Manual de Bacteriologia Veterinaria-Version para Saeti

INDICE
Pgina INTRODUCCIN REGLAMENTO INTERNO DEL LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA Y MICOLOGIA VETERINARIA PRACTICAS DE LABORATORIO MEDIDAS DE SEGURIDAD Y REGLAMENTOS DE LABORATORIO MORFOLOGA MICROSCPICA Y TINCIONES SIMPLES MORFOLOGA COLONIAL Y AISLAMIENTO POR ESTRA CRUZADA TINCIN DE GRAM TINCIN DE ZIEHL-NIELSEN TINCIONES SELECTIVAS AISLAMIENTO DE HONGOS Y MORFOLOGA COLONIAL CULTIVO DE ANAEROBIOS USO DE MEDIOS SELECTIVOS USO DE PRUEBAS BIOQUIMICAS PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A ANTIMICROBIANOS COLECCIN Y ENVIO DE MUESTRAS AL LABORATORIO ANLISIS BACTERIOLGICO DE PROCESOS PIOGNICOS ANLISIS BACTERIOLGICO DE HECES Y ORINA ANLISIS BACTERIOLGICO DE ORGANOS ANLISIS BACTERIOLGICO DE ALIMENTOS ANEXO 1. RIESGO BIOLGICO ANEXO 2. CUIDADOS DEL MICROSCOPIO ANEXO 3. LAVADO, ESTERILIZACIN Y DESINFECCION DE MATERIALES ANEXO 4. Formatos de Reporte 2 3
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16.
5 7 11 18 22 26 32 39 43 50 55 60 64 68 74 78 83 86 90 88
INTRODUCCIN
La adquisicin de habilidades y conocimientos que implican el aprendizaje de la Bacteriologa y la Micologa Veterinaria tiene implcito para el facilitador del curso y el estudiante, el manejo de microorganismos potencialmente patgenos o patgenos para su salud. De ah que resulta indispensable la comunicacin clara y participacin responsable de cada uno de los integrantes del grupo con la finalidad de minimizar y controlar los riesgos biolgicos, fsicos y qumicos que se presentan en la realizacin de cada una de las prcticas que se describen en este manual.
El Manual de Bacteriologa y Micologa Veterinaria del Instituto Tecnolgico de Sonora tiene como objetivo ser una gua para el alumno y el facilitador del curso en el proceso de aprendizaje, da inicio con la presentacin de los lineamientos del Laboratorio de Bacteriologa y Micologa Veterinaria y se desarrolla de tal forma que permite al alumno construir su propio conocimiento a travs de la adquisicin de habilidades manuales, de observacin minuciosa y del conocimiento a un nivel descriptivo, por lo que al inicio las prcticas de laboratorio son muy sencillas y permiten la integracin gradual del conocimiento, hasta la participacin del alumno en actividades de campo como la toma de muestras, la integracin de la historia clnica, que implican el manejo y contacto con las diferentes especies animales, as como la interaccin con los productores para recabar la informacin necesaria, culminando en la aplicacin e integracin del conocimiento para llegar a un diagnstico definitivo. Se incluyen adems en las ltimas sesiones el manejo de pruebas semi automatizadas con principios biotecnolgicos, que tienen gran demanda por su precisin y rapidez, con esto se pretende brindar al alumno herramientas actualizadas y conocimientos de vanguardia para su posterior aplicacin en el rea mdica.
REGLAMENTO INTERNO LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA Y MICOLOGIA VETERINARIA
Este documento tiene como objetivo evitar los riesgos de exposicin y accidentes de contaminacin con microorganismos en el laboratorio. 1. Los maestros, alumnos de servicio social y estudiantes usaran siempre bata blanca, limpia, abotonada y de manga larga. 2. La tolerancia mxima para permitir el acceso de los alumnos al laboratorio es de 10 minutos. 3. Usar el cabello recogido, calzado cerrado. No se permitir el acceso con pantaln corto por riesgo de quemaduras y contaminacin. 4. Los alumnos deben tener las uas cortas, sin alhajas (anillos, reloj, pulsera, etc.) 5. No se permite el uso de sombrero y gorras. 6. El alumno guardar sus objetos personales en las gavetas. 7. Est prohibido introducir alimentos, comer, beber, fumar y masticar chicle en el laboratorio. 8. Apagar el telfono celular al ingresar al laboratorio, no se permitir su uso interno. 9. Evitar llevarse objetos a la boca, tocarse la cara, cabello, ojos, etc. 10. Mantener limpia la mesa de trabajo, desinfectarla al inicio y al trmino de la prctica. 11. Las cajas de petri y materiales de laboratorio contaminados se les retirara la cinta adhesiva y etiquetas y se colocarn en el rea sucia para su posterior esterilizacin y lavado. 12. Los portaobjetos y pipetas contaminados, se colocarn en recipientes con desinfectante, en el rea sucia, para su posterior lavado. 13. Es requisito indispensable para el ingreso al laboratorio que el alumno lleve el manual de practicas correspondiente. 14. En caso de heridas o erosiones en la superficie corporal, el alumno dar aviso al maestro, quien evaluar la magnitud de la lesin y aplicar las medidas de seguridad necesarias para el caso. 15. El alumno dar aviso inmediato al maestro en caso de derramarse un cultivo viable o romperse una caja de petri. 16. Antes de salir verifique que las llaves de gas y agua estn bien cerradas.
17. Lavar perfectamente sus manos con agua y jabn y aplicarse el antisptico a disposicin antes de salir del laboratorio. 18. Los reportes de cada prctica se entregarn una semana despus de concluida, sin excepcin. 19. Los exmenes se aplicarn al inicio de cada prctica. 20. Es obligatorio que el alumno entregue el diagrama de flujo previo a la realizacin de la prctica. 21. Todos los alumnos estn obligados a participar en el da asignado para la esterilizacin y limpieza de los materiales.
ATENTAMENTE
ACADEMIA DE BACTERIOLOGIA Y MICOLOGIA VETERINARIA
INSTITUTO TECNOLGICO DE SONORA LABORATORIO DE BACTERIOLOGA Y MICOLOGA VETERINARIA PRACTICA 1 MEDIDAS DE SEGURIDAD Y REGLAMENTOS DE LABORATORIO INTRODUCCIN:
Ante los mltiples casos que se han presentado de infecciones asociadas al laboratorio en los ltimos aos, organismos internacionales como la Organizacin Mundial de la Salud (OMS), han recomendado tomar medidas preventivas para proteger la salud de los investigadores, tcnicos laboratoristas y estudiantes. Si se consideran estas medidas de seguridad el personal que trabaja en laboratorios de microbiologa puede minimizar el riesgo de infeccin.
Las medidas de seguridad deben ser adecuadas para el tipo de microorganismo en estudio, pues estos varan en su capacidad de producir infecciones. Algunos pueden ser inofensivos, otros pueden causar sntomas leves; otros ms pueden ser graves para la salud y los menos pueden tener una amplia capacidad de difundirse y causar brotes epidmicos. Esta gama ha permitido a los investigadores clasificar a los microorganismos en cuatro grupos de riesgo. Estos se han publicado en las Medidas de seguridad del programa de Microbiologa de la Organizacin Mundial de la Salud.
COMPETENCIA:
El alumno aplicara las medidas de seguridad que se han implementado en el laboratorio de bacteriologa y micologa veterinaria para la proteccin de la salud y se comprometer a seguir los lineamientos marcados en el Manual de Laboratorios del ITSON.
DESARROLLO DE LA PRCTICA:
El alumno leer junto con el maestro el captulo anexo de Riesgo Biolgico del Manual de Laboratorios del ITSON.
ASIGNACIN Elaborar un mapa conceptual del capitulo I Seguridad en microbiologa Del libro Mtodos Microbiolgicos de C.H. Collins y Patricia M. Lyne. (falta completar la referencia, ao, editorial, pas, pginas )
INSTITUTO TECNOLGICO DE SONORA
LABORATORIO DE BACTERIOLOGA Y MICOLOGA VETERINARIA
PRCTICA 2
MORFOLOGA MICROSCPICA Y TINCIONES SIMPLES
INTRODUCCIN
El microscopio es un instrumento que seguramente ha sido utilizado por los estudiantes en otros cursos, sin embargo se ha incluido en este curso para recordar su manejo y desarrollar la habilidad para trabajar con el objetivo de inmersin cuyo uso es obligado en la observacin de microorganismos y sus estructuras.
El microscopio compuesto es un instrumento de precisin que consiste en una serie de lentes diseadas y acomodadas para proveer las mximas amplificaciones posibles del espcimen que se va a observar. El aumento total que se puede alcanzar en un microscopio compuesto depende de la combinacin del ocular con el objetivo y se obtiene multiplicando el nmero de aumentos del ocular por el nmero de aumentos del objetivo.
Tratar de observar a los microorganismos con un microscopio ptico sin un contraste adecuado es casi imposible, ya que como los microorganismos estn compuestos sobre todo de agua, que es el medio en el que normalmente estn suspendidos, es como tratar de ver un objeto blanco sobre un fondo blanco. Las tinciones que se usan en microbiologa se desarrollaron para incrementar el contraste entre el espcimen y el fondo que lo rodea, ante la necesidad de poner de manifiesto la forma, tamao y agrupacin de las bacterias, as como sus estructuras. Fue Roberto Koch quien introdujo en microbiologa el uso de preparaciones fijas o permanentes (frotas), al dejar secar al aire las preparaciones en fresco y sin teir, para fijarlas qumicamente y teirlas despus con colorantes derivados de la anilina. En la actualidad, la mayora de las tcnicas de tincin usan frotis fijos que consisten en colocar sobre un portaobjetos, una
suspensin de bacterias que se deja secar. A la preparacin as obtenida, se le pasa rpidamente sobre una flama para que el calor fije las clulas al portaobjetos. La accin desnaturalizante del calor deshidrata la suspensin y mata a la mayora de las bacterias, dejndolas en posibilidad de ser teidas posteriormente, as mismo, evita que las bacterias se desprendan del portaobjetos durante los diferentes procesos de tincin. Es importante saber que algunas bacterias pueden sobrevivir a la fijacin del calor, por lo que todo frotis fijo debe considerarse potencialmente infeccioso.
En el procedimiento de tincin se emplea un slo colorante. Una vez fija la preparacin, se le agrega la solucin colorante y se deja actuar aproximadamente un minuto, se enjuaga con agua para quitar el exceso de colorante, se deja secar y se procede a observar al microscopio.
Los colorantes son sustancias que originalmente se derivaron de la anilina y que qumicamente estn constituidos por uno o ms anillos aromticos. Estos anillos aromticos presentan sustituyentes llamados cromforos que son responsables del color, formando los compuestos cromgenos. Estos cromgenos presentan adems, grupos ionizables llamados auxocromos que permiten unir el colorante a estructuras de carga contraria de clulas y tejidos. Sin estos grupos las soluciones coloridas no podran teir.
Incluir una imagen que ejemplifique los anillos aromaticos en un colorante.
COMPETENCIA: El alumno diferenciar la forma y agrupacin microscpica de los microorganismos mediante el uso de tinciones simples y el microscopio compuesto.
MATERIAL:
Microscopio de campo luminoso Aceite de inmersin
Tela suave y papel seda Lpices de colores
Soluciones de cristal violeta, azul de metileno, verde de malaquita, safranina y fucsina bsica. Cultivo de bacterias Portaobjetos
Asa bacteriolgica Mechero de Bunsen Puente de coloracin.
MTODOS:
Antes de iniciar con los procedimientos de la prctica leer el anexo
1. Elaboracin de frotis a partir de un medio slido Marca en un extremo los portaobjetos limpios y desengrasados Con el asa bacteriolgica o un gotero, coloca una pequea gota de agua en el centro del portaobjetos. Con el asa estril toma una pequea cantidad de crecimiento y con movimientos giratorios haz una suspensin homognea en la gota de agua, extendindola para formar una pelcula delgada. Esterilice nuevamente el asa. Deja secar al aire el frotis Fija el frotis al calor pasando la parte posterior del portaobjetos dos o tres veces por la flama del mechero, hasta alcanzar una temperatura que sea soportable en el dorso de la mano. Es importante que la laminilla no se caliente demasiado pues podras calcinar a las bacterias modificando as sus caractersticas morfolgicas y tintoriales. Colocar el frotis en el puente de tincin y cubrirlo con el colorante seleccionado durante un minuto Lavar con chorro de agua suave y escurrir dejar secar al aire y observar al microscopio con todos los objetivos 10X, 40X y 100X
2. Elaboracin de frotis a partir de medio lquido - Marca en un extremo los portaobjetos limpios y desengrasados. - Sin poner agua, coloca con el asa estril dos o tres gotas del cultivo en el centro del portaobjetos y extindelas para formar una pelcula delgada y homognea. - Deja secar al aire los frotis - Fija los frotis al calor como se explico en el caso anterior.
- Colocar el frotis en el puente de tincin y cubrirlo con el colorante seleccionado durante un minuto - Lavar con chorro de agua suave y escurrir - Dejar secar al aire y observar al microscopio con todos los objetivos 10X, 40X y 100X - Realizar los dibujos correspondientes de cada una de las observaciones realizadas, indicando formas y agrupaciones.
ASIGNACIN
1.- Incluir en el reporte los esquemas de las preparaciones observadas con los objetivos 10x, 40x y100x de cada uno de los microorganismos.
2.- Investiga quien fue Roberto Koch y haz una resea de sus principales aportaciones a la microbiologa.
3.- Investiga la forma, y caractersticas generales de los microorganismos que observaste e incluye la referencia de las fuentes consultadas.
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PRCTICA 3
MORFOLOGA COLONIAL Y AISLAMIENTO POR ESTRA CRUZADA
INTRODUCCIN:
Adems del mtodo de las diluciones para aislar microorganismos, existen otros que son cualitativos, siendo el de la estra cruzada el ms comn. Este consiste en tomar directamente de la muestra que nos interesa, una pequea cantidad con ayuda del asa bacteriolgica que se deposita en la superficie del medio de cultivo slido; luego se hacen estras con movimientos sucesivos del asa hacia un lado y otro, a la vez que se recorre de una orilla hacia el centro de la placa. Este procedimiento es equivalente a las diluciones ya que cada vez que se va extendiendo el contenido microbiano a lo largo de la estra, llegar el momento en que an cuando se tenga en un principio una gran cantidad de organismos, se obtendrn colonias aisladas en algn punto a lo largo de la serie de estras. Un buen aislamiento en placa se dar cuando se obtengan colonias aisladas de microorganismos, con una distancia que nos permita distinguir y describir su morfologa colonial. La observacin cuidadosa de las colonias ha mostrado que las caractersticas morfolgicas suelen ser constantes el medio de cultivo usado y que stas varan en apariencia dependiendo del grupo microbiano. Esto ha permitido iniciar el reconocimiento de los principales grupos de microorganismos sin llegar a ser una identificacin definitiva.
Las caractersticas que se toman en cuenta para describir la morfologa colonial son las siguientes:
Tamao: medir el dimetro en milmetros Color: coloracin de la colonia y del medio de cultivo Forma: pueden ser puntiformes, circulares o irregulares Elevacin: pude ser plana, elevada, convexa, pulvinada, umbonada, umbilicada o crateriforme.
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Bordes: pueden ser enteros, lobulados, ramificados, filamentosos, dentados o irregulares. Superficie: puede ser lisa, rugosa o granular. Luz reflejada: puede ser brillante o mate Luz transmitida: puede ser opaca, transparente o translcida. Consistencia: puede ser dura o suave, esta ltima puede ser butirosa, mucoide o friable.
COMPETENCIA: Adquirir los conocimientos necesarios para diferenciar las formas coloniales bacterianas y desarrollar las habilidades para poder llevar acabo el aislamiento de bacterias por medio de la tcnica de estra cruzada.
MATERIAL: Cajas petri con medios de cultivo: 1. generales ( Agar Nutritivo)

