Manual Nuevo 1 Y 2 Bloque

Facultad de Químico Farmacobiología UMSNH.
Laboratorio de Microbiología. Manual de Microbiología I.
PRÓLOGO.
El presente manual incluye ejercicios de laboratorio tendientes a proporcionar una

visión panorámica acerca del mundo microscópico.
En virtud de la diversidad de los microorganismos sobre el planeta, resulta difícil
para el hombre comprender la naturaleza íntima de éstos, sin una noción previa de
la Microbiología; por esta razón, el propósito fundamental de este manual, es
introducir al estudiante en el conocimiento de la Microbiología a través de la
experimentación, que lo llevará hacia la observación y comprensión de las
características básicas de los microorganismos, de su interacción con los
vegetales, animales y el hombre, así como de la vida en general.
En la actualidad es necesario familiarizarse con todos los grupos de
microorganismos, no solo desde el punto de vista teórico, sino también desde el
práctico. Con la seguridad de que un estudiante que domine el conjunto de
técnicas contenidas en el citado documento, podrá desarrollarse con éxito en la
fase siguiente de su formación académica.
Al final de cada ejercicio se incluye un cuestionario que contiene preguntas
relacionadas con el experimento, las cuales en algunos casos requieren de un
mejor razonamiento e investigación. Deben de contestarse recurriendo a la
consulta de las principales obras de Microbiología o de otros textos
complementarios. Su resolución hablará del inicio en el dominio de una de las
ramas más importantes de la Biología moderna.
1
REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA.
1. El estudiante debe ingresar al laboratorio con bata puesta, limpia y

debidamente abotonada.
2. Presentarse con las uñas cortas y sin pintar, también con el cabello recogido.
3. No se permitirá el paso a quienes se presenten con short, falda, pantalones
rotos, piercing y zapatos que no sean cerrados.
4. No está permitido el uso de teléfonos celulares durante las sesiones de
laboratorio, de igual forma no se permite el ingreso de alimentos.
5. Dirigirse en todo momento con respeto hacia los profesores, instructores y
compañeros, evitar el uso de palabras antisonantes.
6. El estudiante deberá encontrarse en el área de trabajo cinco minutos antes del
inicio de la sesión.
7. Se deberá limpiar la superficie de la mesa de trabajo en una solución
germicida, al inicio y al final de cada práctica.
8. Antes de ingresar al laboratorio, leerá el texto de práctica que va a realizar y
organizar su plan de trabajo con todo cuidado. Entender cómo debe efectuar
cada paso analizado a su vez, los principales fundamentos que se ponen en el
relieve.
9. Cada sesión de laboratorio deberá iniciarse con una corta explicación y
periodo de instrucciones. No inicie su trabajo hasta que haya recibido las
indicaciones. Pregunte cuando no entienda el procedimiento o la finalidad de
algún experimento; la buena técnica de laboratorio depende
fundamentalmente de que conozca que es lo que se va a realizar.
10. Debido a que algunos microorganismos con los que va a trabajar son
patógenos en potencia, es necesario desarrollar técnicas de asepsia al
manejarlos y transferirlos. Evite el contacto de la boca con las manos y las
operaciones como fumar, comer o humedecer las etiquetas con la lengua.
11. No guarde material de laboratorio ni cultivos microbianos en las bolsas de la
bata.
12. El estudiante debe estar provisto del material de trabajo, de lo contrario no
podrá permanecer en el laboratorio.
13. Deberá concentrarse en su actividad evitando charlas y comunicación o voces
con los vecinos de las otras mesas.
14. El material usado no contaminado como: algodón, cerillos, papel, etc., se
depositará en los recipientes para basura diseñados ex profeso, no arrojar
basura al piso, ni colocarla en los gabinetes, cajones del área de trabajo o
vertederos.
2
15. Cuando de manera accidental se derrame material contaminado, deberá

tratarse con un germicida adecuado (fenol, benzal, etc.), dejando que actúe el
tiempo necesario antes de proceder a limpiar el área contaminada.
16. El asa debe de esterilizarse en la flama del mechero, antes y después de su
uso.
17. Al concluir la práctica, el estudiante debe separar el material contaminado,
para trasladarlo al área de esterilización y lavado. Cerrar y colocar los
reactivos debidamente ordenados en el almacén.
18. Comprobar que las llaves de gas y agua estén cerradas antes de salir del
laboratorio.
19. Anote cuidadosamente todas las observaciones en el momento en que se
lleven a cabo. El examen de laboratorio se referirá no solo a la información
proporcionada en este manual, sino también a sus propias observaciones y
deducciones.
20. Conteste las preguntas que están al final de cada ejercicio utilizando las hojas
para resultados.
21. Informe inmediatamente al instructor de cualquier accidente, tales como:
cortaduras, quemaduras, derrames de sustancias, cultivos o medios.
22. Tome todas las precauciones posibles para evitar accidentes.
3
ÍNDICE.
Primer bloque de evaluación.

Práctica No. 1. Revisión de la NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002.
Práctica No. 2. Preparación y desinfección del material de laboratorio.
Práctica No. 3. Preparación de medios de cultivo.
Práctica No. 4. Contaminación ambiental y morfología colonial.
Práctica No. 5. Siembra y desarrollo en diferentes medios de cultivo.
Segundo bloque de evaluación.

Práctica No. 6. Microscopia.
Práctica No. 7. Forma y tamaño.
Práctica No. 8. Tinción simple.
Práctica No. 9. Tinción diferencial Gram.
Práctica No. 10. Tinción diferencial de Zielh Neelsen.
Práctica No. 11. Tinción selectiva de cápsula.
Práctica No. 12. Tinción selectiva de esporas.
Tercer bloque de evaluación.

