y cuantificación de

pigmentos.

e inyector manual con un loop de 20 l.

5.- Para la separación de los pigmentos se utiliza una columna de Fase Reversa Agilent
Hypersil MOS C8 46 x 100 mm y 5 m de diámetro interno. La fase móvil está compuesta
por los siguientes solventes: solvente A, con metanol y acetato de amonio 1,0 M (70:30 v/v);
solvente B, metanol. El flujo fue de 1 ml min-1 , un stop time de 20 min. y una longitud de
honda de 440 nm (Vidussi et al., 1996).

75
6.-Los pigmentos se identificaron por comparación de su tiempo de retención frente a
patrones comerciales.

TABLA 2

Gradientes de solventes para la determinación y

cuantificación de pigmentos por HPLC.

% Solventes Flujo
Tiempo (min)
A B (ml min-1)

0 50 50 1

15 0 100 1

19 75 25 1

A:metanol:acetato de amonio 1 M; 70:30 B: metanol

(ºHPLC).

7.-Se presentan dos cromatogramas HPLC sobre la detección de aloxantina, clorofila a y α

caroteno según el tiempo de retención en la columna de cada uno de estos pigmentos
(Figuras 3 y 4).

76
 Clorofila a
Mili unidades de absorbancia
70

60
Aloxantina
50

40

30

20
-Caroteno
(mUA)

10

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Tiempo de retención
(min)
Figura 3: Trazas de pigmentos determinados mediante HPLC en
los cultivos de la microalga Chroomonas sp. bajo el efecto de
diferentes concentración de nitrato.

Longitud de honda = 440 nm Aloxantina

70
Mili unidades de absorbancia

60
50
40
30 Clorofila a
20 -caroteno
10
0
(mAU)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Tiempo de retención (min)

Figura 4: Trazas de pigmentos determinados mediante

HPLC en los cultivos de la microalga Chroomonas sp. bajo el
efecto de irradiancia unilateral y bilateral.

77
V.-MÉTODO DE EXTRACCIÓN DE CAROTENOIDES MEDIANTE
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

Fundamento teórico:
La cromatografía en capa fina es una técnica de separación. En este caso la separación se
produce debido a la diferente afinidad que presentan los compuestos de la muestra por la
fase estacionaria (polar) y la fase móvil (no polar). Por tanto, los compuestos que presenten
menor polaridad recorrerán mayor distancia que los polares.

Material y reactivos:
Extractos secos de muestras como fuente de carotenoides
Placas cromatográficas Silicagel 60 F254, Merk.
Cubetas para TLC analítica
Fase móvil: éter de petróleo:acetona (75:25)

METODOLOGÍA:
1. Tomar una placa de TLC de 6 x7.5 cm
2. Añadir aproximadamente 1 cm de fase móvil a la cubeta cromatográfica
3. En cada placa de TLC se colocarán con el tubo capilar 4 muestras (los extractos de alga
obtenidos en el apartado anterior con una técnica de extracción y con los 4 disolventes)
junto con un patrón marcador de Rf conocido (β-caroteno). Las muestras deben estar por
encima de la línea de la fase móvil. Dejar secar el disolvente unos segundos.
4. Dejar eluir la fase móvil hasta que el frente de disolvente llegue a ~1 cm del borde de la
placa. Cuidado de que el frente de fase móvil no “salga” de la placa.
5.- Dibujar líneas indicando frente del solvente y las bandas coloreadas.

6. Determinar los valores de Rf (distancia recorrida) para todos los pigmentos que se
observan en las placas.
Rf : se define como la relación entre la distancia de banda respecto a la distancia recorrida
por el disolvente

78
 distancia recorrida soluto (pigmento)
Rf
distancia recorrida frente de disolvente

Frente de
disolvente

ß-Caroteno

clorofila a
Figura 5: perfil de separación de caroteno a partir
clorofila b de una muestra de microalga.

7.-Para los cálculos, marcar el centro del punto donde se ha depositado la muestra (punto
inicio para las medidas siguientes). Marcar el punto medio de cada banda de pigmentos y el
frente del disolvente.
8.-Discutir los resultados
zeaxantina

Luteína
Bibliografía
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79
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Vidussi, F., Claustre, H., Bustillos, J., Cailliau, C. & Marty, J. 1996. Determination of
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planktonic blue green algae (Cyanobacteria). I. Influence of light quantity. Proceedings of
the Royal Society of London, 227: 367-380.

80
 GUÍA PRÁCTICA N° 7

"EXTRACCIÓN DE PIGMENTOS HIDROSOLUBLES A PARTIR DE

CIANOBACTERIAS Y MICROALGAS RODOFITAS".

Introducción:

Este método consiste en la extracción por el proceso de congelación-descongelación de la

biomasa de microalga o de cianobacteria y mediante el efecto osmótico con glicerol. El
efecto induce la ruptura celular para la liberación de los pigmentos hidrosolubles de
naturaleza proteica, tanto de las ficoeritrinas como de las ficocianinas.

Metodología:

1. Centrifugar de entre 5 y 15 mL de cultivo (dependiendo de la edad de cultivo y de la

cantidad de biomasa) a 4000 rpm por 10 minutos.
2. Descartar el sobrenadante y añadir unas 2 o 4 gotas de glicerol.
3. Mezclar con una pipeta Pasteur o varilla fina de vidrio para homogenizar y permitir
que el glicerol se adhiera más a la biomasa.
4. Colocar la muestra bajo congelación por lo menos unos 30 minutos. El tiempo
dependerá de la facilidad en la cual se extraigan las ficobiliproteínas.
5. Añadir entre 2 y 4mL de agua destilada después de retirar la muestra del
congelador. Agitar vigorosamente para mezclar bien o en un vortex.
6. Someter a las muestras en los tubos de ensayo, a un proceso de congelación-
descongelación al menos tres veces. Para aquellas cianobacterias o microalgas
rodofitas con pared celular gruesa y/o que sean dificultosas para la extracción de
estos pigmentos, se les prolongará esta fase hasta observar una extracción completa.
7. Centrifugar a 4000 rpm por 10 minutos.
8. Colectar el sobrenadante y medir en espectrofotómetro a 562, 615 y 652 nm.

81
Fórmula de cuantificación de ficobiliproteínas:

Ficocianina (mg mL-1 )= [(DO615 – (DO652 x 0,474)] / 5,34) x VE / VM

Aloficocianina (mg mL-1)= [(DO652 – (DO615 x 0,208)] / 5,09)x VE / VM

Ficoeritrina (mg mL -1)= [(DO562 – (FCx 2,41) – (AFC x 0,849)] / 5,34) x VE / VM

Nota: Todos los resultados en mg mL -1

Figura 1: extracto metanólico de clorofila a y carotenoides (izquierda) y extracto acuoso

de mezcla de ficoeritrina y ficocinina (derecha) de la cionabacteria Nostoc.