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2. y diferenciales ( Agar Sal Manitol, Verde Brillante y TCBS ) Caldo tripticaseina de soya ( medio lquido en tubo ). Agar Nutritivo inclinado ( en tubo).
Cultivos bacteriolgicos varios 1. Bacillus, 2. Pseudomonas .- Escherichia coli, - Staphylococcus . - Klebsiella pneumoniae
Cultivos de levaduras: 1. Torula sp, - Sacharomyces.
Asa bacteriolgica Mechero de Bunsen Chispa Gradilla Puente para tincin
Portaobjetos Cubreobjetos Regla Bolsa de plstico transparente
MTODO
Descripcin de la morfologa colonial. 1. Escoger 2 medios de cultivo diferentes y seleccionar una colonia aislada . 2. Medir cada una de las colonias (usar regla) y expresarlo en mm. 3. Describir el color de cada colonia. 4. Describir la forma, borde, elevacin y superficie de acuerdo a la gua anexa. 5. Observar la luz reflejada y transmitida a contraluz, sin abrir la caja de Petri. 6. Apreciar la consistencia tocando la colonia con el asa previamente flameada y enfriada.
I. Procedimiento para la siembra en estra cruzada.
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NOTA IMPORTANTE
Sembrar y manipular los cultivos en un rea aproximada de 20 cm alrededor del mechero de Bunsen. No abrir la caja fuera de esta rea. No hablar mientras siembres y manipules los cultivos.
1. Flamear y enfriar el asa bacteriolgica. 2. Tomar una pequea porcin de una colonia aislada. 3. Tocar el agar suavemente y deslizar el asa sin rasgarlo a manera de zigzag. (Observar el esquema anexo en la parte marcada con el nmero 1. (primer cuadrante)). 4. Flamear al rojo el asa, enfriar y extender las ltimas lneas de siembra del primer cuadrante. (Observar el esquema anexo en la parte marcada con el No.2. (segundo cuadrante). 5. Repetir el mismo procedimiento segn se indica en el esquema, en el tercero y cuarto cuadrante. 6. Practica este procedimiento en las circunferencias anexas al final de esta prctica usando un lpiz.
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7. Identifica las cajas con los siguientes datos: Nmero de equipo. Horario de laboratorio Nombre del cultivo bacteriano. 8. Incubar las cajas hasta las 24 horas a 37 C. (El maestro indicar el rea a usar de la incubadora). 9. Describir la morfologa colonial de una colonia aislada de cada una de las cepas bacteriolgicas que se proporcionaron. 10. Introducir las cajas de Petri en una bolsa de plstico (solicitarla en el almacn) y colocarlas en el refrigerador con su respectiva identificacin.
II. Siembra en medios slidos en tubo con agar inclinado 1. Tomar una asada del cultivo a sembrar con el asa previamente esterilizada y enfriada 2. Abrir el tubo de agar cerca de la flama, sin soltar la tapadera 3. Introducir el asa con el cultivo hasta el fondo del tubo 4. Arrastrar el asa haciendo zigzag sobre la superficie del agar 5. Incubar los tubos durante 24 hrs a 37C (el maestro indicar el rea a usar de la incubadora) 6. Introducir los tubos en una bolsa de plstico y colocarlas en el refrigerador con su respectiva identificacin III. Siembra en medio lquido 1. Tomar una asada del cultivo a sembrar con el asa previamente esterilizada y enfriada 2. Abrir el tubo de agar cerca de la flama, sin soltar la tapadera 3. Introducir el asa con el cultivo hasta el fondo del tubo 4. Agitar el asa vigorosamente dentro del medio de cultivo 5. Incubar los tubos durante 24 hrs a 37C (el maestro indicar el rea a usar de la incubadora) 6. Introducir los tubos en una bolsa de plstico y colocarlas en el refrigerador con su respectiva identificacin
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ASIGNACIN
1. Investiga al menos otros 2 mtodos de aislamiento de cultivos bacterianos.
2. Compara el mtodo desarrollado en la practica con los mtodos que investigaste, seala adems las ventajas y desventajas de cada uno de ellos.
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PRCTICA 4
TINCIN DE GRAM
INTRODUCCIN
En 1884 un mdico dans, Hans Cristan Gram, desarroll y public un mtodo de tincin que lleva su nombre y que es de enorme utilidad en cualquier laboratorio de bacteriologa. La tcnica adems de revelar detalles referentes a la forma y agrupacin bacteriana, como cualquier otra tcnica de tincin, permite clasificar a las bacterias en dos grandes grupos Gram positivas y Gram negativas.
La diferenciacin de Gram se tiene en el color que adquieren las bacterias cuando se tratan con el colorante cristal violeta seguido por una solucin yodurada de potasio (lugol), como mordiente o mordente. Ciertas bacterias pierden la coloracin violeta rpidamente cuando se decoloran con alcohol etlico, en tanto que otras la pierden con ms lentitud. Despus de la decoloracin se usa un colorante de contraste que casi siempre es safranina. Las bacterias resistentes a la decoloracin conservan una tonalidad azul o morada clasificndose como Gram positivas. Las bacterias que no pueden retener la tincin con cristal violeta, toman la coloracin de contraste presentando una coloracin rosa o roja; a estas bacterias se les denomina Gram negativas. Es importante observar que la base de esta diferenciacin es ms bien la velocidad de decoloracin que una caracterstica absoluta de las bacterias, por lo que el procedimiento se debe realizar con mucho cuidado.
La afinidad tintorial mostrada por las bacterias Gram positivas y gram negativas, se debe a las diferencias en la estructura de la pared celular. Las bacterias Gram negativas tienen una capa delgada de peptidoglicano rodeada de una membrana externa construida de fosfolpidos y lipopolisacrido.
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La tincin de Gram es aplicada en forma universal como primer paso en la identificacin de las bacterias. Desafortunadamente existen algunos grupos bacterianos en los cuales la tincin de Gram no es de utilidad taxonmica, por ejemplo: las espiroquetas, micobacterias, clamidias, rickettsias y micoplasmas.
El mtodo de la tincin de gram ha sufrido varas modificaciones y algunas de stas son incluso mejores que el mtodo original. Los objetivos principales para modificar la tincin han sido: 1. Obtener un colorante primario ms estable que el original, ya que ste se deteriora
rpidamente
2.
Reducir el tiempo requerido para completar la tcnica.
COMPETENCIA: Los alumnos adquirirn los conocimientos necesarios para aplicar la tcnica de tincin de Gram en especies bacterianas conocidas y poder determinar si pertenecen al grupo Gram positivo o Gram negativo.
MATERIAL
Solucin de cristal violeta Solucin de lugol Solucin de alcohol-acetona Solucin de safranina Portaobjetos Asa bacteriolgica Mechero Bunsen Microscopio Aceite de inmersin Cepas de Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus y Escherichia coli. Puente para tincin
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MTODOS
1. Tincin de Gram
Haga frotis de cada bacteria y fjelos a la flama del mechero, tome en lquido.
cuenta
el
procedimiento a seguir si los hace a partir de medio slido o -
Cubra los frotis con la solucin de cristal violeta (colorante primario). Deje actuar esta mezcla por 1 minuto.
Escurra el exceso de colorante y lave con un chorro suave de agua. Sacuda la laminilla para evitar gotas gruesas de agua y aplique la solucin de lugol
(mordente). Deje actuar por 1 minuto. Escurra el exceso de lugol y lave con un chorro suave de agua. Sacuda la laminilla y aplique el alcohol-acetona (agente decolarante) durante 3 a 5 segundos. Corte el proceso de decoloracin lavando con agua. Sacuda el frotis y aplique safranina (colorante de contraste) y djelo actuar por 10 -
20 segundos. Lave por ltimo con un chorro de agua suave y deje secar el frotis al aire y use un
papel absorbente presionando ligeramente sin tallar. Observe al microscopio con el objetivo de inmersin.
INFORME
1.
Haga esquemas de las preparaciones realizadas con las cepas de referencia y anote Gram.
el
nombre de las bacterias, la forma, agrupacin y su reaccin de
2.
Haga esquemas de las preparaciones de las mezclas de bacterias teidas .
ASIGNACIN
1.
Explique cual es el paso crtico en la tincin de Gram.
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2.
Indique al menos dos factores que pueden alterar los resultados en la
tincin de Gram.
3.
Anote cinco gneros bacterianos de importancia veterinaria que sean Gram positivos y cinco Gram negativos.
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PRCTICA 5
TINCIN DE ZIEHL-NIELSEN
INTRODUCCIN:
Adems de la tincin de Gram, hay otra tincin diferencial empleada en bacteriologa que es la tincin de Ziehl-Nielsen o cidorresistente. Esta tincin se fundamenta en que la mayora de las bacterias son decoloradas por una mezcla de alcohol-cido siendo la excepcin las de los gneros Mycobacterium y Nocardia. Estos gneros bacterianos forman un grupo de microorganismos que se definen, con base en sus propiedades tintoriales, como bacilos cido alcohol resistentes (BAAR). Son relativamente impermeables a los colorantes bsicos, pero una vez teidos, retienen fuertemente el colorante y resisten la decoloracin con solventes orgnicos acidificados. La propiedad de ser cido-alcohol resistente est determinada por la composicin de la pared celular, la cual adems de la peptidoglicana, est constituida por un alto porcentaje de glicolpidos hidrofbicos (ceras), como el cido miclico en Mycobacterium y el cido nocrdico en el gnero Nocardia. La presencia de stas cepas hidrofbicas previenen la penetracin de soluciones acuosas, siendo la causa de que estos microorganismos no puedan ser teidos por los mtodos convencionales como la tcnica de Gram.
En la actualidad la tincin de Ziehl-Neelsen tiene gran importancia como una de las pruebas en el diagnstico de Mycobacterium tuberculosis agente causal de tuberculosis, enfermedad granulomatosa crnica tanto del hombre como de los animales y cuya incidencia ha aumentado recientemente.
Es importante mencionar que en el anlisis de un frotis de material clnico sospechosos de contener bacilos tuberculosos, el hallazgo de un solo bacilo cido alcohol resistente tiene valor diagnstico ya que en la mayora de los casos no son abundantes. Sin embargo la interpretacin
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del hallazgo debe hacerse con cautela y con base en la historia clnica y otras pruebas de laboratorio, debido a la existencia de especies saprofitas de Mycobacterium y que podran conducir a un diagnstico falso. Por otra parte, existen algunas especies de Corynebacterium y Nocardia que ocasionalmente pueden comportarse como bacterias cido-alcohol resistentes.
COMPETENCIA: Los alumnos adquirirn los conocimientos para llevar a cabo la tincin de ZiehlNielsen sobre clulas bacterianas conocidas para poner de manifiesto las diferencias entre las bacterias cido alcohol-resistentes y las que no lo son.
MATERIAL:
Solucin fucsina fenicada Solucin de alcohol cido Solucin de azul de metileno puente de coloracin Portaobjetos Mechero de Bunsen Microscopio Asa bacteriolgica Aceite de inmersin Cepas de Staphylococcus aureus, Bacillus y Klebsiella Montajes de Mycobacterium tuberculosis teidos con Zielh-Neelsen
MTODOS: 1. Tcnica de Ziehl-Neelsen. haga dos frotis con las cepas asignadas. Deje secar los frotis al aire y fjelos con calor. colocar papel filtro sobre el frotis Cubra los portaobjetos con fucsina fenicada.
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Caliente suavemente con la flama del mechero hasta la emisin de vapores y mantenga la emisin durante cinco minutos. El colorante no debe hervir ni secarse, por lo que puede continuar agregando colorante conforme sea necesario.
Dejar enfriar Escurra el exceso de colorante y retire suavemente el papel lave con un chorro de agua suave. Decolore exhaustivamente con alcohol cido, realizando dos decoloraciones de un minuto cada una
Lave con un chorro suave de agua. Cubra el frotis con azul de metileno y djelo actuar durante un minuto. Lave por ltimo con un chorro suave de agua y deje secar la preparacin. Observe los frotis con objetivo de inmersin. Describa la morfologa microscpica de las cepas a las que realiz la tincin y y al montaje de Mycobacterium tuberculosis y realice esquemas de cada uno de los frotis
Las bacterias cido alcohol resistentes (BAAR +) se tien de color rojo y las no cido-alcohol resistentes (BAAR -) de color azul.
INFORME:
1.-
Describa la morfologa microscpica de las cepas a las que realiz la tincin de ZiehlNielsen y haga esquemas de cada uno de los frotis
ASIGNACIN
1 Investigar Por que es necesario calentar el colorante primario en esta tcnica?
2. Investigar a que se debe la propiedad de algunas bacterias de ser cido-alcohol resistentes
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PRCTICA 6
TINCIONES SELECTIVAS
INTRODUCCIN
Muchas estructuras bacterianas se pueden observar en condiciones adecuadas, sobre todo cuando se aplican ciertas tcnicas de tincin. Aunque algunos constituyentes celulares son comunes en todas las clulas, otros solo los poseen ciertas especies. Las tinciones selectivas se utilizan para poner de manifiesto estructuras celulares o bien para obtener informacin acerca de sus componentes a travs de su reaccin con los colorantes. En general las tcnicas de tincin se basan en el hecho de que la estructura celular que se desea poner de manifiesto tiene mayor grado de afinidad por los colorantes utilizados, que el resto de la clula. As se puede teir o poner de manifiesto estructuras como la cpsula, pared celular, material gentico, fimbrias o pilis, flagelos, endoesporas e inclusiones citoplasmticas.
Los colorantes cidos, que no tien a la clula, son a veces tiles para revelar las capas superficiales con bajo ndice de refraccin, como la cpsula, que se encuentra sobre la pared celular envolviendo a las bacterias. La mayora de las cpsulas bacterianas estn compuestas por polisacridos mientras que otras son de naturaleza polipeptdica. La cpsula desempea un papel importante en la virulencia de algunas bacterias patgenas, ya que les confieren propiedades antifagocticas que interfieren con los mecanismos de defensa de los organismos infectados. Las cpsulas no pueden observarse en frotis teidos con las tcnicas usuales, porque son incapaces de retener el colorante y porque los procesos de fijacin al calor y el lavado las disuelven; por lo tanto, las tinciones negativas como la de rojo congo y la de tinta china o nigrosina donde no se tie la bacteria pero s su alrededor y no se usa el calor, ni sustancias qumicas fuertes, resultan ser la mejor opcin.
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Las esporas bacterianas o endoesporas son estructuras producidas durante el ciclo de vital de ciertos gneros, que presentan una gran resistencia a agentes fsicos y qumicos debido al nmero y estructura qumica de sus cubiertas. Por sta misma razn, las endoesporas son impermeables a los colorantes y en una tincin normal, se observan como estructuras altamente refringentes y sin teir. Sin embargo cuando se aplica calor a un frotis cubierto de verde malaquita como en el caso de la tcnica de Schaeffer y Fulton, se facilita la penetracin del colorante. El lavado y teido posterior con safranina como colorante de contraste, permite ver a las endoesporas de color verde dentro de clulas rojas.
COMPETENCIA: Los alumnos adquirirn y aplicaran los conocimientos para realizar algunas tcnicas de tincin selectivas y observar algunas endoesporas). estructuras bacterianas (cpsulas y
MATERIAL
Solucin de cristal violeta Solucin de lugol Solucin de alcohol-acetona Solucin de verde malaquita Solucin de safranina Solucin de rojo congo Solucin mordente de cpsula Papel filtro Agua destilada Portaobjetos Pinzas de diseccin sin dientes Puente de tincin Mechero de Bunsen Asa bacteriolgica Pizeta Microscopio
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Aceite de inmersin Cepas de Klebsiella pneumoniae, Bacillus sp y Staphylococcus aureus
MTODOS
I. Observacin de cpsula Tcnica del rojo congo 1. Coloque una pequea gota de rojo congo en el centro del portaobjetos. 2. Tome un poco de cultivo de Klebsiella pneumoniae y suspndala en la gota de rojo congo, extindala hasta formar una pelcula delgada. 3. Deje secar al aire y NO FIJE EL FROTIS AL CALOR. 4. Cubre el frotis con mordente de cpsula y djelo actuar por un minuto. 5. Lave el frotis con agua destilada y deje secar al aire. 6. Observe el portaobjetos con lente de inmersin. 7. Repita el mismo procedimiento con la cepa de Staphylococcus aureus. 8. Realice los esquemas de sus observaciones. 9. Al terminar la observacin, deseche la preparacin en un frasco con desinfectante.
La cpsula se observar como una zona clara o transparente alrededor de la bacteria, que se observa de color rojo en un campo color azul oscuro.
Estructura bacteriana. Tomado de www.alaquarium.com/bacterias