Práctica No. 13. Metabolismo microbiano del nitrógeno.
Práctica No. 14. Metabolismo microbiano del carbono.
Práctica No. 15. Acción de los antibióticos sobre el crecimiento bacteriano.
4
Primer bloque de evaluación

Práctica No. 1. Revisión de la NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002.
Práctica No. 2. Preparación y desinfección del material de laboratorio.
Práctica No. 3. Preparación de medios de cultivo.
Práctica No. 4. Contaminación ambiental y morfología colonial.
Práctica No.. 5 Siembra y desarrollo en diferentes medios de cultivo.
PRÁCTICA No. 1
5
Revisión de la NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002. Protección ambiental –

Protección Salud - Residuos peligrosos biológico-infecciosos - Manejo y
especificaciones.
OBJETIVO.
Comprender los fundamentos y particularidades de la NOM-087-SEMARMAT-
SSA1-2002, para conocer la importancia de su cumplimiento en el laboratorio.
INTRODUCCIÓN.
En la antigua Grecia, concretamente en los escritos de Hipócrates, ya se hacía
patente la importancia de la salud como representación de la unidad del ser
humano con su entorno, es decir; que para alcanzar y conservar la salud se
tendría que respetar y conservar el medio ambiente.
Cumplir con tal propósito ha representado un verdadero reto y ha significado la
aplicación de las más diversas técnicas y estrategias para dar solución a esta
problemática.
En México durante la época de la Colonia, ya se aplicaban medidas para evitar la
propagación de la viruela durante la epidemia que ocurrió en esos años. Para
evitar la transmisión de la infección, se ordenó poner cal viva adentro de los
ataúdes de los cadáveres de los enfermos y posteriormente enterrarlos.
En 1847, el médico Ignaz Semmelweis concluyó que la principal causa de las
fiebres puerperales era la exploración de las pacientes realizada por estudiantes
de medicina cuyas manos estaban impregnadas de los restos de las autopsias de
las fallecidas, la mayoría por la misma enfermedad. Con estas observaciones se
instituyó que los médicos debían incorporar a su práctica la obligación del lavado
de manos a fin de eliminar los residuos infecciosos.
Entre 1980 y 1990 se da el surgimiento de la epidemia del SIDA a nivel mundial,
suceso con el que se pone de manifiesto que debían emprenderse acciones en
materia de los desechos sólidos de los hospitales como riesgos potenciales para
la salud. El factor detonante de tal necesidad surge tras el hallazgo de jeringas en
playas turísticas de la Costa este de Estados Unidos, los medios de comunicación
publicaron la noticia suponiendo que los desechos provenían de hospitales y
solicitaron se tomaran medidas preventivas ante el grave problema de riesgo de
contagio de SIDA, hepatitis y otras infecciones originadas en los centros de
atención médica.
6
El Congreso de Estados Unidos elaboró y aprobó un acta donde se establecieron

restricciones y precauciones severas para el manejo de la basura hospitalaria.
Dicha legislación se caracterizó por ser compleja y costosa.
En México, también se tomaron acciones en éste mismo sentido y, fue a través de
los Institutos Nacionales de Salud que se dio inicio a un programa formal de
vigilancia y control, editando en 1989 el Manual de control de infecciones
nosocomiales para hospitales generales y de especialidad.
Poco después en 1991, la Dirección General de Salud Ambiental de la Secretaría
de Salud da inicio a los trabajos destinados a elaborar una norma de Residuos
Peligrosos Biológico-Infecciosos (RPBI), que finalmente es emitida por la
Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales (SEMARNAT).
Fue en 1995 que se publicó en el Diario Oficial de la Federación la primera norma
para regular el manejo y tratamiento de los RPBI, la NOM-087-ECOL-1995. El
objetivo fundamental de ésta fue proteger al personal de salud de los riesgos
relacionados con el manejo de estos residuos, así como proteger el medio
ambiente y a la población que pudiera estar en contacto con estos residuos dentro
y fuera de las instituciones de atención médica.
Esta primera Norma catalogaba como RPBI a una enorme cantidad de residuos
que en realidad no representaban ningún riesgo, lo que se tradujo en una
importante producción de RPBI y en consecuencia, significó un enorme gasto para
su manejo.
Tras una revisión exhaustiva y con la inclusión de varias mejoras, se publicó en el
Diario Oficial de la Federación, el 17 de febrero del 2003 la NOM-087-
SEMARNAT-SSA1-2002, Protección ambiental – Salud ambiental – Residuos
peligrosos biológico-infecciosos – Clasificación y especificaciones de manejo; en
la que se replantean los criterios para la identificación de RPBI, sin perder el
objetivo inicial de la protección a la salud y al ambiente. Por lo tanto, residuos que
en el pasado fueron considerados RPBI, ahora no se consideran como peligrosos
por lo que únicamente habrían de disponerse en sitios autorizados por el
municipio, de conformidad con la NOM-083-SEMARNAT-2003, dicha acción
repercute en una disminución de los costos por su disposición final, pudiendo
utilizar mejor los recursos para la adquisición de otros materiales y equipos
necesarios para la atención médica de estos establecimientos.
Otro de los cambios significativos que observa la nueva Norma, es la inclusión de
la Secretaría de Salud como órgano regulador.
Existen dos tipos de normas: Las Normas Mexicanas (NMX), y las Normas
Oficiales Mexicanas (NOM), siendo la NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002 de éste
último tipo. La diferencia radica en que las Normas Mexicanas, sólo son
7
lineamientos de carácter recomendatorio, pero una vez adoptadas son

obligatorias, por su parte; las Normas Oficiales Mexicanas se caracterizan por
tener carácter obligatorio.
El 14 de septiembre de 2005 se publicaron en el Diario Oficial de la Federación,