Bibliografía:
Betancourt, Liliana. 1997. Producción, purificación y caracterización de ficocianina de
Synechococcus sp. I09201 aislada en aguas de Cuba. Tesis Doctoral. UNIVERSIDADE DA
CORUNA, Facultade de Ciencias, Departamento de Bioloxía Celular e Molecular. Área de
Microbioloxía.

Loreto C., Rosales N., Bermúdez J. y Morales. 2003. Producción de pigmentos y proteínas
de la cianobacteria Anabaena PCC 7120 en relación a la concentración de nitrógeno e
irradiancia. Gayana Botánica, 60(2): 83-90.

Rodríguez H., Rivas J., Guerrero M. y Losada M. 1989. Nitrogen-fixing cyanobacterium

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Rosales, N. 2007. Evaluación de la actividad biológica de extractos de la cianobacteria

Nostoc LAUN 0015, en condiciones de laboratorio. Tesis de Maestría en Microbiología-
Universidad del Zulia. Venezuela.

82
 PRÁCTICA N° 8

"SISTEMAS DE CULTIVOS DISCONTINUOS, DISCONTINUOS ALIMENTADOS

Y SEMICONTINUOS".

Introducción:
En biotecnología de cultivos se amerita seleccionar el sistema de cultivo mas adecuado para
estudios sobre variables ambientales independientes bien sea a través de un diseño
experimental simple o factorial, para la inducción de algún pigmento, proteínas, lípidos
hasta alcanzar fase estacionaria o para la producción diaria de biomasa microalgal. De tal
manera estos tres lineamientos deducirán si hay que aplicar un sistema de cultivo especial
para el logro de los resultados estimados.

En este sentido hay que tener presente el modo de operación de un sistema de cultivo el
cual es dependiente del diseño propio del reactor o unidad de cultivo; del modelo cinético
de crecimiento del cultivo y del proceso de producción.

Es por ello que se incluyen tres modalidades de cultivos los cuales corresponden al cultivo:

1.- Discontinuo o Batch.

2.- Discontinuo alimentado.

3.-Semicontinuo
En el sistema de cultivo Discontinuo se trata de cargar el medio de cultivo con inóculo o lo
que corresponde a una tanda o lote, hasta que se ejecute el proceso productivo o
crecimiento del microorganismo hasta que este alcance la fase estacionaria sin haber
incluido mas inóculo o mas medio nutritivo.

En relación al discontinuo alimentado en este se selecciona según el diseño experimental

acordado, el compuesto, mezcla de nutrientes o una alícuota del medio de cultivo fresco a
intervalos de tiempo. Este sistema cobra interés cuando el nutriente con el cual se alimenta
es el limitante del crecimiento; lo cual permitirá controlar la velocidad de crecimiento ( )

83
del microorganismo. Es decir, esta técnica corresponde a un bioproceso en los que el
crecimiento celular y/o la formación de producto son sensibles a la concentración del
sustrato limitante; con lo cual se trata de evitar efectos de inhibición por sustrato y cuando
se requiere alcanzar una alta concentración de biomasa.

En cambio, para los casos en los que se requiera evaluar la variabilidad bioquímica de la
biomasa de microalgas o cianobacterias se selecciona el sistema de cultivos semicontinuo
en el cual se fija una tasa de renovación diaria del volumen del cultivo y en el cual se
realizará una cosecha o toma del cultivo cada 24 horas de tal manera que se inducirá una
sincronización de la densidad celular y por lo tanto se alcanzará luego una densidad
celular de estabilización conforme se va extrayendo un volumen determinado en función
del tiempo del bioproceso. En esta operación técnica se logrará una productividad diaria
de células o filamentos, de pigmentos, ácidos grasos, proteínas o como alimento vivo para
acuicultura diariamente.

Para este sistema de cultivo es necesario que la microalga o cianobacteria sea capaz de
duplicarse diariamente en función de la concentración de nutrientes y de la tasa de
renovación aplicada, para luego producir una biomasa enriquecida con los compuestos de
interés del biotecnólogo.

Objetivo:

Establecer un estudio comparativo entre los sistemas de cultivo discontinuos, discontinuos

alimentados y semicontinuos con alguna microalga o cianobacteria previamente evaluada
según su velocidad de crecimiento.

Materiales:

 Frascos de gatorade de 350 mL.

 Manguera para acuarios.
 Bomba de aire de dos salidas para acuarios.
 Tapones
 Lámparas fluorescentes de tubos de 40 W.
 Luxímetro
 Contador de células
 Tubos de ensayo
 Cilindros graduados de 100, 250 y 500 ml.

Metodología:
1. Medio de cultivo
Como fuente de nutrientes para el crecimiento de una microalga se utilizará Nitrofoska
Foliar a una concentración de 3 mL/L de cultivo en agua dulce esteril. Para el caso de una

84
cianobacteria puede utilizarse el medio BG11 completo o el JORDAN para Arthrospira o
Spirulina.

2. Condiciones de Cultivo
 Se realizarán cultivos discontinuos, discontinuos alimentados y semicontinuos de la
microalga en frascos de 350 ml de capacidad utilizando un volumen de trabajo de
200 ml.
 Los cultivos se iniciarán con una densidad celular de 1x106 cel/mL
 Se utilizarán3 réplicas por cada sistema de cultivo.
 Serán iluminados lateralmente con lámparas fluorescentes con tubos de 40 W.
 Los cultivos se mantendrán con un fotoperiodo de 12 horas de luz, 12 horas de
oscuridad.
 La intensidad luminosa será de 110 µmol quanta m -2 s-1 (8 Kl)

3. Sistemas de Cultivo:

 Todos los frascos serán inoculados con 1x10 6 cel/mL, si se trata de alguna
microalga clorofita. Si corresponde a una cianobacteria se estima considerar
un crecimiento determinado por turbidez (750nm) de una Absorbancia de
0.8.
 Los cultivos discontinuos no serán enriquecidos con nutrientes y se dejaran
que se desarrollen hasta que alcancen fase estacionaria.
 Los cultivos discontinuos alimentados serán inoculados cada 3 días con 3
ml de Nitrato de sodio 4mM hasta completar 15 dias del cultivo. En este
caso puede seleccionar algún compuesto específico, como acetato, por
ejemplo.
 Los cultivos semicontinuos se iniciaran al igual que los discontinuos
convencionales y los alimentados, sólo que a los 7 días, a estos cultivos se
les aplicara la tasa de renovación diaria del 10 y 40% (v/v) durante 15 días.