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II. Observacin de esporas. Tcnica de tincin de Gram. 1. Haga un frotis de la manera usual con Bacillus. 2. Tia el frotis por la tcnica de Gram. 3. Observe el frotis con lente de inmersin. 4. Repita el mismo procedimiento con el cultivo de K.pneumoniae. 5. Realice los esquemas de sus observaciones. 6. Al terminar la observacin, deseche la preparacin en un frasco con desinfectante.
0 bacterias Gram positivas se vern de color azul o morado, y las Las esporas se observaran como zonas claras sin teir. Las bacterias Gram negativas se vern de color rosa o rojo, observe la ausencia de las esporas.
Tcnica de Schaeffer y Fulton. 1. Haga un frotis de la manera usual con Bacillus. 2. Cubra el frotis con un papel filtro e imprgnelo con verde malaquita. 3. Caliente el frotis con el mechero hasta la emisin de vapores. 4. Mantenga la emisin por cinco minutos. Evite que el colorante hierva o se seque el frotis. 5. Deje enfriar y desprenda suavemente el papel filtro. 6. Lave el frotis exhaustivamente con un chorro de agua suave y sacdalo para eliminar el exceso de agua. 7. Cubra el frotis con safranina y djela actuar por un minuto. 8. Lave con un chorro de agua suave. 9. Secar al aire la preparacin o con ligera presin con toallas absorbentes. 10. Observe con lente de inmersin.
Las esporas se observarn de color verde y las bacterias de color rojo

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Fig.1: Esporas bacterianas. a) subterminales b y c) centrales d) terminales

Tomado de Johnson T. And Case C. Laboratory experiments in Microbiology. 3rd edition. Benjamin Cummings. 1992.
ASIGNACIN 1. Investigue cinco ejemplos de bacterias de importancia en veterinaria que tengan cpsula. 2. Investiga que compuestos qumicos pueden formar a las cpsulas. 3. Investigar tres ejemplos de bacterias de importancia en veterinaria que formen esporas. 4. Investigar cuales son las partes que forman a una espora bacteriana.
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PRCTICA 7
AISLAMIENTO DE HONGOS Y MORFOLOGA COLONIAL
INTRODUCCIN
Los hongos son organismos eucariticos unicelulares o filamentosos con paredes celulares compuestas de quitina y otros polisacridos, no fotosintticos, saprofitos o parsitos, quimiorganotrficos aerobios que se nutren por absorcin y se propagan por esporas producidas en condiciones normales de reproduccin sexual y asexual. Esta definicin tan vaga y amplia se hizo para abarcar todas las anomalas morfolgicas y fisiolgicas que ocurren entre los hongos.
La clasificacin de los hongos se basa en gran parte en las estructuras de reproduccin que incluyen la naturaleza del ciclo biolgico, las estructuras reproductoras y las esporas. Los principales grupos taxonmicos se basan en las esporas de reproduccin sexual. Aunque en un sentido sistemtico formal las levaduras no son diferentes del resto de los hongos, en la prctica es frecuente que stas se traten por separado de los hongos filamentosos tanto en los sistemas de clasificacin como de identificacin, ocurriendo lo mismo para otro tipo de hongos como son las setas. Algunos hongos presentan un comportamiento dimrfico, esto significa que pueden presentar una forma filamentosa y otra levaduriforme dependiendo del ciclo de vida, del hbitat en el que se encuentren o de las condiciones de cultivo.
Tradicionalmente los hongos se han separado en dos grandes grupos, los Mixomicetos y los Eumicetos. Los mixomicetos representan la lnea divisoria entre los protozoos y los hongos. Desde el punto de vista veterinario, los hongos tienen gran inters debido a que algunas especies
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causan enfermedades (micosis) y otras se desarrollan en el alimento para animales produciendo micotoxinas, que pueden provocar intoxicaciones alimenticias.
COMPETENCIA: Los alumnos adquirirn las habilidades para llevar a cabo el aislamiento de hongos, y realizar la diferenciacin de las estructuras que los forman mediante una descripcin morfolgica tanto macroscpica como microscpica
MATERIAL Cajas de petri con agar rosa de bengala Cajas petri con agar dextrosa Sabouraud Tubos de ensaye de 16 X 150 con 10 ml de formaldehdo al 10% Asa en ngulo recto Portaobjetos y cubreobjetos Puente de coloracin Solucin de lactofenol azul de algodn. Barniz de uas transparente Fenol al 3 %. Papel Kraft. Microscopio Cepas de Penicillium sp, Aspergillus sp y Sacharomyces cerevisae o Torula sp.
MTODOS
PRIMERA SESION Aislamiento de hongos
NOTA IMPORTANTE Coloca el cubre bocas de modo que proteja tu nariz y boca. Evita moverte de un lugar a otro para evitar el desplazamiento de las esporas. Coloca un tapete humedecido con fenol al 3 % en la superficie de la mesa donde vas a trabajar.
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1. Revisa antes de iniciar que hayas cumplido con las indicaciones de la NOTA IMPORTANTE. 2. Coloca sobre el papel humedecido los cultivos de hongos a sembrar, el mechero de bunsen y los medios de cultivo. 3. Esteriliza al fuego el asa doblada en ngulo recto (90 ) y toma un poquito del micelio areo. 4. Siembra el hongo por picadura en el centro de una placa de agar dextrosa Sabouraud. 5. Repite el mismo procedimiento con la placa de agar Rosa de Bengala. 6. Siembra el hongo levaduriforme ( Sacharomyces o Torula) estriando sobre la placa de agar.(como en la prctica3) 7. Sella las placas con cinta maskintape. 8. Incuba los medios de cultivo inoculados a temperatura ambiente durante 3 -4 das. 9. Revisa los medios de cultivo cada 24 a 48 hrs. 10. Anota los cambios de forma y color que se presentan.
Observacin de la morfologa microscpica. 1. Revisa antes de iniciar que hayas cumplido con las indicaciones de la NOTA IMPORTANTE. 2. Coloca sobre el papel humedecido los cultivos de hongos a sembrar, el mechero de bunsen y los medios de cultivo. 3. Marca con lpiz de cera los portaobjetos y coloca en el centro una gota de lactofenol azul de algodn. 4. Haz una suspensin con un poquito del micelio revolviendo exhaustivamente para separarlo. 5. Coloca un cubreobjeto. 6. Observa con objetivos 10X y 40X. 7. Realiza los dibujos de las estructuras que observes. 8. Compara tus dibujos con los esquemas anexos. 9. Repite el procedimiento para la levadura, pero tiendo con Gram
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SEGUNDA SESIN 1. Revisa antes de iniciar que hayas cumplido con las indicaciones de la NOTA IMPORTANTE. 2. Coloca sobre el papel humedecido los cultivos de hongos que sembraste en la primera sesin y el mechero de bunsen. 3. Describe la morfologa colonial de los hongos, intercambindolos entre los equipos. 4. Describe las siguientes caractersticas:
Tamao: Mide en cm, el dimetro de la colonia fungal. Aspecto: Observa la superficie del hongo, que puede ser; algodonoso, aterciopelado, grnulos o pulvurulento. Color del micelio areo: Observa los cambios de color y descrbelos partiendo del centro a la periferia. Color del micelio vegetativo: Observa el grueso del agar y describe el color del crecimiento fungal . Produccin y color del pigmento difusible: Nota algn cambio de color en el medio de cultivo original.
Registra las caractersticas de la morfologa colonial de los hongos observados. Tamao (cm)____________________________________________________ Aspecto_______________________________________________________________________ ___________________________________________________ Color del micelio areo______________________________________________ Color del micelio vegetativo__________________________________________ Produccin de pigmento difusible______________________________________
5. Realiza preparaciones en fresco de los dos hongos seleccionados. 6. Coloca un poco de micelio areo en un portaobjetos que contenga una gota de lactofenol azul de algodn. 7. Dispersa el micelio en el colorante. 8. Cubre la preparacin con un cubreobjetos.
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9. Observa la preparacin al microscopio usando objetivos seco dbil y seco fuerte. 10. Describe la morfologa microscpica considerando las siguientes caractersticas:
Dimetro del micelio: microsifonado o macrosifonado Tipo de micelio: Observa las hifas, si son septados o ramificadas. Hifas: pigmentadas o hialinas Tipo de esporas y estructuras reproductoras.
Fig.1. Ejemplos de estructuras reproductoras. Tomado de . Koneman. Color atlas and textbook of Diagnostic Microbiology. 5 ed. Lippincott Williams and Wilkins. 1997.
th
Fig.2. Tipos de Hifas. Tomado de Koneman. Color atlas and textbook of Diagnostic Microbiology. 5 ed. Lippincott Williams and Wilkins. 1997.
th
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Registra las caractersticas de la morfologa colonial de los hongos observados.
Tamao (cm)_____________________________________________________ Aspecto_______________________________________________________________________ ___________________________________________________ Color del micelio areo______________________________________________ Color del micelio vegetativo__________________________________________ Produccin de pigmento difusible______________________________________
ASIGNACIN 1. realice los esquemas de la morfologa colonial de los hongos que se observaron. 2. investigue sus caractersticas y estructuras microscpicas. 3. realice esquemas de sus estructuras microscpicas.
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PRCTICA 8
CULTIVO DE ANAEROBIOS
INTRODUCCIN
Un factor que influye de manera importante en el crecimiento microbiano es el oxgeno y aunque es un gas muy reactivo, muchos microorganismos dependen de la disponibilidad del oxgeno molecular como nutriente. Los microorganismos se pueden clasificar de acuerdo a sus necesidades y tolerancia al oxgeno en: aerobios estrictos, microaerofilicos, anaerobios facultativos, anaerobios estrictos y anaerobios aerotolerantes. Los aerobios estrictos dependen del oxgeno, ya que lo utilizan como aceptor final de electrones en la cadena respiratoria y no pueden llevar a cabo la fermentacin. Los microaerofilicos no requieren de oxgeno pero lo toleran a bajas concentraciones. Los anaerobios facultativos utilizan el oxgeno si est disponible, pero tambin pueden crecer en ausencia del mismo, ya que pueden realizar un metabolismo oxidativo o fermentativo dependiendo de las condiciones de cultivo. Los anaerobios estrictos no pueden utilizar el oxgeno ya que solo pueden efectuar un metabolismo fermentativo e incluso no crecen o mueren en presencia de oxgeno debido a que les resulta txico an a bajas concentraciones, mientras que los anaerobios aerotolerantes crecen a bajas o elevadas concentraciones de oxgeno aunque no lo utilicen en su metabolismo. An cuando la toxicidad del oxgeno se manifiesta claramente sobre los anaerobios, a concentraciones elevadas resulta txico incluso para los aerobios estrictos ya que el oxgeno es un agente oxidante fuerte, capaz de generar un grupo de radicales libres (singlete, superxido, perxido e hidrxilo), que reaccionan sobre molculas orgnicas. Los microorganismos que toleran el oxgeno, por lo general contienen enzimas que los protegen de la toxicidad como son la catalasa, peroxidasa y la superxido dismutasa.
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Mientras que la aereacin se emplea para incrementar el crecimiento de los microorganismos aerobios, el oxgeno debe ser excluido del medio de cultivo para permitir el crecimiento de los anaerobios estrictos. Esto se puede hacer agregando sustancias reductoras al medio de cultivo que reaccionan con el oxgeno molecular disuelto, eliminndolo. Por ejemplo, frecuentemente se aade tioglicolato de sodio, cistena u otros compuestos que contienen grupos sulfhidrilos. En los medios lquidos se suele burbujear nitrgeno, hidrgeno o bixido de carbono para desplazar al oxgeno y posteriormente se sella el recipiente para evitar que entre de nuevo el oxgeno. Adems, hay muchos modelos de cmaras de cultivo para anaerobios que se emplean para eliminar el oxgeno de la atmsfera. Estos modelos como el sistema GasPack, generan hidrgeno el cual reacciona con el oxgeno mediante un catalizador dentro de la campana produciendo agua; tambin se genera bixido de carbono para reemplazar el volumen de gas agotado por la conversin de oxgeno a agua. En todos estos mtodos es recomendable utilizar indicadores de oxido-reduccin como el azul de metileno y la resarzurina que permiten conocer las condiciones del sistema; en condiciones oxidadas los indicadores estn coloreados y en condiciones reducidas son incoloros. La cuantificacin del estado de oxidacin de un medio se expresa por la relacin del potencial de xido-reduccin (O/R). El potencial se puede medir utilizando electrodos y un potencimetro, cuando los valores son positivos significa que hay oxgeno disuelto en el medio y los compuestos orgnicos estn parcialmente oxidados, cuando son negativos significa que no hay oxgeno disuelto y los compuestos orgnicos estn reducidos.
COMPETENCIA: Los alumnos adquirirn los conocimientos y habilidades para poner en prctica algunas tcnicas para el aislamiento y cultivo de bacterias anaerobias.
MATERIAL
Tubos de 16 X 150 con 5 ml de agua destilada estril Tubos de 16 X 150 con tapn de rosca con caldo tioglicolato Tubos de 16 X 150 con tapn de rosca con caldo nutritivo Pipetas Pasteur estriles Cajas de petri con gelosa sangre Plastilina Muestra de material fecal animal Cepas de Clostridium sp, Bacillus subtilis y Escherichia coli
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MTODOS
PRIMERA SESION 1. Aislamiento de bacterias anaerobias de material fecal. Adicionar aproximadamente un gramo de muestra a un tubo con 5 ml de agua destilada
estril, agitar y dejar sedimentar durante 10 minutos. Tomar una asada del sobrenadante y sembrar por estra cruzada en una placa de gelosa
sangre. Agitar de nuevo el tubo y calentar la muestra a ebullicin por 10 minutos y dejar
sedimentar otros 10 minutos. Sembrar otra placa con gelosa sangre. Incubar la cajas en anaerobiosis a 37 C durante 40 horas.
2. Cultivo de bacterias anaerobias en medios lquidos. Inocular con ayuda de una pipeta Pasteur estril cada una de las cepas proporcionadas
en los tubos con caldo tioglicolato y caldo nutritivo. Incubar a 37 C durante 24 - 48 horas.
3. Cultivo de microorganismos anaerobios por comensalismo. Divide una caja de gelosa sangre en dos y en un lado siembra una asada de Clostridium
sp y del otro lado una asada de Bacillus subtilis. Sella con plastilina los bordes de la caja Incuba a 37 C durante 24 - 48 horas.
SEGUNDA SESION
1.
Describe la morfologa colonial de dos colonias aisladas a partir de la de Gram.
muestra
de
materia fecal y la morfologa microscpica utilizando la tincin
2.
Observa el crecimiento de las cepas bacterianas sembradas en los medios
lquidos
discute los resultados.