las Bases de Colaboración que celebran la Secretaría de Medio Ambiente y
Recursos Naturales, con la participación de la Procuraduría Federal de Protección
al Ambiente (PROFEPA), y la Secretaría de Salud (SALUD), con la participación
de la Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios (COFEPRIS),
para coordinar esfuerzos y vigilar el cumplimiento de la Norma Oficial Mexicana
NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002. Protección ambiental – Salud ambiental –
Residuos peligrosos biológico–infecciosos – Clasificación y especificaciones de
manejo.
MATERIALES.
1. Bolsas para RPBI.
2. Contenedores de RPBI.
3. Jeringas.
4. Agujas de Vacutainer.
5. Capuchones para Vacutainer.
6. Algodón.
METODOLOGÍA.
1. Realizar dibujos de los diversos contenedores y bolsas empleadas en el
envasado de los RPBI.
CUESTIONARIO.
1. ¿Cuál es el nombre completo de la Norma Oficial Mexicana en vigencia,
que se revisó durante la práctica?
2. ¿En qué radica la importancia de ésta Norma Oficial Mexicana, y por qué el
personal del área de la salud debe conocerla y cumplirla?
3. ¿Qué significan las siglas RPBI?
4. Mencionar de acuerdo a ésta NOM, la clasificación general de los RPBI y el
tipo de envasado para cada uno de ellos.
5. ¿Cuáles son las Secretarías y a su vez, las instancias de gobierno
responsables de vigilar el cumplimiento de ésta NOM por parte de los
establecimientos generadores y terceros implicados?
8
6. Según la NOM, ¿cuáles son los niveles en que se clasifican los

establecimientos generadores de RPBI y, cuál es el periodo de
almacenamiento señalado para cada uno de ellos?
7. Considerando el impacto ambiental, ¿por qué se debe hacer un correcto
manejo de los RPBI?
8. Menciona tres ejemplos de contenedores de RPBI.
9. Describe 3 medidas de seguridad para realizar el manejo de RPBI dentro
del laboratorio.
10. Dibuja el Símbolo Universal de los RPBI.
9
PRÁCTICA No. 2
Preparación y desinfección del material de laboratorio.
OBJETIVO.
Conocer el material empleado en el laboratorio de Microbiología y los
procedimientos necesarios de preparación, limpieza y esterilización para su uso en
el momento en que requiera.
INTRODUCCIÓN.
El laboratorio de Microbiología es un sitio habituado para el manejo y el estudio de
los microorganismos. El trabajo dentro del mismo ha de realizarse de acuerdo a
estándares técnicos y de seguridad propios de un laboratorio de Microbiología
Clínica.
Es importante recordar que la finalidad del laboratorio de Microbiología es
determinar los microorganismos presentes en la muestra, por lo que es preciso
extremar precauciones para evitar contaminaciones que den lugar a resultados
erróneos.
Cada uno de los materiales que se utilizan dentro del laboratorio de Microbiología
tiene una función y uso que debe ser acorde a la tarea a realizar. Para el trabajo
rutinario se debe de disponer de aparatos e instrumental necesario para el
correcto desarrollo de su actividad. Es primordial que todos los recipientes, medios
de cultivo y dispositivos de siembra que se requieren en el estudio de los
microorganismos sean estériles, es decir, libres de vida microbiana. El
instrumental empleado en el laboratorio es de diversos materiales y pueden ser
reciclables o de un solo uso. Los materiales que con más frecuencia se utiliza en
el trabajo rutinario son: cajas, tubos de ensaye, matraces, pipetas, etc.
El material a esterilizar debe estar perfectamente limpio para garantizar la
reducción de la carga microbiana y, así contribuir a la efectividad del proceso de
esterilización.
Los procedimientos de limpieza, desinfección y la posterior esterilización, son
indispensables para el correcto funcionamiento de zonas de trabajo donde se
requiere tener controlada la carga microbiana presente. Estos procesos son
utilizados en los diferentes establecimientos relacionados al área de la salud tales
como laboratorios, consultorios, hospitales, quirófanos y clínicas.
10
Es fundamental contar con una técnica apropiada para proteger el material que se
ha esterilizado a fin de evitar su contaminación.
Los procedimientos comunes de esterilización incluyen el uso de calor, la filtración
y la irradiación.
La esterilización es el proceso mediante el cual se logra la muerte de todas las
formas de vida microbiana incluyendo esporas, hongos y virus. Hay que recalcar
que por muerte se entiende como la pérdida irreversible de la capacidad
reproductiva del microorganismo.
Esterilización por calor

Procedimientos por calor seco: Horno.
Flama directa o calor directo.
Aire caliente.
Procedimientos por calor húmedo: Ebullición.

Calor efluente.
Pasteurización.
Ultrapasteurización.
Autoclave.
La esterilización sirve para objetos y productos inanimados, ya que su

procedimiento es capaz de acabar con la vida de los microorganismos y, por lo
tanto, también puede dañar a las células de un organismo en cuestión.
Para el material, como las pipetas y placas Petri de vidrio, se usa la esterilización
con calor seco. Se mantiene la temperatura a 170° C durante una hora mientras el
material está dentro del esterilizador de aire caliente (horno). Para el material que
se destruye con el calor seco o por calor húmedo a elevadas temperaturas, se usa
la esterilización intermitente (tindalización). Se calienta el material durante 30
minutos a vapor fluyente (100°C), durante tres días sucesivos, dejándole a la
temperatura ambiente en los intervalos entre tratamientos. Debido a que es
tedioso, este método de esterilización no resulta satisfactorio en la mayoría de los
casos.
Para la mayor parte de los medios, gomas y otros tipos materiales que se
destruirán con el calor seco se utiliza la esterilización con vapor a presión o
también conocida como calor húmedo. Estos materiales se esterilizan en el
autoclave a 121°C, durante 15 a 30 minutos, usando vapor a 15 libras de presión.
11
Varios materiales, por ejemplo; ciertos azúcares y los sueros sanguíneos, se