85
 Figura 1: sistema de cultivo para evaluación de cultivos discontinuos,
alimentados y semicontinuos.

4. Determinaciones de parámetros de crecimiento:

a.-Densidad celular

1. La densidad celular de la microalga en los cultivos discontinuos y discontinuos

alimentados será calculada cada tres días, mientras que en los cultivos
semicontinuos el recuento celular será realizado cada tres días hasta el comienzo del
régimen semicontinuo desde el cual se realiza el recuento diariamente hasta
finalizado el ensayo.
b.-Pigmentos

La determinación del contenido de clorofila y carotenoide se realizará por duplicado,

con el siguiente procedimiento:

1. Tomar un 1 ml de cultivo en un tubo de reacción de 2 ml de capacidad.

2. Centrifugar 5500 r.p.m. durante 15 minutos.
3. Descartar el sobrenadante.
4. Agregar 1 ml de DMSO (v/v). Para el caso de microalgas difíciles de extraérseles los
pigmentos liposolubles con la mezcla acetona: metanol.
5. Clarificar mediante centrifugación.
6. Medir la absorbancia (A) de las muestras a las siguientes longitudes de onda: 480, 664
y 647 nm en un espectrofotómetro. Y calcular los valores según las ecuaciones
propuesta por Jeffrey & Humphrey (1975).
7. Para la determinación del contenido celular de carotenoides se utilizó la ecuación
propuesta por Strikland y Parsons (1972).

86
Presentación de Resultados:

Análisis comparativo del crecimiento, contenido de clorofila y de carotenoides entre los

diferentes sistemas de cultivo:
a.-Elaboración de la curva de crecimiento para cada sistema de cultivo.

b.-Presentación de una Tabla de valores del contenido de clorofila y carotenoides según

sistema de cultivo.
c.-Selección del sistema de cultivo que produzca mejor crecimiento y contenido de
pigmentos.

87
d.- Elaboración de conclusiones.
Se incluye una curva de crecimiento de la microalga marina Dunaliella viridis obtenida
mediante el sistema de cultivo semicontinuo y a las tasas de renovación del 5, 10 y 30%
(v/v) y en comparación a un cultivo control desarrollado bajo el sistema discontinuo; como
referencia para orientación de la actividad práctica.

Bibliografía:

Arredondo V., B. O.; Cordero E., B.; Herrero, C. y Abalde, J. 1997. Manual de técnicas
Bioquímicas aplicadas a Ficología. La Paz, Baja California Sur.

Bermúdez J., Rosales N., Loreto C., Briceño B. y Morales E. 2004. Exopolysaccharide,
pigment and protein production by the marine microalga Chroomonas sp. in
semicontinuous culture. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 20(2): 179-183.

Fuenmayor G., Jonte L., Rosales-Loaiza N. y Morales E. 2009. Efecto de la salinidad y

concentración de nutrientes sobre el crecimiento y composición bioquímica de la
cianobacteria autóctona Oscillatoria sp. CIENCIA. 17(1): 50-57.

Lorena Jonte, Néstor Rosales-Loaiza, José Bermúdez-González y Ever Morales. 2012.

cultivos discontinuos alimentados de la cianobacteria Phormidiumsp. en función de la
salinidad y edad del cultivo.Revista Colombiana de Biotecnología.

Rosales-Loaiza N., Avendaño D., Otero A. y Morales E. 2008. Crecimiento, producción de

pigmentos y proteínas de la microalga Dunaliella viridis (Chlorophyta) en cultivos
semicontinuos. Boletín del Centro de Investigaciones Biológicas, 42 (3): 323-334.

88
 GUÍA PRÁCTICA N° 9
"ANÁLISIS DE PROTEÍNAS. METODO
ESPECTROFOTOMÉTRICO".

Introducción:
El componente cuantitativamente más importante de la biomasa orgánica de la mayoría
de las microalgas son las proteínas, las cuales pueden representar hasta más del 50 % del
peso seco total y que, sumadas a los lípidos y a los carbohidratos constituyen hasta el 90 %
del peso seco total, mientras que los minerales, los ácidos nucleicos, los pigmentos y los
demás componentes menores suman el restante 10 %.

El principal método utilizado para la cuantificación de proteínas se basa en la

determinación espectrofotométrica de la intensidad de color obtenido con el reactivo de
Folin-Ciocalteu (ácido fosfomolíbdico-tungstico: FMT), después de un tratamiento con
solución alcalina de cobre. El FMT oxida los aminoácidos aromáticos como tirosina y
triptofano presentes en la mayoría de las proteínas, reduciéndose a heteropolimolibdeno
azul. Esta reacción es catalizada por el cobre y da como resultado un color azul, cuya
intensidad depende del contenido de tirosina y/o triptofano en la muestra. El fundamento de
esta técnica corresponde al método de Lowry.

Otro método para proteínas es el de Bradford y consiste en la tinción de las proteínas con
el colorante Azul Brillante de Coomassie (Coomassie Brilliant Blue) y su cuantificación se
basa en el cambio del pico de máxima absorción del colorante, que vira progresivamente
entre 465 y 595 nm, en paralelo con la combinación del colorante con los grupos amínicos
de las proteínas.

Para ambos métodos la curva de calibración se realiza con sero albúmina de bovino (BSA),
que es el estándar más utilizado para todo tipo de proteína, tanto de origen vegetal como
animal. No obstante, ambos métodos tienen ventajas y desventajas: el método de Bradford
es rápido y sencillo, debido a que se utiliza un solo reactivo y es además aproximadamente
4 veces más sensible que el de Lowry, pero tiene algunas limitaciones importantes:
a.- la curva de calibración no es lineal para todas las proteínas, en especial si su
contenido en la muestra es superior a 60 μg/mL. Esto se debe a la sobreposición de los

89
espectros de las dos especies (forma libre y combinada) de lreactivo, ya que el valor de
referencia disminuye a medida que el colorante se une a la proteína.
b.-El valor de absorbancia varía con la edad del colorante
d.-La lectura de absorbancia se debe realizar entre 5 y 20 minutos después de
agregar el reactivo, para evitar subestimar el contenido de proteínas de las muestras a causa
de la pérdida gradual de color (Kochert, 1978).