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3.
Observa el crecimiento de la bacteria anaerobia y de la aerobia y realice un tincin de Gram de cada uno. Haga esquemas.
frotis
ASIGNACION
Investiga al menos tres bacterias anaerobias de importancia en medicina veterinaria Investiga los patrones de crecimiento bacteriano en diferentes medios de cultivo de las
bacterias anaerobias
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PRCTICA 9 USO DE MEDIOS SELECTIVOS
INTRODUCCIN
Los requerimientos nutricionales de las bacterias son muy variados, lo cual hace necesario contar con una amplia gama de medios de cultivo. La seleccin de stos depende de la cantidad y variedad de microorganismos en la muestra a estudiar, del tipo de microorganismo que se prefiere aislar y los que se quiere eliminar para que su abundancia no los encubra o dificulte el aislamiento.
Basados en la utilidad diagnstica de los medios de cultivo, es posible hacer la siguiente clasificacin:
Medios simples.- Son medios que promueven el desarrollo de microorganismos nutricionalmente poco exigentes. Estos medios reciben tambin el nombre de medios bsicos o generales. Se utilizan principalmente para muestreos de medio ambiente o superficies, anlisis cuantitativos y conservacin de cepas.
Medios enriquecidos.- Son medios que han sido suplementados con nutrientes que proporcionan factores de crecimiento para promover el desarrollo de microorganismos de
requerimientos nutricionales exigentes. Estos medios contienen generalmente uno o ms de los siguientes ingredientes: sangre, suero, plasma lquido asctico, huevo carne vitaminas, aminocidos especficos, NAD o hemina, entre otros.
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Medios selectivos: Estos medios contienen sustancias inhibidoras para suprimir parcial o totalmente el desarrollo de microorganismos no deseados. Las sustancias utilizadas con mayor frecuencia son colorantes, sales inorgnicas, sales biliares, antibiticos y detergentes. Los medios selectivos tienen una gran utilidad para el aislamiento de grmenes patgenos a partir de muestras clnicas que contengan bacterias de la microflora normal.
Medios diferenciales.- Estos medios contienen indicadores que permiten diferenciar algunos gneros o especies bacterianas por el aspecto caracterstico de sus colonias. La mayora de los medios selectivos son tambin diferenciales. Ejemplos: Agar verde brillante, agar ENDO, agar eosina azul de metileno, agar Salmonella-Shigella, agar McConkey. Estos permiten diferenciar enterobacterias fermentadoras de lactosa (coliformes).
Medios de enriquecimiento.- Estos medios son lquidos y poseen efecto inhibitoria sobre ciertos gneros bacterianos, favoreciendo al mismo tiempo el desarrollo de otros que se encuentran en menor proporcin en la muestra. Son medios muy utilizados en la bacteriologa del tracto intestinal, principalmente para el enriquecimiento de Salmonella sp. a partir de muestras de heces en las cuales el nmero de salmonelas puede ser muy pequeo en comparacin al elevado nmero de bacterias que normalmente habitan el tracto intestinal. Estos medios se inoculan mediante un hisopo o bien depositando la muestra en el medio a una proporcin de 1:10, ejemplo, un gramo de muestra en 10 ml de medio, El perodo de incubacin de estos medios debe ser de 12-18 horas y es necesario resembrar a partir de ellos, en medios selectivos y diferenciales para identificar colonias caractersticas. Ejemplos de stos medios son el caldo selenito y el caldo tetrationato, medios de enriquecimiento para Salmonella sp.
Medios de transporte.- Son medios utilizados para el transporte de las muestras clnicas desde el lugar de su coleccin hasta el laboratorio. Su finalidad es preservar la viabilidad de los microorganismos cuyo aislamiento va a intentarse posteriormente. La composicin de este tipo de medios vara considerablemente de acuerdo al microorganismo cuya viabilidad se desea preservar. Estos medios pueden ser desde una simple solucin fisiolgica amortiguada, hasta medios ms complejos que contengan sustancias inhibidoras, agentes reductores, sustancias osmticamente activas (sacarosa), suero, etc. Algunos ejemplos de estos medios son: Medio de Stuart, medio de Carry-Blair, utilizados como medios de transporte de uso general para un gran nmero de bacterias aerobias y anaerobias. Medio Campy-thio y medio Clark-Dufty, diseados
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para preservar la viabilidad de Campylobacter sp. y la solucin amortiguadora de Bovarnyk, para preservar la viabilidad de Chlamidias y Riquettsias.
Medios especiales.- Son medios que no pueden ser fcilmente agrupados en alguno de los grupos de medios descritos anteriormente y la mayora son utilizados para comprobar una o ms caractersticas bioqumicas de los microorganismos.
COMPETENCIA: Los alumnos adquirirn las habilidades para poder identificar diferentes tipos de medios de cultivo y su utilidad en el aislamiento e identificacin de bacterias.
MATERIAL Caja petri con agar Mac Conkey Caja petri con agar eosina azul de metileno Caja petri con agar Staphylococcus Caja de petri con agar Sal y manitol Tubo de 13X100 con caldo glucosado Tubo de 13 X 100 con medio Stuart Tubo de 16 X150 con Caldo bilis verde brillante al 2%
Cepas de Escherichia coli, Salmonella cholerae suis, Proteus sp y Staphylococcus aureus, Bacillus sp.
MTODOS
1. Medios de cultivo selectivos

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1) Sembrar por estra cruzada la mezcla de bacterias (Gram + y -) proporcionada por el profesor en el Agar Sal y manitol y el Agar Verde brillante. 2) Sembrar por estra cruzada los cultivos puros antes mencionados en los medios de cultivo restantes, conforme lo indica la tabla anexa.
3) Identificar las cajas de petri y los tubos con el nombre del cultivo.
4) Formar un paquete con las cajas y los tubos sembrados para incubar a 37C durante 24-48 horas.
5) Observar el cambio de color que se da en los medios de cultivo, la morfologa colonial de los cultivos.
6) Interpretar los resultados.
INFORME
1)
Describa la morfologa colonial de las cepas proporcionadas y sembradas en los diferentes medios de cultivo.
2)
Indica los cambios de color que se aprecian en los medios de cultivo y a que se atribuyen.
3) 4)
Interprete y discuta los resultados. Complete las tablas anexas con sus observaciones.
ASIGNACIN:
1) Investiga la composicin qumica de los medios de cultivo lquidos y slidos que sembraste.
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2) Investiga y explica a que se atribuyen los cambios que observaste en los medios de cultivo conforme a la cepa bacteriana que sembraste en cada uno de ellos.
Medio de cultivo
Color del medio de cultivo
Indicador que contiene el medio
Tipo de medio de cultivo
Cepa bacteriana
Forma de siembra en el medio de cultivo
Caldo glucosado
E.coli Salmonella
Caldo bilis verde brillante Medio Stuart S.aureus E.coli
Mac Conkey Verde brillante Eosina Azul de metileno A.Estafilococ cus 110. Sal y manitol
Salmonella Mezcla de bacterias Proteus
S.aureus
Mezcla de bacterias
Agar nutritivo
Bacillus
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Medio cultivo
de Cepa bacteriana
Morfologa colonial Forma agrupacin
y Modificacin en el medio a las hrs de
bacteriana y 24 tincin Gram Caldo glucosado E.coli Salmonella
de cultivo
Caldo verde brillante
bilis E.coli
Medio Stuart
S.aureus
Mac Conkey Verde brillante
Salmonella Mezcl a de
bacter ias Eosina Azul Proteus
de metileno A.Estafilococ S.aureus cus 110.