destruyen al calentarlos a temperaturas utilizadas normalmente para la
esterilización. Para materiales que son termolábiles, como son líquidos o
substancias en solución, puede usarse la filtración.
Los filtros en éste procedimiento eliminan las bacterias por dos caminos: mediante
la acción mecánica de calor, ejercida por los pequeñísimos poros, y por la
adsorción de los microbios al filtro debido a la diferencia entre sus cargas
eléctricas.
Un filtro, ampliamente utilizado en Microbiología es el filtro de membrana. Consta
de una membrana de celulosa o de plástico con un tamaño de poro
suficientemente pequeño (generalmente 0,45 μm).
Los filtros son de diferentes materiales:
 De porcelana; el Chamberlain Pasteur.
 De tierra de diatomea; Berkefeld y el Mantner.
 Asbesto; Seitz.
 De vidrio
 Ester de celulosa, como Millipore y Polipore.
El óxido de etileno y otros vapores se están haciendo cada vez más importantes
como agentes esterilizantes. Aunque muchos laboratorios no poseen el equipo
especializado que se necesita para demostrar éste procedimiento de esterilización
gaseosa.
La desinfección será la destrucción de microorganismos patógenos por agentes
químicos que van desde el jabón, diferentes alcoholes, soluciones de yodo,
soluciones de sales orgánicas como el merthiolate, entre otros.
Existen varios métodos por los cuales se puede hacer la validación del
procedimiento de esterilización, estos son:
Métodos de validación de la esterilización.

Controles físicos: Se realiza a través del control de los parámetros
del equipo en las distintas etapas del proceso,
por ejemplo; temperatura, presión y vacío.
Controles químicos: Se utilizan sustancias químicas que viran de color
12
en contacto con el agente esterilizante.

 Externos: Se colocan por fuera del paquete y distingue de
un material procesado de uno que no ha sido
procesado, Ejemplo: cinta testigo.
 Internos: Detectan la correcta penetración del agente

esterilizante.
Controles biológicos: Son dispositivos inoculados con bacterias, por

ejemplo esporas de Bacillus stearothermophylus.
MATERIAL:
1. Cajas de Petri.
2. Tubos de ensaye.
3. Matraces de Erlenmeyer de diferente capacidad.
4. Pipetas volumétricas.
5. Pipetas Pasteur.
6. Papel de envoltura cortado de acuerdo al objeto para envolver.
7. Gasa cortada en cuadros pequeños.
8. Algodón.
9. Cinta masking.
10. Cinta testigo.
11. Mecheros Bunsen.
12. Mechero Fisher.
13. Gradilla.
METODOLOGÍA.
1. Mostrar el material comúnmente utilizado en el laboratorio de Microbiología.

2. Explicar los procedimientos de limpieza, preparación y envoltura de cristalería
para su esterilización.
3. Exponer los utensilios para el manejo directo de los microorganismos, su
conservación y su uso.
ACTIVIDADES
1. Los alumnos de cada equipo deben elaborar tapones para tubos y matraces.
13
2. Realizar el etiquetado del material para su almacenamiento o esterilización.

3. Realizar la envoltura de cajas de Petri, de pipetas y su rotulado.
4. Hacer diagramas y esquemas de las actividades realizadas en el laboratorio.
CUESTIONARIO.
1. Describir la definición de los siguientes conceptos:
 Limpieza
 Esterilización.
 Desinfección.
 Asepsia.
 Antisepsia.
 Agentes antimicrobianos
 Desinfectante.
 Antiséptico.
2. Menciona los factores que influyen en la velocidad de destrucción de los
microorganismos.
3. ¿Qué tipo de esterilización se utiliza para el material de cristalería?
4. ¿Cuál es el fundamento de esterilización por calor seco?
5. ¿Cuál es el fundamento de la esterilización por calor húmedo?
6. ¿Cuál es la temperatura, presión y tiempo a la que se lleva a cabo la
esterilización en autoclave por calor húmedo?
7. Mencionar de qué manera se puede asegurar el control del proceso de
esterilización.
8. Describa la técnica de lavado de manos y su importancia.
CONCLUSIONES.
BIBLIOGRAFÍA.
14
PRACTICA No. 3
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
OBJETIVOS.
 Identificar los componentes esenciales de los medios de cultivo
(carbohidratos, lípidos, proteínas, vitaminas, minerales, etc.), así como el
papel de estos en el metabolismo de los microorganismos.
 Comprender porque no todos los microorganismos tienen la capacidad para

metabolizar cualquier sustancia nutritiva.
 Conocer que es un medio de cultivo, sus usos, sus variedades, así como
aprenderá a preparar algunos de ellos.
INTRODUCCIÓN:
Para que un microorganismo (M.O.) se pueda desarrollar, debe tomar del
ambiente, las sustancias necesarias, para la obtención de energía que será
empleada para la biosíntesis y como consecuencia particular la reproducción
celular. A estas sustancias se les llama Nutrientes.
Un medio de cultivo debe contener todos los nutrientes necesarios en
cantidades adecuadas para los microorganismos (M.O.). Muchos
microorganismos son incapaces de utilizar proteínas como tales, y deben de
proveerse de proteínas degradadas (péptido, proteasas, peptonas, aminoácidos).
Extractos de carnes o carne parcialmente digerida son los nutrientes básicos
de muchos medios. A algunos se les añaden: Carbohidratos y sales minerales.
Estos medios Basales pueden ser suplementados o enriquecidos con sangre,
suero, plasma, vitaminas o bien determinados aminoácidos.
Los medios de cultivo varían ampliamente, de acuerdo con las necesidades
particulares de los organismos estudiados. A veces, se hace una distinción entre
medios complejos y definidos.
Medios complejos. Contienen lo necesario para el crecimiento, en forma
cruda, es decir que no se conocen todos los componentes de los medios ni se
sabe las cantidades exactas en que están presentes. Muchos de los diversos
tejidos de los vegetales, carnes caseína y células de levadura según la sustancia
de que se trate, proporcionan fuentes ricas en polipéptidos, aminoácidos,
15
vitaminas o sales minerales. Ejemplos específicos de tales componentes de los