Por otra parte, el método de Lowry da una curva de calibración casi lineal hasta 150 μg/mL
de proteínas, la absorbancia se lee a 750 nm, a la cual se minimiza la interferencia de las
clorofilas, aunque otras sustancias como detergentes, carbohidratos, glicerina, EDTA,
compuestos de potasio, magnesio y calcio son posibles fuentes de interferencias. Este
método es sensitivo a concentraciones de hasta 10 μg/ mLde proteína.

Considerando las ventajas y las desventajas de los dos métodos mencionados, Arredondo,
et.al, (1998) recomiendan que para cuantificar las proteínas en muestras de microalgas, el
más apropiado es el método de Lowry.

Protocolo para la extracción y cuantificación de proteínas por el

método de Lowry et al., (1951)

a.- REACTIVOS
1. Na2CO3 al 5% (si es Na2CO3 . 1H2O sería al 13,4%) Debe prepararse con agua destilada
previamente hervida y se puede almacenar a temperatura ambiente.
2. Tartrato de sodio-potasio al 1% en CuSO4 . 5H2O al 0,5%. Esta dilución precipita en
pocas horas, así que se debe centrifugar y usar el sobrenadante limpio y claro. Se puede
almacenar a temperatura ambiente.
3. Mezcla de 50 mL del reactivo 1 con 2 mL del reactivo 2. Se debe preparar antes del
análisis. No almacenar.
4. Dilución del reactivo Folin-Ciocalteau con agua destilada en una proporción 1:1.
Preparar antes del análisis. No almacenar.
5. Solución de BSA a un 1 mg mL-1 en NaOH 1M
6. NaOH 1M

Elaboración de la curva de calibración:

La curva de calibración se prepara con una solución concentrada de 300 μg/mL de suero
albúmina de bovino (BSA), a partir de la cual se hace un gradiente de concentración desde
0 a 100 μg/mL (Tabla 1). Todas las diluciones se realizan por triplicado y, una vez que se
tienen las diferentes concentraciones de BSA, se continúa la curva con los reactivos que se
describen a continuación.

90
Tabla 1: curva patrón
Blanco
µL BSA 0 25 50 75 100
µL NaOH 600 575 550 525 500
µL H2O 400 400 400 400 400

PROTOCOLO

1. Agregar 2 mL de NaOH 1M a 2 mL de biomasa [fresca o congelada o de 5 mg de

muestra liofilizada y pulverizada, o tomar directamente la muestra del cultivo (el volumen
seleccionado dependerá de la densidad de población de la microalga o cianobacteria)].
2. Poner las muestras en baño de maría 95-100 ºC por 1 hora.
3. Dejar enfriar a temperatura ambiente.
4. Centrifugar 10 minutos a 4000 rpm
5. Transferir 100 µL del sobrenadante a un tubo de ensayo (por triplicado) (Este valor
puede aumentar o disminuir dependiendo de la cantidad de proteína presente en la muestra,
de manera que el valor de absorbancia que se obtenga entre en la curva patrón.
6. Añadir 400 µL de agua destilada, 500 µL de NaOH 1M y agitar en el vortex (la cantidad
de agua destilada podrá variar, dependiendo del volumen de sobrenadante que se haya
utilizado en el paso anterior)
7. Añadir 2 mL del reactivo 3, tanto a las muestras a analizar como a la curva patrón y al
blanco, agitar para homogenizar.
8. Después de 10 minutos, añadir 400 µL del reactivo 4 y agitar inmediatamente.
9. Dejar en reposo 30 minutos a temperatura ambiente y leer a 750 nm.
10. La curva debe ser ajustada a la ecuación de una curva de primer grado. Sin embargo,
puede ajustarse por mínimos cuadrados a una ecuación de segundo grado, obteniendo la
“R2”, el valor de la pendiente (m), utilizando el intercepto (b) igual a cero. El valor de R2
deberá ser superior a 0.98. Si se obtiene un valor inferior, se repite la calibración con una
nueva serie de diluciones y, si el resultado es similar, entonces se recomienda preparar
soluciones nuevas.

91
11. Recuerde tomar en cuenta cualquier dilución realizada para el cálculo de la
concentración de proteínas de la muestra final.

Bibliografía:
Arredondo, B., Cordero, B. y Voltolina, D. 1998. DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS
POR MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS. Capítulo 4. Métodos y herramientas
analíticas en la evaluación de la biomasa microalgal. CIBNOR-MEXICO.

Bermúdez J., Rosales N., Loreto C., Briceño B. y Morales E. 2004. Exopolysaccharide,
pigment and protein production by the marine microalga Chroomonas sp. in
semicontinuous culture. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 20(2): 179-183.

Lowry O., Rosenbrough H., Farr A. y Randall R. 1951. Protein measurement with the folin-
phenol reagent. J. Biol. Biochem., 193: 265-275.

Herbert D., Phipps P. y Stronoe P. 1971. Chemical analysis of microbial cells. En Norris J.
y Ribbons D. (eds). Methods in Microbiology. Academic Press (5B): 209-344.

92
 PRACTICA Nº 10

"ANÁLISIS CARBOHIDRATOS. METODO

ESPECTROFOTOMÉTRICO".

Introducción:
Los procedimientos más utilizados para la determinación cuantitativa de carbohidratos son
los métodos colorimétricos del fenol-ácido sulfúrico (Dubois et al., 1956) o de la antrona
(Yemm y Willis,1954; Parsons et al., 1984). En ambos, el H2 SO4 hidroliza los enlaces
glucosídicos y el fenol o la antrona reaccionan con el monosacárido resultante para
producir un producto coloreado. Este proceso requiere una gran cantidad de energía,
proporcionada por la reacción entre el ácido sulfúrico y el agua. El producto resultante es
un compuesto amarillo-marrón, con pico de absorción a 485 nm, longitud a la cual la
relación entre la concentración y la intensidad del color es lineal (Arredondo y col. 1998).

El método de Dubois et al. (1956) fue originalmente descrito como una técnica no
específica para carbohidratos, pero posteriormente fue comparado con el método de la
antrona y con el de N-ethylcarbazole (Handa, 1966) y se encontró que era el más adecuado
para el análisis de carbohidratos totales (Gerchakov y Hatcher, 1972). Este método permite
determinar concentraciones de entre 5 y 100 μg/mL, es sensitivo a una amplia variedad de
carbohidratos, incluyendo azúcares, azúcares metilados y polisacáridos acídicos y neutrales,
es poco sensible a la interferencia con proteínas y el color producido es muy estable
(Kochert, 1978). Su único inconveniente es la interferencia de las pentosas de los ácidos

93
nucleicos, pero por su gran simplicidad es el de uso más extendido en las investigaciones
con especies microalgales.
El método de carbohidratos de Dubois y col. (1956) es utilizado también para cuantificar la
concentración de carbohidratos totales de exopolisacáridos en el sobrenadante de los
cultivo de microalgas y cianobacterias. De igual manera el contenido de carbohidratos
presentes en los exopolisacáridos capsulares puede cuantificarse previa extracción de estos.