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Sal y manitol Mezcla bacterias Agar nutritivo Bacillus
de
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INSTITUTO TECNOLOGICO DE SONORA
LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA Y MICOLOGIA VETERINARIA
PRACTICA 10
USO DE PRUEBAS BIOQUIMICAS
INTRODUCCION
La identificacin de una bacteria a partir de una muestra clnica exige su aislamiento en cultivo puro, de ah que es muy importante la tcnica d siembra y el uso de diferentes medios de cultivo. Sin embargo el crecimiento de las bacterias implica necesidades de ciertos nutrientes para llevar a cabo su metabolismo, el cual puede variar segn el tipo de bacteria de que se trate, de ah el uso de una gran variedad de pruebas bioqumicas que miden la presencia o ausencia d enzimas que participan en el catabolismo del sustrato que se aade al medio diferencial. Muchas de estas pruebas se leen mediante los cambios de color que se producen en los medios de cultivo por la presencia de indicadores de pH. As se usan medios diferenciales como por ejemplo: el caldo rojo de fenol, al cual se le adicionan carbohidratos (glucosa, trehalosa, maltosa, fructosa) para valorar la fermentacin de azucares mediante la observacin de burbujas de gas de hidrogeno o dixido de carbono atrapadas en un vial invertido y la acidificacin del medio original se har evidente por el viraje de color rojo original a amarillo. Existe una gran variedad de pruebas bioqumicas que auxilian al mdico clnico o al microbilogo en la identificacin del gnero y la especie del agente patgeno presente en una muestra clnica, esto es de gran importancia, pues con la correcta interpretacin de estos hallazgos podr confirmarse el diagnstico del agente causal de la enfermedad y con ello podrn adoptarse las medidas teraputicas y preventivas idneas segn el caso.
COMPETENCIA: Los alumnos adquirirn los conocimientos y habilidades para identificar, inocular e interpretar las diferentes pruebas bioqumicas utilizadas para la identificacin bacteriana.
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MATERIAL Tubos de 13x100 con medio SIM Tubos de 13x100 con citrato de Simmons Tubos de 13x100 con caldo glucosado Tubos de 13x100 con medio TSI Tubos de 13x100 con agar urea Portaobjetos Solucin de rojo de metilo Solucin de alfa-naftol Solucin de KOH creatina Solucin de KOH al 3% Reactivo de Kovac`s Cepas bacterianas de: E. coli, Salmonella sp, Klebsiella sp, Proteus sp, Streptococcus sp y Staphylococcus aureus
METODOS 1. Prueba para confirmacin de la tincin de Gram o de KOH al 3% Esta prueba consiste en colocar sobre un portaobjetos una gota de KOH al 3% y con el asa hacer una suspensin de la colonia de bacterias a probar Mezclar con movimientos giratorios de 1 a 3 minutos Separar el asa de la mezcla, si se forma una hebra o hilo viscoso, indica que se trata de bacterias Gram negativas, si esto no sucede, se tratar de bacterias Gram positivas Realiza esta prueba con diferentes cultivos Gram + y
2. Pruebas bioqumicas para bacterias Gram negativas Medio TSI Sembrar por picadura y estra en la superficie de los tubos de TSI cada una de las cepas proporcionadas Incubar los tubos a 37C durante 24 horas Observar e interpretar los resultados como sigue: a) fermentacin de glucosa: color amarillo en el fondo del tubo
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b) fermentacin de lactosa: color amarillo en la superficie del medio c) Produccin de gas: burbujas en el fondo del tubo Produccin de cido sulfhdrico: precipitado de color negro en el fondo del tubo prueba de rojo de metilo y Vogues-Proskauer Sembrar en dos tubos de caldo glucosado o medio RM-VP las cepas proporcionadas Incubar a 37C durante 24-48 hrs Observar e interpretar los resultados como sigue: a) Prueba de rojo de metilo: Aada al tubo 5 gotas del reactivo rojo de metilo y sin agitar observe la presencia de un anillo de color rojo en la superficie del medio; la prueba ser negativa cuando no exista el color rojo b) Prueba de Vogues-Proskauer: Aada al tubo 6 gotas de alfa-naftol y dos gotas de KOH creatina, agitar suavemente y dejar reposar el tubo de 10 a 15 min. La prueba positiva ser la aparicin de color rojo en la superficie del tubo y en la negativa no hay coloracin roja
Utilizacin de citrato Sembrar un tubo de citrato de Simmons por estra en la superficie, para cada cepa proporcionada Incubar los tubos a 37C durante 24-48 hrs. Observar e interpretar el resultado como sigue: El crecimiento y vire del indicador de verde a azul, significan que el microorganismo dio la prueba a la utilizacin del citrato.
Medio SIM Sembrar por picadura utilizando el asa recta, un tubo con medio SIM para cada cepa proporcionada Incubar los tubos a 37C durante 24-48 hrs Observe e interprete los resultados como sigue: a) Produccin de cido sulfhdrico: precipitado de color negro b) Movilidad: positivo si hay turbiedad, e inmvil si solo hay crecimiento en la picadura c) Produccin de indol: Aada 5 gotas de reactivo de Kovacs, la coloracin roja indica que la prueba es positiva.
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Produccin de ureasa Siembre el agar inclinado una asada de cultivo abundante sobre la superficie Incube a 37C de 1 a 7 das La reaccin positiva se observa al virar el medio a un color rosa intenso Si no hay cambios en el medio de cultivo, es negativo
3 Pruebas bioqumicas para bacterias Gram positivas
3.1 prueba de catalasa: Esta prueba es muy til para la diferenciacin de los estreptococos de los estafilococos y micrococos - Sobre un portaobjetos colocar una gota de perxido de hidrgeno al 3%, y con el asa tomar una de las colonias - Mezclar la colonia con la gota con movimientos giratorios - La lectura se hace inmediatamente, si aparece un burbujeo la prueba es positiva
NOTA: Pueden presentarse falsos positivos si la colonia se toma de un medio adicionado con sangre
3.2 Prueba de coagulasa - Tomar con el asa aproximadamente 5 colonias del medio de Baird Parker e introducirlas en el vial que contiene el plasma hidratado e incubar a 37C de 1 a 3 hrs - Evitar agitar el tubo para observar la formacin del coagulo, se considera la prueba positiva si el contenido del tubo en ms de tres cuartas partes presenta la formacin de un coagulo compacto
INFORME Haga una tabla donde coloque los resultados de las pruebas bioqumicas de las cepas utilizadas en la prctica
ASIGNACION Investiga las reacciones bioqumicas de las cepas bacterianas que utilizaste en la prctica.
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PRCTICA 11
PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A ANTIMICROBIANOS
INTRODUCCIN
La observacin del afecto inhibidor de algunos microorganismos sobre otros data desde 1874. Pasteur y otros investigadores observaron que infectando a un animal con Pseudomonas aeruginosa, lo protega contra Bacillus anthrasis.
Posteriormente se us el trmino antibiosis para explicar el efecto de inhibicin sobre otros microorganismos y el trmino de antibitico para la sustancia que causa tal efecto. Este fenmeno puede apreciarse al realizar pruebas de sensibilidad a antimicrobianos. Las pruebas de uso ms comn y comercial son las de difusin en agar, en las que se aplica una fuente de antibitico a una superficie de medio slido: el agente difunde a travs del medio inhibiendo el crecimiento del microorganismo sensible. Sin embargo, en la actualidad se conocen varios
factores que pueden influir en el tamao de la zona de inhibicin. Ejemplo: 1) Los componentes del medio de cultivo: Ingredientes como la peptona, triptona y extracto de levadura, pueden variar en su contenido mineral, y minerales como el calcio, magnesio y el hierro, disminuyen la actividad de los aminoglucsidos y aumentan el efecto del cido fusdico. Otro ejemplo es el efecto de los carbohidratos sobre la ampicilina y la furantona. 2) Efecto del pH: La actividad de los aminoglucsidos se ve aumentada en medio alcalino; as como la presencia de dixido de carbono en la estufa y carbohidratos fermentables en los medios de cultivo, pueden inducir condiciones cidas.
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3) Tamao del inculo: Se ha observado que las siembras densas disminuyen en algn grado las zonas de inhibicin, por lo que los cultivos en caldo y las suspensiones en medio slido se pueden diluir para obtener el inculo idneo.
Las pruebas de susceptibilidad bacteriana por el mtodo de difusin en agar, son pruebas cualitativas en las que se utilizan discos de papel filtro impregnado con concentraciones conocidas de los diferentes agentes quimioteraputicos (sensidiscos). Estos discos se colocan sobre la superficie del agar previamente sembrado con la cepa problema. Despus de la incubacin, se observan zonas o halos de inhibicin del desarrollo bacteriano alrededor de los discos con los quimioteraputicos, a los cuales el microorganismo es susceptible. Por el contrario, si la cepa bacteriana es resistente, se presenta crecimiento alrededor del disco.
El uso indiscriminado de los antimicrobianos ha originado la seleccin de cepas bacterianas multiresistentes, por lo que resulta difcil predecir la susceptibilidad con base a la experiencia clnica. Muchas cepas de microorganismos tradicionalmente sensibles a ciertos antibiticos son ahora resistentes, debido principalmente a la amplia distribucin de plsmidos de resistencia mltiple.
COMPETENCIA: Los alumnos adquirirn los conocimientos y habilidades para realizar e interpretar las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos por difusin en agar
MATERIAL Colorantes para tincin de Gram. 2 portaobjetos. Cajas petri con agar Mueller-Hinton Hisopos estriles Discos de papel filtro impregnados con quimioteraputicos Frascos de alcohol Pinzas y gradilla Mechero Bunsen 2 tubos con Solucin salina fisiolgica Tubo 0.5 de la serie de Mac Farland.
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Cepas crecidas de Escherichia coli y Staphylococcus aureus
MTODOS Realice una tincin de Gram de una colonia caracterstica de E.coli y S. aureus.
PREPARACIN DE INOCULO: Tome varias colonias (2-3) caractersticas de E .coli y suspndalas en una tubo con sol. Salina fisiolgica homogenizando con movimientos suaves para evitar derrames. Compare la turbidez de esta suspensin con la turbidez del tubo 0.5 de Mac. Farland. Ajuste la turbidez si es necesario adicionando una colonia ms. Repita este mismo procedimiento con la cepa de S.aureus.
INOCULACIN DE LAS PLACA DE MUELLER HINTON:
Humedezca un hisopo en la suspensin de la cepa de E. coli y exprima el exceso en las paredes del tubo.
Inocule una placa de agar Mueller-Hinton sembrando en toda la superficie del agar con el hisopo y permita que la placa seque de 3 a 5 minutos.
Coloque los sensidiscos sobre la superficie del agar ayudndose con la pinza previamente flameada en alcohol y presinalos ligeramente para poner en contacto el antibitico con la cepa.
Repita el procedimiento anterior, con la cepa de Staphylococcus aureus. Incube las placas a 37C durante 24 horas Mida (en mm) el dimetro de inhibicin del crecimiento producido por cada antibitico y anote los resultados.
INFORME
1.
Anote el resultado de la actividad de los antibiticos en placa sobre E. coli y S. aureus.
ANTIBITICO Nombre / abreviatura
E. coli
S.aureus
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Medida en mm del halo Medida en mm del halo
2.
Mencione aquellos antibiticos con mejores resultados de inhibicin para cada cepa
bacteriana y si se trata del mismo antibitico o no. Explique porqu.
ASIGNACIN: Investigar acerca de las consecuencias del uso irracional de los antimicrobianos en los animales en produccin y elabora un ensayo. (incluye las copias de la fuente de informacin).
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LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA Y MICOLOGIA VETERINARIA
PRCTICA 12
COLECCIN Y ENVIO DE MUESTRAS AL LABORATORIO
INTRODUCCION
La bacteriologa y micologa clnicas se encargan del estudio de las muestras de pacientes de los cuales se sospecha una enfermedad infecciosa. El laboratorio de bacteriologa y micologa veterinaria puede apoyar al mdico veterinario de la siguiente manera: Confirma el diagnstico presuntivo Sugiere la quimioterapia de la enfermedad Colabora en el conocimiento epidemiolgico de las enfermedades Permite la elaboracin de productos biolgicos como las bacterinas
Los resultados del examen bacteriolgico y micolgico, as como la rapidez con que stos sean obtenidos, no dependen solo de los mtodos de laboratorio empleados, sino tambin de la forma en que sean colectadas y envidas las muestras clnicas. Dichos resultados pueden verse influenciados por la presencia de microorganismos que son parte de la flora microbiana normal, por la migracin bacteriana post-mortem o por la aplicacin de antimicrobianos antes del envo de la muestra. El mdico debe tener en mente estos factores para realizar la interpretacin de los resultados obtenidos por el laboratorio.
Los problemas que con mayor frecuencia se presentan en la identificacin bacteriana y micolgica en el laboratorio son: Envo de muestras no representativas de la enfermedad en cuestin Toma de muestras sin asepsia Envo de muestras en condiciones inadecuadas Falta de historia clnica completa y de un diagnstico presuntivo
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Por lo tanto, es indispensable tener conocimientos previos sobre la correcta obtencin y envo de muestras al laboratorio. A continuacin se enlistan algunas normas generales: 1. Tomar la muestra del sitio anatmico ms representativo del problema, de preferencia en la etapa aguda de la enfermedad. 2. Las muestras obtenidas a partir de animales muertos debern tomarse dentro de las tres primeras horas de ocurrida la muerte o sacrificio. 3. Las muestras deben colectarse bajo estrictas condiciones de asepsia. Tanto el material de coleccin como el recipiente en que la muestra sea transportada debern ser estriles. Este ltimo preferentemente debe tener un tapn de rosca. 4. Los especimenes colectados no deben entrar en contacto con desinfectantes 5. Las muestras deben identificarse con los siguientes datos: especie, raza, edad, sexo, arete o nombre del animal, as como la direccin, telfono y nombre del propietario 6. Una vez colectadas las muestras deben enviarse al laboratorio dentro de las siguientes 424 hrs, en hielo o congelantes, en cajas de poliuretano 7. Cuando sea necesario el uso de hisopos para la coleccin de muestras, estas deben enviarse en medio de transporte (Stuart, Cary-Blair, etc) 8. Debe de anexarse la historia clnica completa que incluya: La hora de coleccin de la muestra, hora de la muerte del animal (si es el caso), nmero de animales infectados, signos y lesiones que presenta el animal; adems si el animal del que proviene la muestra fue tratado con antimicrobianos (cual) y el diagnstico presuntivo. 9. Es muy importante hacer notar que el manejo de las muestras debe realizarse con precaucin, ya que algunos agentes causantes de las enfermedades infecciosas de los animales, constituyen un riesgo para la salud humana.
COMPETENCIA: Los alumnos desarrollaran las habilidades necesarias para seleccionar los procedimientos ms adecuados de la toma y envo de muestras para su envo al laboratorio de diagnstico bacteriolgico.
MATERIAL Tubos con medio de transporte Stuart Hisopos estriles