medios son peptonas o triptonas, que son hidrolizados enzimáticos de proteínas
animales y el extracto de levadura, que es autolisado de levadura, rico en
vitaminas del complejo B. en estos digeridos crudos suelen estar presentes
algunos carbohidratos, aunque muchos de los medios complejos se suplementan
luego con un azúcar adicional, generalmente glucosa.
Medios definidos. Son aquellos que ofrecen lo que se requiere para el
crecimiento, en forma de productos químicos relativamente puros y a una
concentración conocida. Varían de acuerdo con las necesidades nutricionales de
cada organismo en particular. Los componentes esenciales de un medio para el
crecimiento de heterótrofos que no sean muy exigentes tales como Escherichia
coli, son sales orgánicas y fuentes de carbono y de nitrógeno, un medio definido
adecuado para E. coli podría contener CINH4, SO4Mg, POH2K, PO4HNa2 y
glucosa. Otros elementos esenciales, tales como el hierro, manganeso y cobre, en
general están presentes en cantidades suficientes para el crecimiento, como
contaminantes de los productos químicos. La glucosa proporciona energía y una
fuente de carbono y el cloruro de amónico sirve como fuente de nitrógeno. Un
heterótrofo más exigente, carente de las posibilidades sintéticas de E. coli, podría
requerir la adición de varias vitaminas, aminoácidos, purinas y Pirimidinas.
Los medios de cultivo deben de estar ajustados a un pH adecuado. Esto se
suele hacer antes de la esterilización, aunque a veces debe realizarse a
continuación de la esterilización.
Los medios de cultivo sólidos incluyen algún agente solidificante. Roberto
Koch (1843-1910), introdujo el uso del agar, este se obtiene de las algas marianas
de la familia Rhodophyceae. El agar tiene la propiedad de ser soluble en agua,
presentar resistencia a la actividad de la mayoría de los microorganismos, tiene un
punto de fusión a los 98°C y solidifica entre los 42 a 45°C.
La concentración de agar en los medios de cultivo sólidos es del 1.5% y en
los medios semisólidos del 0.3 al 0.5%. Estos medios pueden disponerse en
tubos o cajas petri aunque comúnmente los medios semisólidos los tubos se
colocan en tubos.
Según el propósito para lo que son fabricados los medios de cultivo, se pueden
clasificar en:
1. Medios Basales. Básicos o Generales:
Son medios simples que contienen en general los nutrientes esenciales

para promover el desarrollo a microrganismos poco exigentes
nutricionalmente “in vitro” algunos ejemplos son: Agar Nutritivo (A.N.),
16
Caldo Nutritivo (C.N), Agar Soya Triptosa (T.S.A.), Caldo Soya Tripticasa
(T.S.C), Caldo Cerebro Corazón (B.H.I.), etc.
2. Medios Enriquecidos:
Son medios que han sido complementados con otros nutrientes, que
proporcionan “Factores de crecimiento” y cuya finalidad es promover el
desarrollo de microorganismos de requerimientos nutricionales más
exigentes (tal es el caso de aquellos medios de cultivo destinados para el
aislamiento de microorganismos patógenos del hombre y animales). En
esta clasificación se encuentran: Gelosa Sangre (G.S.) que es medio basal;
Agar Soya Tripticasa o Agar base para Sangre, adicionado de sangre de
ovino u otra especie. Gelosa Chocolate (G.Ch.) al igual que el medio
anterior ocupa sangre en su elaboración a diferencia de que esta se
adiciona cuando el medio tiene una temperatura de 80°C, con lo que se
logra la liberación de ciertas sustancias contenidas en los eritrocitos, que
son lisados debido a la acción del calor.
3. Medios Selectivos o Inhibitorios:
Cuando una muestra contiene una contiene gran cantidad de M.O., su

crecimiento puede ser excesivo, por lo que es necesario suprimir su
desarrollo y al mismo tiempo promover y/o seleccionar el crecimiento de los
M.O. patógenos que pudieran encontrarse en dicha muestra. Ejemplo: Agar
Verde Brillante (A.V.B.), Agar Salmonella-Shigella (S.S), selectivos para
Salmonella y Shigella. El Agar Staphylococcus 110 (S-110), Agar Sal y
Manitol (M.S.A.), Agar Baird-Parker (B-P.A) y el Agar Chapman sirven para
Staphylococcus aureus fundamentalmente.
Se logra un medio selectivo variando la temperatura, Atmósfera, pH, o

adicionando antibióticos al medio cumpliendo con el mismo propósito
anteriormente mencionado.
4. Medios diferenciales:
Contienen sustancias químicas o indicadores que permiten identificar con

facilidad algunos géneros o especies bacterianas por el aspecto
característico de las colonias y su capacidad bioquímica. Ejemplo: Las
Pruebas Bioquímicas.
5. Medios de Enriquecimiento:
17
Son muy utilizados en bacteriología del tracto intestinal. Son generalmente