I.-Protocolo para la determinación de carbohidratos totales (Dubois et. al.,

1956).

a.-REACTIVOS:
1. NaOH 1M
2. Fenol al 80% (Calentar fenol cristalizado en baño de maría a 40ºC. Llevar 37,5 mL de
fenol líquido hasta 50 mL con agua destilada. Mantener en botella de vidrio oscuro. La
solución puede llegar a tomar un color oscuro, lo cual no interfiere con el ensayo. Puede ser
utilizada por meses. Mantener a temperatura ambiente.
3. Ácido sulfúrico concentrado.

b.- PROTOCOLO:
1. Añadir a la muestra fresca o congelada (normalmente 2 mL de cultivo) 4 mL de NaOH
1M. Agitar en vórtex y sonicar en frio si es necesario.
2. Repartir 1 mL en tubos (triplicado).
3. Añadir 25 µL de fenol al 80% y agitar. Agregar inmediatamente después 2,5 mL de
ácido sulfúrico y agitar. Repetir esta operación con todas las muestras y la curva patrón.
4. Dejar enfriar a temperatura ambiente durante 30 minutos
5. Leer a 484 nm antes de las 2 horas.
6. La curva debe ser ajustada a la ecuación de una curva de primer grado. Pero, también
pueden ajustarse por mínimos cuadrados a una ecuación de segundo grado, obteniendo la
“R2”, el valor de la pendiente (m), utilizando el intercepto (b) igual a cero. El valor de R2
deberá ser superior a 0.98. Si se obtiene un valor inferior, se repite la calibración con una
nueva serie de diluciones y, si el resultado es similar, entonces se recomienda preparar
soluciones nuevas (Arredondo y col. 1998).
7. Recuerde tomar en cuenta cualquier dilución realizada para el cálculo de la
concentración de carbohidratos de la muestra final.
94
8. Muchas veces las microalgas poseen altas concentraciones de carbohidratos por lo cual
es importante jugar con el volumen de muestra y con el volumen de dilución de la misma.

c.-CURVA PATRÓN
1. Preparar una disolución de glucosa anhidra 1 mg mL-1 en NaOH 1M.
2. Tomar 1 mL de dicha disolución y añadirle 9 mL de NaOH. Con esta nueva solución, hacer la
curva patrón

Blanco
µL Glucosa 0 200 400 600 800 1000
µL NaOH 1000 800 600 400 200 0

Bibliografía:

Arredondo, B., Cordero, B. y Voltolina, D. 1998. Determinación de carbohidratos por

métodos espectrofotométricos. Capítulo 5. Métodos y herramientas analíticas en la
evaluación de la biomasa microalgal. CIBNOR-MEXICO.

Dubois M., Gilles K., Hamilton J., Rebers P. y Smith F. 1956.Colorimetric method for
determination of sugars and related substances. Ann. Chem., 28: 350-356.

Gerchakov, S. M., y. Hatcher, P. G. (1972). Improved technique for analysis of

carbohydrates in sediments. Limnology and Oceanography 17 (6): 938-943.

Kochert G. 1978. Carbohydrate determination by the phenol-sulfuric acid method. En

Hellebust J. y Craigie J. (eds). Handbook of Phycological Methods. Physiological and
Biochemical Methods. Cambridge University Press. Cambridge, RU. pp. 95-97.

95
 PRACTICA Nº 11

"ANÁLISIS DE LIPIDOS. METODO ESPECTROFOTOMÉTRICO".

Introducción:

Los más utilizados se basan en el sistema:

cloroformo/ metanol / agua CHCl3/CH3OH/ H2O propuesto por Folch et al. (1956) y
mejorado por Bligh y Dyer (1959). Ambas técnicas de basan en la formación de una mezcla
monofásica de cloroformo, metanol y agua (CHCl3:CH3OH:H2O) con la que se asegura la
extracción de la mayoría de los lípidos incluyendo aquellos que se encuentran ligados a
otras moléculas. Se le agrega agua y cloroformo al extracto resultante de tal manera que se
forma una solución bifásica formada por metanol y agua en la parte superior y cloroformo
en la parte inferior.

La cromatografía es la herramienta más utilizada para separar y purificar los diversos tipos
de lípidos ya sea por columna, o en capa fina. Sin embargo, cuando se desea utilizar un
método espectrofotométrico se incurre a los denominados Métodos destructivos y los
cuales se basan en la relación directamente proporcional que hay entre la densidad óptica de
los lípidos calcinados y su concentración inicial. Estos métodos destructivos consisten en
quemar y/o calcinar la materia orgánica (lípidos totales) con algún agente muy reactivo
como el H2SO4 concentrado (Marsh y Weinstein, 1966).

Método de calcinación de Marsh y Weinstein (1966).

El método más sencillo es el propuesto por Weinstein (1966), dicha técnica tiene la ventaja
de tener una alta reproducibilidad y la utilización de un reactivo simple y estable como
H2SO4 concentrado.

a.-Reactivos:
1. Metanol
2. Cloroformo
3. Ácido sulfúrico concentrado
4. Tripalmitina

96
b- Curva de calibración:
Para calcular la curva de calibración de lípidos utilizando la técnica de Marsh y Weinstein
(1963), se preparan soluciones de una mezcla de lípidos de concentración conocida de 30,
60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, y 270 μg/mL. Debido a que la pendiente está en función
del peso molecular de los lípidos se recomienda que queden representados los triglicéridos
(triestearina, tripalmitina o triheptadecaoina), los esteroles (colesterol) y los fosfolípidos
(fosfatidilserina). El blanco corresponde solamente a 2 mL de ácido sulfúrico.