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Frascos estriles Jeringas desechables estriles Bolsas de plstico estriles
METODOS 1. Asignar a cada equipo el tipo de muestra que deber traer, de que forma la podr colectar y la forma de transportacin al laboratorio. Es indispensable que provenga de un animal enfermo.
Muestra 1: Pus,
abscesos, exudado de heridas, hisopos nasales, hisopos auditivos,
exudados farngeos, segn lo asignado por el maestro
Muestra 2: Orina o heces de cerdo, bovino o equino segn lo asignado por el maestro
Muestra 3: rganos afectados con lesiones visibles de la especie animal asignada por el maestro.
INFORME 1. Anexe la historia clnica de la muestra en cuestin en el reporte. 2. Describa detalladamente los pasos seguidos para la toma y envo de la muestra que obtuvo para la prctica de anlisis bacteriolgico de productos biolgicos.
ASIGNACIN Entregar una secuencia fotogrfica numerada de los pasos de la toma de muestra, con la descripcin del procedimiento en cada imagen. La asignacin se entregar en un disco (por equipo).
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS: 1.
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PRCTICA 13
ANLISIS BACTERIOLGICO DE PROCESOS PIOGNICOS
INTRODUCCIN
El estudio de la microflora normal o patgena de los animales o humanos, requiere de conocimientos previos sobre toma y envo de muestras al laboratorio, tipos de medios de
transporte y de aislamiento de microorganismos, as como de antecedentes propios de los microorganismos que se deben estudiar. Para esta prctica se han seleccionado algunos productos biolgicos a estudiar y se hace referencia a los posibles microorganismos involucrados en procesos infecciosos.
Procesos piognicos: Son aquellas infecciones asociadas a microorganismos que estimulan la formacin de pus, que se forma po la acumulacin de leucocitos y restos del microorganismo. Dentro de los procesos infecciosos quedan incluidos los abscesos que son una forma de inflamacin localizada y llena de pus, la mayora estn rodeadas de tejido conectivo, capilares proliferantes y leucocitos. Las manifestaciones clnicas asociadas a la presencia de abscesos dependen de su localizacin y etiologa. Hay abscesos que no son detectados, sino hasta el momento de la necropsia, por ejemplo: abscesos hepticos, cervicales, etc. Mientras que otros producen un malestar generalizado en el animal, como los abscesos en la cavidad oral, pulmn, etc.
La etiologa de los procesos piognicos puede ser muy variada, sin embargo, la ms comn es la bacteriana. Entre los microorganismos piognicos ms comunes se encuentran:
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Aerobios y facultativos Staphylococus aureus Streptococcus spp. Corynebacterium spp. Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli Proteus spp. Pasteurella multocida
Anaerobios Actinomyces spp. Fusobacterium necrophorum Clostridium perfringens Peptococcus spp. Peptostreptococcus spp. Propionibacterium spp. Bacteroides spp. Eubacterium spp
COMPETENCIA: El alumno enviara correctamente una muestra de un proceso piognico, para su estudio y seleccionar los materiales necesarios para el aislamiento e identificacin de un posible agente patgeno.
MATERIAL
Hisopos estriles Microscopio Asa bacteriolgica Mechero de bunsen Puente de tincin Portaobjetos Encendedor de piedra Agua destilada Perxido de hidrgeno al 3% Hidrxido de potasio al 3% Colorantes para t. De Gram Sensidiscos para Gram + y Agar Mueller Hinton Pinzas para flamear
Placas con agar sal manitol Placas con agar sangre Pruebas bioqumicas para Gram (-) Agar TSI o Kliger Agar urea de Christensen Agar citrato de Simons Medio SIM Prueba de oxidasa Reactivo de Kovacs Reactivo de rojo de metilo Pruebas bioqumicas para Gram (+) Caldo sangre Caldo urea o agar urea de Christensen Cloruro de sodio al 6.5%
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Alcohol al 70% Frascos de vidrio
Carbohidratos, etc.
Metodologa para procesos piognicos:
Primera sesin Con un hisopo estril toma la muestra y depostala en el primer cuadrante de cada una de las placas de agar sangre y agar sal y manitol. Con el asa bacteriolgica, completa la siembra aislando por estra cruzada e placas a 37 C durante 24 - 48 horas. incuba las
Segunda sesin Describe en cada placa, la morfologa colonial de aquellas que sospeches sean causantes del proceso infeccioso. NOTA: Considera a las colonias predominantes de un solo tipo.
Realiza un frotis de cada colonia y telos por Gram. Si son bacterias gram negativas, siembra las pruebas bioqumicas e incbalas por 24 hrs a 37 C, si no hay cambios espera hasta 72 hrs. Realiza un antibiograma. Si son bacterias gram positivas realiza las pruebas bioqumicas e incbalas por 24 hrs a 37 C, si no hay cambios espera hasta 72 hrs. Realiza un antibiograma.
Tercera sesin Interpreta junto con el profesor los resultados de las pruebas bioqumicas y del antibiograma para identificar al microorganismo antimicrobianos. aislado y su sensibilidad a los
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ASIGNACIN 1. Investiga en fuentes de informacin confiables, las caractersticas morfolgicas de las bacterias identificadas 2. Investiga la enfermedad que la bacteria identificada produce, incluyendo la descripcin de la enfermedad, especies afectadas, modo de transmisin y tratamiento. 3. Incluye al menos dos referencias bibliogrficas consultadas.
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LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA Y MICOLOGIA VETERINARIAS
PRCTICA 14
ANLISIS BACTERIOLGICO DE HECES Y ORINA
Muestras de orina: Las infecciones urinarias se diagnostican frecuentemente en los perros. Estas se presentan tambin en otras especies, pero por lo general no se envan muestras al laboratorio de estos animales. Algunos de los microorganismos que causan infecciones en los perros, pueden producirlas tambin en otras especies de animales domsticos. Ejemplos:
Perro
Bovinos
Porcinos
Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Enterococcus Escherichia coli Enterobacter spp. Streptococcus pyogenes Streptococcus viridans Corynebaterium renale
Corynebacterium renale
Eubacterium suis C.renale
Las infecciones urinarias causadas por bacterias del gnero Leptospira, son por lo general enfermedades primarias de los animales, que en ocasiones pueden transmitirse al hombre. Algunas especies o serotipos importantes son:
Leptospira icterohemorragiae L. canicola
Rata, ratones Perros, bovinos, porcinos, zorrillos, chacales.
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L. pomona
Bovinos, porcinos, zorrillos, mapaches, gato montes.
L. grippotyphosa
Mapache, ratn, zorro, ardilla,, conejo
L. hardjo
Bovinos.
El hombre puede adquirir la enfermedad a partir de animales infectados y aguas contaminadas. Los veterinarios y empleados del rastro se encuentran sujetos a mayor riesgo de adquirir la infeccin.
Para obtener muestras de orina se recomienda tomar en cuenta varias condiciones de bioseguridad como son el uso de bata abotonada, guantes, lentes y cubrebocas. Se puede realizar la puncin de vejiga, la cateterizacin de la uretra o durante la miccin. Para la obtencin de las muestras del tracto reproductor se pueden usar hisopos estriles para el tero, cuello o vagina y de semen en caso de machos, envindolas en un medio lquido, o en un medio de transporte. Las muestras de orina y de semen deben conservarse en refrigeracin.
Muestras de heces: Cuando existe una infeccin bacteriana del intestino, una de las primeras manifestaciones clnicas es la diarrea y ocasionalmente otros signos como deshidratacin, dolor abdominal, septicemia, toxemia y fiebre dependiendo del agente etiolgico, adems de la edad; la especie del animal y la resistencia individual. De acuerdo con la presentacin en el animal, la enteritis puede ser aguda o crnica. En la enteritis aguda la diarrea se presenta sbitamente, las heces son blandas y liquidas con olor desagradable y en algunos casos con moco o sangre abundante. La coloracin es variable dependiendo del agente etiolgico. A este tipo de diarreas se asocian las siguientes bacterias:
Escherichia coli Serratia spp. Clostridium spp. Actinobacillus spp.
Salmonella spp. Serpulina hyodisenteriae Candida spp. Campylobacter spp.
En la enteritis crnica la diarrea se caracteriza por ser de consistencia blanda, con o sin presencia de moco y por lo general su olor es normal. La prdida progresiva de peso y la emaciacin son
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frecuentes y generalmente no hay anormalidades sistmicas. A estas diarreas se asocian las siguientes bacterias:
Mycobacterium paratuberculosis Pseudomonas Salmonella spp.
Proteus spp. Candida spp.
El diagnstico de los problemas entricos incluye el anlisis por parte del mdico veterinario de los cambios patolgicos funcionales en los animales, as como problemas de higiene en el manejo de excretas, agua y alimentos como posibles fuentes de contaminacin, y del anlisis bacteriolgico para determinar el agente infeccioso involucrado, con el fin de establecer un control epidemiolgico y evitar prdidas econmicas.
COMPETENCIA: El alumno colectara correctamente una muestra y la transportara al laboratorio, es indispensable que provenga de un animal enfermo.
La muestra de orina debe ser turbia o sanguinolenta, las heces deben ser diarreicas., de un animal enfermo para su estudio, y habr seleccionado el material necesario y llevado a cabo el aislamiento e identificacin de un posible agente patgeno as como su prueba de sensibilidad a antimicrobianos.
MATERIAL
Hisopos estriles Microscopio Asa bacteriolgica Mechero de bunsen
placas con agar verde brillante Placas con agar MacConkey Placas con agar sangre Placas con agar Mueller-Hinton Tubos con caldo lactosado
Puente de tincin
Tubos con caldo selenito