caldos que poseen un efecto inhibitorio sobre géneros bacterianos
favoreciendo al mismo tiempo el desarrollo de otro que interesa más.
Ejemplo: Caldo Selenito, Caldo Tetrationato, Caldos selectivos para
Salmonella. Caldo Steptocel para recuperación de Streptococcus.
6. Medios de Transporte:
Sirven para mantener viables a los M.O. por un lapso corto de tiempo y que
posteriormente deseamos recuperar. Este tipo de medios contienen una
capacidad amortiguadora que facilita dicha viabilidad del M.O. sin que se
multiplique, pero que permanezca latente. Ejemplo: Cary-Blair (para Vibrio
cholerae), Stuart (para muchos M.O. de vías respiratorias), etc.
7. Medios para Conservación:
Son medios de cultivo por lo general medios basales, destinados para el

mantenimiento de bacterias, por ejemplo: Agar Base Sangre, pero sin
sangre, para no hacerlo enriquecido (B.A.B.), Agar Soya Tripticasa (T.S.A.),
Agar Casoy, etc., estos medios deben estar desprovistos de carbohidratos,
esto es con el propósito de que el medio no se acidifique y las bacterias no
mueran; así como cuando también se desea ensayar pruebas posteriores
que de alguna manera afectarían por la presencia de esos azúcares. Para
ciertas bacterias más exigentes algunos de estos medios llevan como
complementos nutricionales para que el M.O. sea viable. Cuando se tiene
perfectamente bien aislada e identificada una bacteria y se desea conservar
empleando uno de estos medios y dependiendo del M.O. durarían en
conservación de varias semanas, o uno y hasta seis meses.
MATERIAL:
1. Agar base para sangre.

2. Agar nutritivo.
3. Caldo nutritivo.
4. SIM ó MIO (semisólido)
5. Bolsa de sangre.
6. Balanza granataria.
7. Matraces Erlenmeyer de 250 ml.
8. Probeta de 100 ml.
9. Tubos de ensaye.
10. Cajas de Petri.
18
11. Mechero de Bunsen.

12. Agua destilada.
MÉTODOLOGÍA.
Agar Sangre.
 Preparar 50 ml de Agar Base de sangre, según especificaciones del frasco.
Esterilizar a 121°C por 15 min a 1 lb de presión. Una vez estéril enfriar el
medio y cuando tenga una temperatura aproximada de 45°C agregar sangre
de cordero o humana de modo que quede al 5%. Agitar suavemente y vaciar
en cajas de Petri estériles, dejar solidificar y almacenar de 4° a 8° C.
Agar Chocolate.
 Preparar 50 ml de Agar Base de sangre, según especificaciones del frasco.
Esterilizar a 121°C por 15 min a 1 lb de presión. Una vez estéril enfriar un
poco el medio a una temperatura aproximada de 85°C y agregar sangre de
cordero o humana de modo que quede al 5%. Agitar para lisar los eritrocitos
y liberar los componentes, posteriormente vaciar en cajas de Petri estériles.
dejar solidificar y almacenar de 4° a 8° C.
Agar nutritivo.
 Preparar 65 ml de Agar Nutritivo como lo indica el frasco. Calentar hasta

disolver completamente y esterilizar a 121°C por 15 min a 1 lb de presión.
Vaciar el medio en cajas de Petri estériles. Dejar solidificar. dejar solidificar y
almacenar de 4° a 8° C.
Caldo nutritivo.
 Preparar 20 ml de caldo nutritivo como lo indica el frasco. Calentar hasta
disolver completamente. Verter aproximadamente 5 ml del medio a 3 tubos
de ensaye, colocar tapón y esterilizar a 121°C por 15 min a 1 lb de presión.
Dejar enfriar y almacenar de 4° a 8°C.
Medio MIO.
 Preparar 20 ml de caldo MIO como lo indica el frasco. Calentar hasta disolver
completamente. Verter aproximadamente 5 ml del medio a 3 tubos de
ensaye, colocar tapón y esterilizar a 121°C por 15 min a 1 lb de presión.
Dejar enfriar y almacenar de 4° a 8°C.
19
ACTIVIDADES.
Realizar una secuencia esquematizada de todos los pasos que hiciste para la
preparación de cada uno de los medios de cultivo, el inicio de la secuencia
comienza desde que lees las instrucciones del frasco y realizas las ecuaciones
para el pasaje, y finaliza en el transporte para almacenar los medios de cultivo.
(Puedes ir colocando observaciones que sean importantes al ir preparando los
medios).
CUESTIONARIO.
1. Defina, ¿Qué es un medio de cultivo?
2. Menciona los diferentes tipos de medios de cultivo y escribe dos ejemplos
de cada uno.
3. ¿A qué temperatura solidifica el Agar?
4. ¿Qué sucede si se tapa la caja de Petri inmediatamente de vaciar el medio
de cultivo? ¿Podría sembrarse rápidamente?
5. ¿Qué sucede si el medio está muy frío y se desea vaciar?
6. Diferencie los términos: Desarrollo y Crecimiento.
CONCLUSIONES.
BIBLIOGRAFÍA.
20
PRACTICA No. 4
CONTAMINACIÓN AMBIENTAL Y MORFOLOGIA COLONIAL.
OBJETIVOS.
 Comprobar la existencia de microorganismos en el ambiente los cuales
contaminan los medios de cultivo si no se trabaja de manera adecuada al
momento de prepararlos y manejarlos.
 Observar, familiarizarse y aprender a distinguir las formas de crecimiento de

las bacterias y otros microorganismos, según el medio en el que se
desarrollan.
 Identificar los componentes del medio que proporcionan las características