En nuestro caso se prepara una disolución de Tripalmitina de 3mg en 10 mL de cloroformo

y se reparte en tubos por triplicado:

Volumen (µL) [mg mL-1]

100 0,03
200 0,06
300 0,09
400 0,12
500 0,15
600 0,18
700 0,21
800 0,24
900 0,27

La Tripalmitina debe reemplazarse por otra sustancia en el caso de determinar fosfolípidos

o glucolípidos

c.-Protocolo:

Extracción de lípidos
1. Agregar a 2 mL de biomasa fresca o congelada 3 mL de metanol y 1,5 mL de
cloroformo.
2. Sonicar durante 2 minutos, protegiendo de la luz. Alternativamente a la sonicación, se
pueden mantener los tubos en la nevera durante 24 horas, protegidos de la luz.
3. centrifugar a 400 rpm por 10 minutos y recoger el sobrenadante.
4. Añadir 1,5 mL de cloroformo y 1,5 mL de agua destilada.
5. Agitar hasta obtener una solución homogénea y densa.
6. Centrifugar a 400 rpm por 5 minutos.
7. Retirar la fase superior acuosa con una pipeta Pasteur de cuello largo. Añadir 0,5 mL de
acetona para ayudar a eliminar las trazas de agua.
8. Evaporar la fase orgánica a 37ºC durante 24 horas o al vacío.
9. Resuspender en 1 mL de cloroformo hasta su utilización y conservar a -20ºC.

97
Carbonización simple
1. Se reparte la muestra resuspendida en cloroformo por triplicado (200 µL por tubo) y se
evapora de nuevo.
2. Adicionar 2 mL de ácido sulfúrico concentrado a cada tubo de la curva patrón
(previamente evaporadas), blanco (tubo limpio) y muestras, que a partir de este momento
siguen el mismo proceso.
3. Calentar a 200ºC durante 15 minutos (la temperatura no debe variar más de 2ºC).
4. Enfriar los tubos en nevera durante 10 minutos.
5. Añadir 3 mL de agua destilada, mezclar bien y volver a la nevera hasta que se enfríen
bien los tubos y desaparezcan las burbujas
6. Medir a 375 nm. Las lecturas debe realizarse antes de las 2 horas
7. La curva debe ser ajustada a la ecuación de una curva de primer grado.
8. Recuerde tomar en cuenta cualquier dilución realizada para el cálculo de la
concentración de lípidos de la muestra final.

Bibliografía:
Rodríguez, J., Carreón., L. y Arjona, M. 1998. Extracción y cuantificación de lípidos por
métodos espectrofotométricos. Capítulo 6. Métodos y herramientas analíticas en la
evaluación de la biomasa microalgal. CIBNOR-MEXICO.

Barnes, H. y Blackstock, J. (1973). Estimation of lipids in marine animals and tissues:

Detailed investigation of the sulphophosphovainillin method for total lipids. Journal of
Experimental Marine Biology and Ecology. 12:103-118.

Bligh, G. y Dyer, J. (1959). A rapid method of total lipid extraction and purification.
Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37(3): 911-917.

Casey, A. (1969). Separation of neutral lipids of shark liver by “dry-column”

chromatography. Journal of Lipid Research 10: 456 - 459.

Christhie, W. (2003). Lipid Analysis: Isolation, Separation, Identification and Structural

Analysis of Lipids. Bridgater, England. 416 pp.

Folch, J., Less, M. y Stanley, G. (1956). A simple method for the isolation and purification
of total lipids from animal tissues. Journal of Biology and Chemistry. 226: 497 – 509.

Grahl-Nielsen, O. Hammill, M., Marsh, B. y Weinstein, B. (1966). Simple charring method

for determination of lipids. Journal of Lipid Research. 7: 574-576.

Marsh, B. y Weinstein, B. (1966). Simple charring method for determination of lipids.

Journal of Lipid Research. 7: 574-576.

98
 PRACTICA Nº12

"ANÁLISIS CUALITATIVO Y CUANTITATIVO DE EXOPOLISACÁRIDOS

CIANOBACTERIANOS".

Introducción:
Otros de los compuestos producidos por diversas cepas de cianobacterias son los
exopolisacáridos, los cuales son utilizados como estabilizadores, agentes gelificantes y
emulsificantes (Ventosa y Nieto, 1995) para dar al alimento calidad y textura. En la
industria farmacéutica pueden ser usados como envoltorios o moldes hidrofílicos para el
control de las medicinas hasta su comercialización.

También se han aplicado en el desarrollo de vacunas bacterianas; también como agentes

anti HIV y en otros tratamientos. Los carbohidratos aparentan ser el principal componente
de los productos exudados del fitoplancton. Se ha sugerido que los polisacáridos disueltos
juegan un rol importante como recolectores naturales de metales y que pueden reducir la
toxicidad de metales pesados en ambientes acuáticos (Kaplan y col., 1987).

Estudios sobre la influencia de diferentes condiciones de cultivo de cianobacterias en la

composición química de los EPS han sido descritos por De Philippis y col., (1998). Bajo
ciertas condiciones de cultivo, las cianobacterias pueden producir EPS (Matsunaga y col.,
1996). En Anabaena sp. PCC 7120, se ha descrito que la síntesis de EPS es incrementada
con el pH en cultivos discontinuos (Morales y col., 2002).

En general se acepta que la síntesis de polisacáridos exocelulares representa una estrategia

de supervivencia y de crecimiento en las cianobacterias, especialmente cuando las
condiciones ambientales son desfavorables. Esta producción está en función de cambios
significativos en los factores externos como la temperatura, concentración de nitrógeno o la
irradiancia (Moreno y col., 1998).

99
Figura 1: observación de exopolicáridos capsulares en Nostoc LAUN 0015 con el método
de tinción de la tinta china y en función de la suficiencia y deficiencia de nitrógeno
(Rosales, 2008).

a.-Metodología:

Determinación cualitativa de exopolisacáridos (EPS) y polisacáridos capsulares (PSC).

El método cualitativo se basa ya sea en la tinción negativa con tinta china para
monitorear la presencia y/o ausencia de PSC (Otero y Vicenzini, 2004) o con el uso de azul
de alcián para la tinción tanto de EPS como PSC (Powell y col. 1982).

Determinación cuantitativa de exopolisacáridos (EPS).

Se realiza mediante el método propuesto por Shah y col. (2000), en el cual se hace
precipitar el EPS con metanol 1:1, a partir del sobrenadante extraído de los cultivos
celulares.

Para la obtención del sobrenadante, se dejaron sin aireación los cultivos para así permitir
que la biomasa sedimentara y luego se retira con mucho cuidado el sobrenadante, el cual
posteriormente se centrifuga para evitar que contuviera restos de biomasa. Tanto el
sobrenadante como el solvente deben mezclarse fríos y mantenidos a 4 °C por 24 horas

100
para asegurar una mejor precipitación. Un precipitado blanco se formará si la reacción era
positiva.

Posterior a esto deben ser centrifugados, lavados dos veces con una mezcla agua destilada y
el solvente 1:1, para extraer el exceso de sales disueltas, secados a 60ºC, y finalmente
pesados.

Determinación cuantitativa de polisacáridos capsulares (PSC).