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Portaobjetos Encendedor de piedra
Pruebas bioqumicas para Gram (-) Agar TSI o Kliger Agar urea de Christensen
Agua destilada Prueba de oxidasa Perxido de hidrgeno al 3% Hidrxido de potasio al 3% Colorantes para t. De Gram Sensidiscos para Gram + y Frascos de vidrio Pinzas para flamear Alcohol al 70%
Agar citrato de Simons Medio SIM Reactivo de Kovacs Reactivo de rojo de metilo Pruebas bioqumicas para Gram (+) Caldo sangre Caldo urea o agar urea de Christensen Cloruro de sodio al 6.5% Carbohidratos, etc.
Muestras de orina
* Primera sesin - Usando una pipeta Pasteur estril, inocula aproximadamente 1 ml de orina en un tubo con caldo lactosado e incuba a 37 C durante 18 - 24 horas. Del crecimiento obtenido, siembra una placa con agar verde brillante. - Siembra con el asa 2 o 3 gotas de orina en una placa de agar sangre y asla por estra cruzada. Incuba la placa a 37 C por 24 - 48 horas.
* Segunda sesin - Describe la morfologa colonial de al menos una colonia de las aisladas en las placas de agar sangre y verde brillante, haga los frotis respectivos y telos por la tcnica de Gram para describir la morfologa microscpica. - Los aislamientos que resultaron simbrelos en los tubos para las pruebas bioqumicas correspondientes.
* Tercera sesin
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- Lee los resultados de las pruebas bioqumicas y junto con apoyo del maestro identifica a nivel de gnero tus aislamientos. - De las bacterias identificadas, selecciona una e inocula una placa de agar para realizar un antibiograma. Interpreta tus resultados a las 24 hrs.
3. Muestras de heces * Primera sesin - Siembra una asada de la muestra en la placa de agar Mac Conkey y asla por estra cruzada. Incuba la placa a 37 C durante 24 - 48 horas. - Inocula aproximadamente 0.5 g de la muestra en el tubo con caldo selenito. - Incuba a 37C durante 18-24 horas y subcultiva en el medio de verde brillante sembrando por estra cruzada e incuba a 37 C durante 24 horas.
* Segunda sesin - Describe el crecimiento microbiano en ambos medios de cultivo, selecciona una colonia de cada placa y anota las caractersticas de la morfologa microscpica de las colonias sembradas. Realiza un frotis y tilo con Gram, correspondientes. siembra las pruebas bioqumicas
* Tercera sesin - Lee los resultados de las pruebas bioqumicas y con apoyo del maestro, identifica a nivel gnero tus aislamientos. - De las bacterias identificadas, selecciona una y siembra una placa de agar para realizar el antibiograma. - Interpreta tus resultados a las 24 hrs.
ASIGNACIN 4. Investiga las caractersticas morfolgicas de las bacterias identificadas 5. Investiga la enfermedad que la bacteria identificada produce, incluye la descripcin de la enfermedad, especies animales afectadas, modo de transmisin y tratamiento.
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LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA Y MICOLOGIA VETERINARIAS
PRCTICA 15
ANLISIS BACTERIOLGICO DE ORGANOS
El anlisis bacteriolgico de rganos est recomendado cuando se sospecha de muertes por septicemia o por el hallazgo de lesiones macroscpicas en uno o varios rganos especficamente relacionados con alguna enfermedad. Ejemplo: en las neumonas (pulmn), enteritis (intestino), abortos (rganos fetales), encefalitis (cerebro), etc. La eleccin de las muestras depender de la experiencia del clnico, del diagnstico presuntivo y de los hallazgos a la necropsia.
El anlisis bacteriolgico y micolgico constituye en estos casos un apoyo en el diagnstico definitivo. Los siguientes son algunos ejemplos de microorganismos tpicamente asociados a septicemias:
Brucella spp Haemophilus spp. Clostridium spp. Campylobacter spp. Criptococcus spp. Blastomyces spp.
Erysipelothix spp. Pasteurella spp. Pseudomonas spp. Salmonella spp. Leccidioides spp.
Leptospira spp. Bacillus anthracis Listeria monocytogenes Escherichia coli Histoplasma spp
COMPETENCIA:
El alumno enviar una muestra de rganos afectados correctamente al
laboratorio, y llevar a cabo la identificacin del agente bacteriano, as como la prueba de sensibilidad a antimicrobianos.
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MATERIAL
Placas con agar sangre Placas con agar verde brillante Tubos con TSI Tubos con caldo glucosado Tubos con citrato de Simmons Tubos con caldo selenito Equipo de tincin de Gram Asa bacteriolgica Microscopio Muestra de rganos
Placas con agar sal y manitol Placas con agar Mac Conkey Tubos con caldo glucosado para VP Tubos con SIM Tubos con medio de transporte Stuart Tubos con caldo tioglicolato Mechero de Bunsen Hisopos estriles Pinzas y tijeras de diseccin
MTODOS
En esta prctica se analizarn las muestras asignadas a cada equipo en la prctica anterior, mismas que debern haber tomado y transportado correctamente al laboratorio.
4. Muestras de rganos * Primera sesin - Deposita la muestra sobre un papel limpio y esteriliza la superficie utilizando cualquiera de los siguientes mtodos: a) Con pinzas esteriles toma el fragmento de rgano y humedecelo con alcohol, flamalo rpidamente y depostalo en una caja estril. b) Calienta la esptula en el mechero de Bunsen y quemar la superficie del rgano. c) En el caso de rganos muy pequeos, se recomienda introducir la muestra en un recipiente con agua hirviendo durante 2 o 3 segundos. - Con instrumental estril (previamente flameado), corta un trozo de la muestra a travs de la superficie que fue previamente descontaminada.
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- Con pinzas estriles toma el trozo de tejido por la parte externa y frota con la cara interna el primer cuadrante de la caja con agar sangre, y con el tcnica de aislamiento por estra cruzada. - Introduce el trozo de la muestra en el caldo tioglicolato, asegrate de que llegue al fondo del tubo para lo cual puedes auxiliarte con el asa estril. Sella el tubo con aceite mineral. - Incuba los medios de cultivo a 37 C durante 24 - 48 horas. asa bacteriolgica completa la
* Segunda sesin - Describe la morfologa de al menos una colonia aislada en la placa con agar sangre, realiza un frotis y telo por la tcnica de Gram para describir su morfologa microscpica. telo por caldo
- A partir del crecimiento en el tubo con caldo tioglicolato, realiza un frotis y Gram para describir la morfologa microscpica. Segn el desarrollo tioglicolato, determina los requerimientos de oxgeno de las bacterias en
problema.
- De los aislamiento obtenidos siembra en los tubos para pruebas bioqumicas.
* Tercera sesin - Lee los resultados de las pruebas bioqumicas y junto con el profesor trata de identificar a nivel de gnero los aislamientos. -Realiza el antibiograma de las bacterias identificadas, y lee los resultados a las 24 hrs
INFORME
Realiza tu informe anotando cada uno de los pasos que seguiste desde la obtencin de la muestra hasta los resultados.
ASIGNACIN 6. Investiga las caractersticas morfolgicas de las bacterias identificadas 7. Investiga la enfermedad que la bacteria identificada produce, incluyendo descripcin de la enfermedad, especies afectadas, modo de transmisin y tratamiento.
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PRCTICA
16
ANLISIS BACTERIOLGICO DE ALIMENTOS
INTRODUCCIN
Con el anlisis bacteriolgico de los alimentos se pretende detectar y controlar las fuentes de contaminacin de los alimentos para consumo humano y animal. Para este fin la microbiologa sanitaria toma en consideracin los siguientes aspectos: - Determinar la calidad sanitaria de las materias primas y del producto final. - Determinacin de las causas de alteracin de un alimento. - Evaluacin de la eficiencia en los procesos de lavado, desinfeccin de equipo, utensilios y superficies de trabajo. - Evaluacin de la eficacia de los desinfectantes. - Evaluacin de la eficacia de los procesos de esterilizacin y pasteurizacin. - Deteccin de portadores sanos de microorganismos potencialmente patgenos entre el personal que maneja alimentos. - Diagnstico de posibles causas de brotes infecciosos e intoxicaciones asociadas al consumo de alimentos.
Debido al riesgo en salud pblica que representa el consumo de alimentos contaminados es necesario reglamentar las normas de calidad e higiene para los diferentes tipos de alimentos.
Anlisis bacteriolgico de alimento concentrado: Este anlisis se recomienda realizarlo en alimento para animales elaborado con harinas producidas a partir de carne, sangre, hueso,
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pluma y pescado, cuando exista la posibilidad de que este producto sea el responsable de infecciones entricas en grupos de animales. En este caso el anlisis es primordialmente cualitativo, no obstante, cuando se pretende relacionar la carga bacteriana con enterotoxmias, se han establecido lmites de 1X102 a 1X103 UFC/g de muestra.
COMPETENCIA:
El alumno conocer las tcnicas para el diagnstico bacteriolgico de los
alimentos y desarrollara las habilidades necesarias para ponerlas en prctica con diferentes tipos de alimentos.
MATERIAL
Tubos de 16x150 con 4.5 ml de solucin amortiguadora de fosfato pH 7.2 estril Mortero Mechero de Bunsen Pipetas volumtricas de 1 ml estriles Tubos de 16x150 con caldo selenito cistina Tubos de 20x150 con 15 ml de agar de soya tripticasena Pruebas bioqumicas para Gram Negativos. Cajas de petri estriles Caja de petri con agar Mac Conkey Caja de petri con agar Salmonella-Shigella Varilla acodada y alcohol para flamear
Muestras de alimentos slidos: Concentrado para ave, cerdo, bovinos, perros y conejos.
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MTODOS
Previo a la prctica, se pedir a los equipos que traigan una muestra de alimentos concentrados para diferentes especies, a los cuales se les harn los siguientes anlisis: Cuenta de mesfilicos aerobios, cuenta de coliformes y determinacin de Salmonella.
1. Preparacin de la muestra
Por tratarse de una muestra slida: alimento concentrado, en este caso es necesario mezclar la muestra con un diluyente a una dilucin 1:10 (una parte del alimento por 9 del diluyente). El
diluyente recomendado es solucin amortiguadora de fosfatos (SAF) a pH 7.2 Para la homogenizacin de la muestra se requiere de un mortero.
2. Cuenta de bacterias mesoflicas aerobias.
2.1 Realiza diluciones decimales del alimento, utilizando los tubos con 4.5 ml de SAF. Se recomienda hacer las diluciones de 10-1 a 10-5. 2.2 Etiqueta tres cajas de petri estriles con las tres ltimas diluciones y deposita en la
base de la caja, 0.5 ml de cada dilucin en su caja correspondiente, comenzando por la dilucin mayor. 2.3 A cada caja de petri conteniendo las diluciones de la muestra, agrega el contenido de un tubo con agar de soya tripticasena (fundido y enfriado hasta 45 C), mezcla con movimientos rotatorios y deja solidificar. Incuba a 37C durante 24 - 48 horas. 2.4 Realiza el conteo de colonias de aquellas cajas que tengan entre 30 y 300 colonias y reporta el resultado como UFC / ml (toma en cuenta que sembraste 0.5ml) y multiplcalo por
la inversa de la dilucin para calcular el nmero de UFC / ml de la muestra. Toma en cuenta la primera dilucin para el caso de las muestras slidas (mezcla 1:10) y reporta como UFC / g.
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3. Cuenta de organismos coliformes Dentro de este grupo se incluyen a bacilos gram negativos aerobios, no esporulados, que fermentan la lactosa con produccin de gas dentro de 48 horas de incubacin a 35C. Se utilizan como indicadoras de contaminacin fecal.
3.1 Repetir los procedimientos descritos en el paso 2.1 o utilizar los mismos tubos si se trata del mismo alimento. 3.2 Inocule 0.5 ml de las tres ltimas diluciones a las cajas de petri con agar Mac Conkey, empezando por la ms diluida, y distribuya la muestra usando la varilla acodada. Espere a que seque la muestra e incube las cajas a 37C durante 24 - 48 horas. 3.3 Realiza el conteo de aquellas colonias de apariencia rosa (fermentadoras de lactosa) y efecta los clculos como se indic en el punto 2.4.
4. Determinacin de la presencia de Salmonella sp.
5.1 Realiza una suspensin del alimento en caldo soya tripticasena e incuba por 24 horas a 37C. 5.2 Transcurrida la incubacin, transfiere 1 ml del cultivo a un tubo con 10 ml de caldo selenito cistina. Homogeniza e incuba a 37C por otras 24 horas. 5.3 Agita los tubos con selenito y siembra aislando por estra cruzada en cajas de petri con agar salmonella-shigella. Incuba a 37C por 24 horas. 5.4 Observa los cultivos para identificar las colonias sospechosas de Salmonella (no
fermentadoras de lactosa) y selecciona dos colonias tpicas para realizar pruebas bioqumicas.
INFORME
Presente un concentrado de los resultados de los anlisis realizados por todos los equipos de su grupo de laboratorio y discuta dichos resultados.
ASIGNACIN
1.- Investiga la tcnica para la cuenta viable de Staphylococcus aureus.
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2.- Investiga y realiza un ensayo acerca de cmo repercute en la salud de los animales la contaminacin del alimento con Salmonella, Staphylococcus y bacterias coliformes.
BIBLIOGRAFIA
1. C.H.Collins, Patricia M. Lyne: Mtodos microbiolgicos. ACRIBIA. Zaragoza, Espaa. 1989 2. Collins, Lyne, Grange. : Microbiological Methods. Butterworth Heinemann. 1995. 3. Black, J.: Microbiology, principles and applications. 3 ed. PRENTICE HALL. 1996. 4. Cottral. George.1989. Microbiolga Veterinaria. LA PRENSA MEDICA MEXICANA, S. A. Mxico, D. F. 5. Alexander K.Steve y Strete Dennis. Microbiology. A photographic atlas for the laboratory. Benjamn Cummings 2001. 6. Johnson T. And Case C. Laboratory experiments in Microbiology. 3 Cummings. 1992. 7. Koneman. Color atlas and textbook of Diagnostic Microbiology. 5 WILLIAMS AND WILKINS. 1997. 8. Perez, M,J, Suarez, F, Flores R. 1990. Bacteriologa General. Principios Qumicos Biolgicos. Primera edicin. UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MEXICO.
th rd rd
edition. Benjamin
ed. LIPPINCOTT
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ANEXO 1. RIESGO BIOLGICO
Definicin. Riesgo biolgico es aquel susceptible de ser producido por una exposicin no controlada a agentes biolgicos. Entenderemos por agente biolgico cualquier microorganismo y sus excreciones, cultivo celular o endoparsito humano capaz de producir enfermedades, infecciones, alergias, o toxicidad. Existe riesgo biolgico en los laboratorios donde se trabaja con microorganismos, cultivos celulares, se experimenta con animales. Tambin existe este riesgo cuando se efectan actividades mdicas y paramdicas con seres humanos o animales. El trabajo con animales en granjas y establos, as como trabajo con muestras como las aguas residuales. Recomendaciones generales. 1. Se delimitar y sealizar las zonas de trabajo 2. No se comer, beber o fumar en el laboratorio. Bajo ningn concepto se guardarn alimentos o bebidas en refrigeradores del laboratorio. 3. Se extremar la higiene personal, lavndose las manos antes y despus de cada tarea. 4. En caso de que hubiere, cubrir las heridas cutneas con guantes. No emplee anillos, pulseras, joyas, etc. 5. La manipulacin de cualquier muestra se efectuar siempre con guantes y con gafas o pantallas antisalpicaduras. Cuando menos mascarillas contra vapores. 6. Toda muestra se transportar siempre en recipiente con tapa ajustable y cierre hermtico que impida la salida de fluidos y vapores. 7. Todas las actividades al trabajar con productos biolgicos cuidadosamente para evitar la formacin de gotas y aerosoles. 8. En el caso de que durante una operacin de centrifugacin se produjese la ruptura de los tubos en el interior del equipo, se esperar al menos durante 5 minutos para abrir la tapa del mismo. Posteriormente se desinfectar equipos, materiales y superficies de trabajo con un producto de efectividad constatada (para el tipo de agente infeccioso que se este trabajando; esto de acuerdo a recomendacin por el instructor.
74
deben realizarse
9. Se restringir en la medida de lo posible, el uso de agujas y jeringuillas. Se desechar las jeringas y agujas de un solo uso en contenedores especiales (indeformables, no perforables, sin fisuras para evitar derrames) sin ser encapsuladas. 10. El material contaminado que deba ser descontaminado en un lugar exterior al laboratorio se colocar en un contenedor especial (indeformables, no perforables, sin fisuras para evitar derrames), debidamente sealizado. 11. Todo material de desecho o residuo biolgico previamente esterilizado debe ser sometido a un programa de gestin de residuos (ver manual de disposicin de residuos). No mezcle los residuos contaminados biolgicamente con otro tipo de residuos.
PARA TAREAS CON ANIMALES
12. Se manipular al animal siempre en silencio y con tranquilidad. Evitar en todo momento su sufrimiento innecesario ya que adems puede inducir al animal a defenderse y a producir lesiones. 13. Se usar siempre guantes en la extraccin de sangre o procedimientos invasivos, en el contacto con lquidos que requieran precauciones universales (lquido amnitico, pericardio, peritoneal, pleural, semen, secreciones vaginales y cualquier lquido contaminado con sangre), en contacto con mucosas, piel no intacta y para manipular objetos o superficies manchados con lquidos corporales. Tambin se han de usar guantes cuando se tengan cortes, araazos o lesiones en la piel de las manos. 14. Se efectuar lavado de las manos despus de quitarse la bata y los guantes antes de dejar la estancia, e inmediatamente si se han ensuciado de sangre. En los trabajos en granjas y establos se extremar la higiene personal tras la realizacin de las tareas. 15. Se recomienda el uso de batas desechables cuando la ropa pueda ser manchada por lquidos corporales, sangre, excreciones o secreciones. El resto de ropa que se utilice para estas actividades, ser lavada frecuentemente, preferiblemente sin mezclar con ropa que vaya a ser utilizada en menesteres no laborales. 16. Se debe usar pantalla anti salpicaduras, bata y mascarilla protectoras cuando haya riesgo de salpicaduras o proyeccin de lquidos corporales. 17. Las gotas de sangre que se derramen debern limpiarse rpidamente con un desinfectante.
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ANEXO 2. Cuidados del microscopio.