de desarrollo de un microorganismo.
INTRODUCCIÓN.
Al manejar microorganismos en el laboratorio de Microbiología, debe considerarse
la existencia en el medio ambiente de diversas formas microscópicas de vida, que
se pueden instalar rápidamente en aquellas áreas que las provean de sustancias
nutritivas para lograr su desarrollo.
De lo anterior, se desprende que los medios de cultivo preparados en el
laboratorio cumplen con un propósito en particular. Siempre debe tenerse en
cuenta que en el medio ambiente se encuentran microorganismos que pueden
contaminar los medios de cultivo si no se trabaja en forma adecuada en el
laboratorio.
Los factores que pueden provocar dicha contaminación pueden ser:
a) Corrientes de aire.
b) Hablar en el área de trabajo.
c) Trabajar fuera de la zona estéril.
d) Manipular incorrectamente los utensilios de trabajo.
e) Esterilización inadecuada de medios de cultivo, etc.
En la naturaleza no encontramos aislado un solo tipo de microorganismos, por ello
cuando se examinan los microorganismos asociados o presentes en un animal,
planta, suelo, agua o alimento se encuentran una gran variedad. Solo raramente
21
se encontrarán un solo tipo de microorganismos. Si se quiere trabajar con un

cultivo puro, deben obtenerse colonias aisladas o separadas.
La observación cuidadosa de las colonias muestra que estas varían en apariencia.
Una colonia microbiana está constituida por individuos de la misma especie
provenientes de una célula o de un grupo de ellas.
Por definición un buen aislamiento en placa es aquel que nos da colonias aisladas,
con una distancia que permita distinguir y describir la morfología colonial que
incluyen:
1. Tamaño. Se describe en milímetros del diámetro y puede variar desde
colonias extremadamente pequeñas que miden apenas una fracción de
milímetros hasta aquellas que llegan a medir 10 mm o más. Algunas
especies bacterianas pueden extenderse en toda la superficie de la caja.
2. Color. Las colonias pueden tener varios colores, debido a pigmentos
propios o absorción de algunas sustancias del medio.
3. Forma. Pueden ser circulares, filamentosas, regulares, puntiformes, entre
otras. Las colonias puntiformes se caracterizan por ser muy pequeñas por
lo que no se pueden distinguir el resto de sus características y otras en las
que se pueden definir.
4. Bordes. Pueden ser enteros o mostrar irregularidades como lóbulos,
filamentos, proyecciones como dientes de sierra o enrollados.
5. Elevación. La colonia puede ser plana o elevada, esta última a su vez
puede ser convexa, pulvinada, umbonada, crateriforme o umbilicada.
6. Superficie. Puede ser lisa, rugosa o granular.
7. Aspecto. Puede ser húmedo o seco.
8. Luz reflejada. Puede ser brillante o mate.
9. Luz transmitida. Puede ser transparente, traslúcida u opaca.
10. Producción de pigmento. Algunas bacterias producen pigmento soluble
en agua, que puede difundir el medio de cultivo.
11. Consistencia. Dura o suave, esta ultima puede ser butirosa, mucoide o
friable. Esta característica se determina tocando la colonia con el asa y por
lo tanto debe ser la última en describirse.
12. Otras. En ciertos medios de cultivo el crecimiento bacteriano ocasiona
cambios visibles alrededor de la colonia, como la hemólisis en gelosa
sangre. Acidificación que se manifieste con indicador de pH incorporado al
medio de cultivo y otros efectos similares.
Con la experiencia en la observación de cultivos, las características de morfología
colonial vienen a constituir una guía muy útil en el reconocimiento de los
principales grupos de microorganismos, y también permite en muchos casos
corroborar la pureza de un cultivo o alertar sobre posible contaminación.
22
MATERIAL.
Medios de cultivo preparados en la práctica anterior (cajas con G.CH, G.S y G.N).
METODOLOGÍA.
Sesión 1.
1. Tomar las cajas de G.CH, de G.S y de G.N, posteriormente contaminar.
 Ejemplos:
o Tosa sobre una de las cajas.
o Dejar 20 min destapada en algún espacio del laboratorio.
o Hablar cerca de una caja.
o Llevar al área de los baños.
o Llevar a la cafetería.
o Presionar ligeramente con los dedos una placa.
o Tomar un pedazo de kleenex o cualquier objeto que haya
tenido de su casa y colóquelos sobre el medio.
2. Rotular placas e incubar todas las cajas a 35°C/ 24 h y reportar resultados.
Sesión 2 (Reporte).
MORFOLOGIA COLONIAL
OBJETIVO.
Conocer las diferentes morfologías coloniales que presentan las colonias
bacterianas y aprender que cada una de ellas tiene características peculiares.
INTRODUCCION.
La evaluación inicial de la morfología colonia en las placas de cultivo primarias es
muy importante. Los laboratorios pueden proporcionar a los médicos información
preliminar con respecto a los resultados del cultivo del paciente, Esta información
también es significativa para determinar los pasos posteriores para la identificación
y caracterización definitivas del microorganismo. De acuerdo a los distintos medios
de cultivo cada grupo de microorganismos presenta una morfología colonial
característica.
23
En el siguiente esquema se muestra algunas propiedades de crecimiento de las

colonias:
Figura 4.1 Morfología colonial macroscópica.
ACTIVIDADES.
1. Comprobar el crecimiento en los medios de cultivo.

2. Seleccionar dos colonias de cada medio de cultivo.
3. Identificar las características macroscópicas de las colonias
seleccionadas y reportar en la tabla 4.1.
4. Realizar esquemas de las placas que muestran crecimiento bacteriano.
TABLA.4.1.
Cultivos. Agar: Agar: Agar:
1 2 1 2 1 2
Propiedades.
Colonia completa.
Tamaño.
Color.
Pigmento.
Borde.
24
Elevación.
Superficie.
Aspecto.
Luz reflejada.
Luz transmitida.
Consistencia.
ESQUEMAS.
AGAR:_____________________ AGAR:_____________________
AGAR:_____________________ AGAR:_____________________
AGAR:_____________________ AGAR:_____________________
25
CUESTIONARIO.
1. ¿De qué naturaleza biológica son los microorganismos contaminantes?
2. ¿Qué otros factores considera usted que pueden ser causa de la
contaminación de tipo ambiental que afecten los medios de cultivo?
3. ¿Podría existir el riesgo de contaminación cuando no se lleve a cabo una
buena esterilización?
4. ¿De los medios de cultivo que preparo, cual considera que es el que más
riesgo de contaminación se expondría?
CONCLUSIONES.
BIBLIOGRAFIA.
26
PRÁCTICA No. 5
SIEMBRA Y DESARROLLO EN DIFERENTES MEDIOS DE CULTIVO.
OBJETIVO: Conocer los métodos de inoculación empleados en los medios de