La obtención de los polisacáridos capsulares se realiza 5 gr de la biomasa en 100 mL de

agua destilada calentando a 80 °C durante 6 horas y luego centrifugada para colectar el
sobrenadante (Su y col. 2008). Dicho sobrenadante se somete a una prueba de
carbohidratos totales, según el método de Dubois y col. (1956) con las modificaciones
realizadas por Kochert (1978).

Bibliografia

De Philippis R., Margheri M., Materassi R., Vincenzini M. 1998. Potential of unicellular
cyanobacteria from saline environments as exopolysaccharide producers. Appl. Environ.
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102
 ANEXO

"CLAVE DE IDENTIFICACION DE CIERTOS GENEROS DE MICROALGAS Y

CIANOBACTERIAS OBSERVADOS EN EMBALSES DE LA PROVINCIA DE
PICHINCHA-ECUADOR".

103
 CLAVE DE IDENTIFICACION DE CIERTOS GENEROS DE MICROALGAS Y
CIANOBACTERIAS OBSERVADOS EN EMBALSES DE LA PROVINCIA DE
PICHINCHA-ECUADOR.

1.a. Células o filamentos generalmente verde azulados

………………………………………………………………………………….. 4

1.b. Células o filamentos generalmente verdes o de otra tonalidad………………. 2

2.a. Pared celular rígida, construidas por dos partes en donde una encaja sobre la otra,
con patrón regular de finas estrías. Plastidios marrón naranja a verde, ausencia de
flagelos. .............................................................………………….DIATOMEAS 15

2.b. Pared celular rígida o periplasto, no integrada en dos partes combinadas,

ausencia de finas estrías. Plastidios generalmente de color verde. Presencia o ausencia
de flagelos..................................................................................................... 3

3.a. Célula o colonia móvil, presencia de flagelos, parte anterior y posterior celular
diferente una de la otra…………………………………………………………….. 33

3.b. Célula inmóvil, ausencia de un verdadero flagelo, parte anterior y posterior de la

célula indiferenciadas (algas verdes y formas asociadas)………………………… 45

4.a. Células unidas en filamentos (tricomas)………………………………………... 5

4.b. Células no unidas en filamentos………………………………………………… 13

I. CIANOBACTERIAS

5.a. Presencia de heterocistos ………………………….. 6

5.b. Ausencia de heterocistos …………………………... 7

6.a. Filamento en una matriz gelatinosa común.........…...…...…NOSTOC

6.b. Filamento carente de una matriz gelatinosa común....…ANABAENA

7.a. Filamentos falsos pareados...........................................SCYTONEMA

7.b. Filamentos falsos sencillos..........................................TOLYPOTRIX

8.a. Filamento septado….............................………………ARTHROSPIRA

104
8.b. Filamento no septado…….........……………………….. SPIRULINA

9.a. Filamento rodeado por una pared laminar, la cual con frecuencia se extiende
hasta el final de la célula filamentosa y sin movimiento……….............................… 10

9.b. Filamento sin movimiento y carente de una pared celular…................................ 11

10. a. Células separadas entre si…...........………………..…JOANNESBAPTISTIA

10.b. Células en contacto con las adyacentes…....……….... LYNGBYA

11.a. Filamentos cortos con menos de veinte células, con una o ambas terminaciones
celulares en punta...………………………………………….RAFIDHIOPSIS

11.b. Filamentos largos, con más de veinte células, las cuales no terminan en
punta…………………………...……………………………OSCILLATORIA

12.a. Filamentos muy unidos entre si generalmente formando grupos

paralelos………………………………………………..…..MICROCOLEUS

12.b. Filamentos dispuestos en manera irregular formando a menudo un manto y con un

extremo en forma de gancho ….……………………….….PHORMIDIUM

13.a. Células muestran un patrón regular, dispuestas en hileras paralelas sobre una
placa…...……………………… …………….. MERISMOPEDIA

13.b. Células no muestran un patrón regular ni forman placas. 14

24.a. Células aisladas o en pares, agrupadas o en colonias de dos hasta treinta y dos
células……....…………………………………………......CHROOCOCCUS

14.b. Células numerosas en una colonia irregular en cuanto a

forma….......………………..…………….………............MICROCYSTIS

II. CHRYSOPHYTAS (Diatomeas)

15.a. Perfil de las valvas circular, algunas veces elíptico. No llevan marcas
discernibles, concéntricas o en un arreglo radial. Las células pueden formar colonias
formando un filamento…………………………….…Diatomeas Céntricas 16

15.b. Perfil de valvas desde elíptico hasta en forma de bastoncillos o cilindricas,

raramente circular, simetría bilateral o asimétricos. Células cuando agrupadas en
forma en empalizada…...............……………….…. Diatomeas Pennadas. 18

16.a. Células adyacentes unidas en gran parte por la superficies de las valvas o por

105
dentículos marginales….........……………………………..MELOSIRA

16.b. Células solitarias o en filamentos frágiles, a menudos observadas en cara

valvar……………………………………………… 17

17.a. Vista valvar con estrías radiales extendidas desde el centro hasta los márgenes y con
espinas cortas marginales a menudo
presentes…................................................................…….STEPHANODISCUS

17.b. Vista valvar con hileras y puntos no delineados que parten desde el centro hasta los
márgenes con espinas marginales
minimas...........................................................................…COSCINODISCUS

18.a. Células longitudinalmente simétricas en vista valvar................ 19

18.b. Células longitudinalmente sin simetría en vista valvar……… 232

19.a. Rafe axial en o cerca de los márgenes de las valvas………... 20

19.b. Rafe o seudorefe medial o submedial… 21

20.a. Frústulos ligeramente curvados con márgenes carinados opuestos uno a

otro…………..........................................…………..……...HANTZSCHIA

20.b. Márgenes carinados diagonal uno otro…...………….NITZSCHIA

21.a. Valvas transversalmente simétricas….....……………………….. 22

21.b. Valvas transversalmente asimétricas…...……………………….. 30

22.a. Vista valvar oval y longitud de la célula el doble de su

anchura…...............................................................................COCCONEIS

22.b. Células alargadas, su longitud es superior al doble de su

anchura…................................................................................…………. 23

23.a. Vista valvar angosta y ancha en su vista

pleural….......................................................………………TABELLARIA

23.b. Caras valvar y pleural casi iguales en

anchura….................................................……………………………... 24

24.a. Cara valvar con estrías continuas, ausencia de poros y líneas

marginales……...…………………………………………..DIATOMA

24.b. Cara valvar con estrías cruzadas interrumpidas por espacios longitudinales 25

106
(pseudorafe) o por rafe o por hileras de puntos crinados…..………………………...