1.Transportar el microscopio sujetndolo del brazo con una mano y colocar la otra debajo
de la base para sostenerlo 2.Colocar cuidadosamente el microscopio en su mesa de trabajo en un sitio sin
vibraciones. 3.Limpiar el sistema mecnico con un trapo suave que no deje pelusa y el sistema ptico con papel seda. No manejar las lentes con los dedos. 4.Limpiar las lentes antes y despus de usarlo en clases, solo con papel seda. 5.No arrastrar, golpear o inclinar el microscopio.
II. 1.2.3.4.-
Manejo del microscopio Conectar y encender la lmpara. Colocar el objetivo seco dbil (10 X) en posicin. Subir el condensador hasta el tope Abrir o cerrar el diafragma hasta lograr una adecuada iluminacin. La iluminacin excesiva disminuye el contraste
5.-
Colocar la preparacin en la platina y ajustarla con las pinzas o en el carrete para portaobjetos.
6.-
Iniciar el enfoque usando el tornillo de ajuste grueso (macromtrico) y despus de ajuste fino (micromtrico), hasta obtener una imagen ntida.
7.-
Sin mover los tornillos cambiar al objetivo seco fuerte (40 X) usando el porta giratorio ( revlver ) y enfocar de nuevo usando el micromtrico.
objetivos
8.-
Una vez localizado el campo de inters y antes de cambiar al objetivo de inmersin, colocar una pequea gota de aceite de inmersin en la preparacin y sin mover los tornillos proceda a colocar el objetivo de (100X) en posicin. Enfocar la preparacin usando solamente el tornillo micromtrico y cuidando de no presionar demasiado el portaobjetos con el objetivo porque puede romper la
preparacin y rayar la lente.
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9.-
Al terminar de hacer sus observaciones, limpiar el microscopio como se indic, bajar la platina hasta el tope inferior y dejar el revlver en el objetivo de menor aumento o donde no lo tiene.
10.11.-
Entregar o guardar el microscopio con el cable enrollado y cubierto con la Avise a sus profesores de cualquier irregularidad que note en el
funda.
microscopio puesto
que en otras clases de laboratorio pueden utilizar el mismo instrumento y culparse a usted por cualquier parte que se haya daado anteriormente y que se notifique despus.
77
ANEXO 4. Formatos de Reporte
REPORTE DE PRCTICA. 2 I. RESULTADOS 1. A partir del frotis elaborado en un medio slido: Cuadro1. Resultados de la morfologa microscpica. Esquemas del microorganismo 1 con el objetivo 10 X. FORMA:__________________________________
AGRUPACIN: ____________________________
Esquemas del microorganismo1 con el objetivo 40 X. FORMA:_________________________________ ___________________________________________ _ AGRUPACIN:______________________________ ___________________________________________ _ Esquemas del microorganismo 1 con el objetivo 100X. FORMA:_________________________________ ___________________________________________ _ AGRUPACIN:______________________________ ___________________________________________ _
2. Frotis elaborado a partir de un medio lquido: Cuadro2. Resultados de la morfologa microscpica.

78
Esquemas del microorganismo 2 con el objetivo 10 X. FORMA:_________________________________ ___________________________________________ _ AGRUPACIN:______________________________
Esquemas del microorganismo 2 con el objetivo 40 X. FORMA:_________________________________ ___________________________________________ _ AGRUPACIN:_____________________________
Esquemas del microorganismo 2 con el objetivo 100 X. FORMA:_________________________________ ___________________________________________ _ AGRUPACIN:______________________________
II. DISCUSIN DE RESULTADOS ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________ III. ASIGNACIN 1. Investiga quien fue Roberto Koch y haz una resea de sus principales aportaciones a la microbiologa. ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ _____________________
79
2. Investiga la forma y las caractersticas generales de los microorganismos que investigaste. ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________
IV. CONCLUSIONES ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ _____________________
V. FUENTES DE INVESTIGACIN ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________
80
REPORTE DE PRCTICA. 3 I. RESULTADOS 1. A partir de la siembra en un medio slido: Cuadro1. Resultados de la descripcin de morfologa colonial macroscpica. Descripcin: Tamao: Color: Forma: Elevacin: Bordes: Superficie: Luz reflejada: Luz transmitida: Consistencia: Descripcin: Tamao: Color: Forma: Elevacin: Bordes: Superficie: Luz reflejada: Luz transmitida: Consistencia: 2. Elaborada a partir de un medio lquido: Cuadro2. Descripcin de la morfologa colonial o macroscpica. Descripcin:_________________________________ _
___________________________________________ _
II. DISCUSION DE RESULTADOS ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________
81
______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________
III. ASIGNACIN 1. Investiga al menos otros 2 mtodos de aislamiento de cultivos bacterianos. ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ________________________________________
2. Compara el mtodo desarrollado en la prctica con los mtodos que investigaste, seala adems las ventajas y desventajas de cada uno de ellos. ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________
82
______________________________________________________________________________ ________________________________________
IV. CONCLUSIONES ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________
V. FUENTES DE INVESTIGACIN ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________
83
REPORTE DE PRCTICA 4 I. RESULTADOS Cuadro1. Descripcin de la morfologa bacteriana Descripcin: Nombre de la bacteria: Forma: Agrupacin: Reaccin de Gram Descripcin: Nombre de la bacteria: Forma: Agrupacin: Reaccin de Gram Descripcin: Nombre de la bacteria: Forma: Agrupacin: Reaccin de Gram
Cuadro2. Descripcin de la morfologa bacteriana. Descripcin:_________________________________ _
Descripcin:_________________________________ _
Descripcin:_________________________________ _
II. DISCUSIN DE RESULTADOS ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________

84
______________________________________________________________________________ ______________________ III. ASIGNACIN 1. Explique cual es el paso crtico de la tincin de Gram. ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________
2. Indique al menos dos factores que pueden alterar los resultados en la tincin de Gram. ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________
3. Anote cinco gneros bacterianos de importancia veterinaria que sean Gram positivos y cinco Gram negativos ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ _______________ IV. CONCLUSIONES ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
85
V. FUENTES DE INVESTIGACIN ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ _________________________________
86
REPORTE DE PRCTICA 5 I. RESULTADOS Cuadro1. Descripcin de la morfologa bacteriana o microscpica. Descripcin:_____________________ _______________________________ _______________________________ _______________________________ _______________ Descripcin:_____________________ _______________________________ _______________________________ _______________________________ _______________ Descripcin:_____________________ _______________________________ _______________________________ _______________________________ _______________ Descripcin:_____________________ _______________________________ _______________________________ _______________________________ _______________
II. DISCUSIN DE RESULTADOS ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________
87
______________________________________________________________________________ ______________________
III. ASIGNACIN 1. Investigar Por que es necesario calentar el colorante primario en esta tcnica? ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________
2. Investigar a que se debe la propiedad de algunas bacterias de ser acido-alcohol resistentes. ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________
IV. CONCLUSIONES ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ _______________
88
V. FUENTES DE INVESTIGACIN ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ _______________
89
REPORTE DE PRCTICA 6 I. Observacin de la cpsula con la tincin de rojo congo. Cuadro1. Resultados de la morfologa bacteriana microscpica. Esquema del microorganismo 1 con el objetivo 100 X. Descripcin:_________________________________ _
___________________________________________ _ Esquema del microorganismo 2 con el objetivo 100 X. Descripcin. _________________________________ ___________________________________________ _ ___________________________________________ _ ___________________________________________ _ ___________________________________________ _
2. Resultados de la observacin de esporas con la tincin de Gram. Cuadro2. Resultados de la morfologa bacteriana o microscpica. Esquema del microorganismo 1 con el objetivo 100 X. Descripcin:_________________________________ _
Esquema del microorganismo 2 con el objetivo 100 X. Descripcin. _________________________________ ___________________________________________ _ ___________________________________________ _ ___________________________________________ _ ___________________________________________ _
90
3. Resultados de la observacin de bacterias Gram positivas y Gram negativas con tincin de Scheafer y Fulton. Cuadro3. Resultados de morfologa bacteriana (microscpica) Esquema del microorganismo 1 con el objetivo 100 X. Descripcin:_________________________________ _
II. DISCUSIN DE RESULTADOS ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________
III. ASIGNACIN
1. Investigue 5 ejemplos de bacterias de importancia en veterinaria que tengan cpsula. ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________
2. Investigue que compuestos qumicos pueden formar las capsulas. ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________
91
______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________ 3. Investigue tres ejemplos de bacterias de importancia en veterinaria que pueden formar esporas. ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________
4. Investigar cuales son las partes que forman a una espora bacteriana. ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________
IV. CONCLUSIONES ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________
V. FUENTES DE INVESTIGACIN ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ __________________________________________
92

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INDICE

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16.

REGLAMENTO INTERNO LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA Y MICOLOGIA VETERINARIA

ACADEMIA DE BACTERIOLOGIA Y MICOLOGIA VETERINARIA

INSTITUTO TECNOLGICO DE SONORA

LABORATORIO DE BACTERIOLOGA Y MICOLOGA VETERINARIA

MORFOLOGA MICROSCPICA Y TINCIONES SIMPLES

Incluir una imagen que ejemplifique los anillos aromaticos en un colorante.

Microscopio de campo luminoso Aceite de inmersin

Tela suave y papel seda Lpices de colores

Asa bacteriolgica Mechero de Bunsen Puente de coloracin.

Antes de iniciar con los procedimientos de la prctica leer el anexo

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MORFOLOGA COLONIAL Y AISLAMIENTO POR ESTRA CRUZADA

MATERIAL: Cajas petri con medios de cultivo: 1. generales ( Agar Nutritivo)

Cultivos de levaduras: 1. Torula sp, - Sacharomyces.

Asa bacteriolgica Mechero de Bunsen Chispa Gradilla Puente para tincin

Portaobjetos Cubreobjetos Regla Bolsa de plstico transparente

I. Procedimiento para la siembra en estra cruzada.

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LABORATORIO DE BACTERIOLOGA Y MICOLOGA VETERINARIA

Reducir el tiempo requerido para completar la tcnica.

procedimiento a seguir si los hace a partir de medio slido o -

nombre de las bacterias, la forma, agrupacin y su reaccin de

Haga esquemas de las preparaciones de las mezclas de bacterias teidas .

Explique cual es el paso crtico en la tincin de Gram.

Indique al menos dos factores que pueden alterar los resultados en la

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LABORATORIO DE BACTERIOLOGA Y MICOLOGA VETERINARIA

1 Investigar Por que es necesario calentar el colorante primario en esta tcnica?

2. Investigar a que se debe la propiedad de algunas bacterias de ser cido-alcohol resistentes

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LABORATORIO DE BACTERIOLOGA Y MICOLOGA VETERINARIA

Aceite de inmersin Cepas de Klebsiella pneumoniae, Bacillus sp y Staphylococcus aureus

Estructura bacteriana. Tomado de www.alaquarium.com/bacterias

Las esporas se observarn de color verde y las bacterias de color rojo

Fig.1: Esporas bacterianas. a) subterminales b y c) centrales d) terminales

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LABORATORIO DE BACTERIOLOGA Y MICOLOGA VETERINARIA

AISLAMIENTO DE HONGOS Y MORFOLOGA COLONIAL

PRIMERA SESION Aislamiento de hongos

Registra las caractersticas de la morfologa colonial de los hongos observados.

INSTITUTO TECNOLGICO DE SONORA

LABORATORIO DE BACTERIOLOGA Y MICOLOGA VETERINARIA

Describe la morfologa colonial de dos colonias aisladas a partir de la de Gram.

materia fecal y la morfologa microscpica utilizando la tincin

Observa el crecimiento de las cepas bacterianas sembradas en los medios

discute los resultados.

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PRCTICA 9 USO DE MEDIOS SELECTIVOS

1. Medios de cultivo selectivos

6) Interpretar los resultados.

Color del medio de cultivo

Indicador que contiene el medio

Tipo de medio de cultivo

Forma de siembra en el medio de cultivo

Caldo bilis verde brillante Medio Stuart S.aureus E.coli

Salmonella Mezcla de bacterias Proteus

Morfologa colonial Forma agrupacin

y Modificacin en el medio a las hrs de

Esquemas del microorganismo 2 con el objetivo 10 X. FORMA:_ ___________ _ AGRUPACIN:______________________________

Esquemas del microorganismo 2 con el objetivo 40 X. FORMA:_ ___________ _ AGRUPACIN:_____________________________

Esquemas del microorganismo 2 con el objetivo 100 X. FORMA:_ ___________ _ AGRUPACIN:______________________________