25.a. Células unidas lateralmente entre si formando cintas de muchas o pocas

células…………………………………………………..…..FRAGILLARIA

25.b. Células aisladas o pareadas…....……………………………….. 26

26.a. Células muy alargadas, lineales, sin verdadero rafe…SYNEDRA

26.b. Células en forma de bote o canoa, presencia de rafe….....…….. 27

27.a. Células longitudinalmente asimétricas en vista pleural, de vida libre o adherida algún
sustrato ...…………..……………..………………………. ACHNANTHES

27.b. Células simétricas en vista pleural y valvar, generalmente adherida

….................................................................................………. 28

28.a. Presencia de un área sin estrías, sin formar una franja en la mitad de la
célula……....…………………………….………………… STAURONEIS

28.b. Ausencia de una franja continua en la mitad de la

célula...........................................................................................................................29

29.a. Células con líneas transversales solidas y bien

definidas...............................................................…….…….PINNULARIA

29.b. Células con líneas transversales finas, como líneas

punteadas…........................................................................….NAVICULA

30.a. Células coloniales con forma de abanicos ……….……..MERIDION

30.b. Células no en colonias …….......…………………………….. 31

31.a. Células arqueadas en vista pleural ….…………………..RHOICOSPHAENIA

31.b. Células rectas en vista pleural…….………………….…GOMPHONEMA

32.a. Rafe generalmente ocupa el centro de la valva, en forma de empanada y a veces en

hileras en tubos gelatinoso…..…………………………….….CYMBELLA

32.b. Rafe excéntrico, cerca del terminal cóncavo de la valva, no en tubos gelatinosos
………………………………………………………………. AMPHORA

107
ALGAS FLAGELADAS

33.a. Con lórica pigmentada o no pigmentada…………………………34

34.a.Lórica color marrón oscuro a rojo, plastidios color verde, con un flagelo visible
………………………………………………………...TRACHELOMONAS

34.b. Lórica decolorada, plastidios color marrón,

monoflagelado.............................................................CHRYSOCOCCUS

33.b. Ausencia de lórica...........................................................................35

35.a. Célula en forma de guisante, plastídios de color verde azulado, dos flagelos
laterales........................................................................CHROOMONAS

35.b. Célula no en forma de guisante, plastídios de color marrón, rojo o verde

oliva..................................................................................................... 36

36.a. Plastídios de color marrón, presencia de uno o dos flagelos ........ 37

36.b. Plastídios de color rojo, rojo a marrón o verde oliva. Presencia de dos
flagelos….......................................................................RHODOMONAS

37.a. Margen anterior celular en forma oblicua con dos

flagelos...........................................................................CRYPTOMONAS

37.b. Margen anterior celular redondo o puntiagudas con un solo

flagelo….........................................................................CHROMULINAS

38.a. Presencia de ala rectangular; sin color….......…….PTEROMONAS

38.b. Ausencia de alas……………………………..………………………………… 39

39.a. Células aplanadas en forma de hoja con muesca y estrías, con márgenes rígidos
……….......………………………………………………PHACUS

39.b. Células no aplanadas, libres o en colonias y con flagelos.…......... 40

40.a. Células libres con dos flagelos ……….....…………………………41

41a. Células con dos flagelos ……....……………………………………42

42a. Células no flexibles en forma de pera a veces en palmella y sin

estigma………………………………………..……….…CHLAMYDOMONAS

42b. Células motiles con cambios de forma drásticos o lentos, verdes o incoloras con
estigma…...................................................................................................43

108
43ª. Células alargadas verde o sin color, con periplasto
flexible….........................................................................EUGLENA

43b.Células globosas de color siempre verde en forma de

limón….......................................................................…LEPOCINCLIS

41.b. Células con cuatro flagelos .........……………….CARTERIA

40b. Células en colonias y flageladas….................................…………..44

III. CLOROFITAS NO FLAGELADAS O COLONIALES FLAGELADAS

44.a. Colonias globosas incluso con colonias hijas en su interior..VOLVOX

44b. Colonias no globosas con arreglo radial…...............PANDORINA

45.a. Alga conformada por dos Hemicélulas con extensiones

….....................................................................................STAURASTRUM

45.b. Alga no conformada por Hemicélulas y sin extensiones….......… 46

46.a. Célula curvada y extremos puntiagudos con núcleo central…...…..47

46.b. Células no curvadas, en otras formas, o filamentos, aisladas o en

colonias...........................................................................................51

47.a. Células muy alargadas aciculares a veces agrupadas

.........................................................................................CLOSTERIOPSIS

47.b. Células ligeramente curvadas, no muy alargadas…........……48

48.a. Células curvadas y extremos puntiagudos…..............……….49

49.a. Células solitarias con núcleo central, con vacuola

terminal...........................................................................CLOSTERIUM

49.b. Célula sin núcleo central y sin vacuola

terminal..........................................................................CLOSTERIDIUM

48.b. Células aciculares o fusiformes agrupadas...............................50

50.a. Células rectas o aciculares o fusiformes

agrupadas.......................................................................ANKISTRODESMUS

50.b. Células...en forma de luna creciente....................SELENASTRUM

51.a. Colonias esféricas o irregulares............................................52

109
52.a. Células conspicuas ..............................................................53

53.a. Colonias esféricas con células ovales..................OOCYSTIS

53.b. Colonias con células interconectadas.................COELASTRUM

52.b.Células no conspicuas con colonias

interconectadas............................................................BOTRYOCOCCUS

51.b. No en colônias, aisladas o em grupos o unidas en

filamentos............................................................................................54

54.a. Células con núcleo y solitárias .............................................55

55.a. Células esféricas u ovoides, cloroplasto en forma de

copa.......................................................................CHLORELLA

55.b. Células esféricas, cloroplasto no en copa y pared celular muy

gruesa.................................................................. .CHLOROCOCCUM

54.b. Células con núcleo y unidas formando filamentos...............56

56.a. Plastidios acintado ....................................................................57

57.a. En forma de espiral…..............………………...SPIROGYRA

57.b. No en forma de espiral................. ..................…………..........58

58.a. Filamento con células cilíndricas..............................................59

58.a. Filamento no con células cilíndricas ..................TRIBONEMA

59.a. Plastidios planos en forma de cinta axial torcida…………………..

.......................................................................................MOUGEOTIA

59b. Plastidios forman bandas marginales en forma de arcos y

doblados….....................................................…...........ULOTHRIX

Autor: Dr. Ever Darío Morales Avendaño

Profesor PROMETEO-SENESCYT 2012
QUITO-ECUADOR

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