cultivos líquidos, semisólidos y sólidos, así como las condiciones necesarias para
la obtención de cultivos puros.
INTRODUCCIÓN.
En la naturaleza, los microorganismos generalmente no se encuentran aislados
sino integrados en poblaciones mixtas, tal como se encuentran en una muestra
biológica. Cuando estas mezclas de microorganismos se siembran en los medios
de cultivos adecuados, se obtienen cultivos mixtos. Para llevar a cabo el estudio
de estos microorganismos y de sus propiedades, es necesario separar unos de
otros y trabajar con especies aisladas, obteniendo cultivos puros o axénicos. El
primer problema en la identificación de una bacteria resulta ser su aislamiento del
resto de microorganismos presentes en la muestra. Una vez que se ha logrado el
aislamiento es posible obtener la bacteria de interés en cultivo puro.
En la preparación de cultivos puros o axénicos a partir de una población
microbiana mixta, se utilizan las denominadas técnicas de aislamiento, que fueron
desarrolladas durante el siglo XIX.
Para efectuar el estudio de los microorganismos una vez aislados, se han
diseñado diversos métodos que permiten cultivarlos bajo condiciones artificiales,
en los que es posible obtenerlos bajo condiciones experimentales y manejar un
solo tipo de microorganismo.
Siembra y aislamiento.
Sembrar es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un medio
adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, para su desarrollo y
multiplicación, de forma que se logre la separación de un determinado
microorganismo (patógeno) del resto que lo acompaña (biota normal) para obtener
un cultivo puro. Una vez sembrado, el medio de cultivo se incuba a una
temperatura adecuada para el crecimiento. Ningún proceso en el diagnóstico
microbiológico y sanitario es tan importante como el utilizado para obtener cultivos
puros de los microorganismos.
El procedimiento para el aislamiento más utilizado es la siembra por estría sobre
un medio sólido adecuado, para ello se toma una pequeña cantidad de inóculo con
27
ayuda del asa bacteriológica y se reparte sobre la superficie del medio de cultivo.
En el medio quedan separadas e inmovilizadas las células bacterianas. El
resultado de la siembra por lo tanto se denomina cultivo.
Las bacterias necesitan para su crecimiento de los nutrientes esenciales que se
proveen en un medio de cultivo, además requieren de condiciones adecuadas de
acidez (pH), presión osmótica y atmósfera; entre algunos.
Después del periodo de incubación en condiciones adecuadas, cada célula viable
ha de dar lugar a una colonia visible resultado de sucesivas divisiones celulares.
Cada colonia bacteriana posee características particulares en su forma, borde,
elevación, tamaño, consistencia, entre otras.
Para efectuar la siembra o aislamiento, se requiere trabajar asépticamente a fin de
evitar la incorporación de microorganismos contaminantes. Se precisa que todo el
material de vidrio, los medios de cultivo y los dispositivos de inoculación como las
asas bacteriológicas sean estériles.
Los diversos tipos de bacterias presentes en la muestra original es visualizan
como colonias diferentes en el medio de cultivo y es posible obtener un cultivo
puro de cada uno de los tipos de bacterias presentes en la muestra original. A
partir de un cultivo puro se procede a realizar los estudios bioquímicos y
serológicos pertinentes para hacer la identificación de género y especie.
Las siembras pueden ser:
• Primarias, cuando el material biológico es inoculado en los medios por
primera vez.
• Secundarias. El inóculo proviene de una siembra primaria.
Esterilización del asa bacteriológica

Las asas bacteriológicas básicamente son alambres unidos a un mango que
permite manipularlas y pueden ser de diferentes materiales como fierro, nicrón,
platino, etc. Varían también en su forma, pudiendo ser de punta o de aro; y se
utilizan dependiendo de las características de los medios de cultivo y del tipo de
estudio a realizar. Las asas bacteriológicas se esterilizan por calor seco con la
flama del mechero antes y después de realizar la siembra con el objetivo de
destruir a los microorganismos de la superficie. Para efectuar la esterilización del
asa se siguen las siguientes indicaciones:
• Encender el mechero, ajustar la flama del mechero a que quede
completamente azul.
• Tomar el asa bacteriológica por el mango y colocarla en posición diagonal a
la flama del mechero en la zona de oxidación en un ángulo de 45°
28
aproximadamente; se inicia el calentamiento por la base del mango y se

termina en la punta. Para asegurar la esterilización del asa, el alambre de
debe calentarse hasta que quede al rojo vivo. Posteriormente se deja
enfriar cerca del mechero, en la zona estéril, antes de tomar el inóculo.
Medidas generales para la inoculación de medios de cultivo.

• Para realizar el procedimiento de inoculación de medios en tubo, se
deberá tomar los tubos con la mano izquierda (derecha, en caso de
ser zurdo). Manipular de la misma forma en el caso de placas de
Petri con gelosa.
• Quitar los tapones con la mano derecha utilizando los dedos
meñique y anular, con esta misma mano habrá de sostener el asa
durante la inoculación.
• Nunca dejar los tapones sobre la mesa.
• Flamear con el mechero la boca de los tubos y matraces una vez
que se han abierto y antes de colocarles su tapón nuevamente para
evitar contaminaciones.
• Trabajar en condiciones asépticas cerca del mechero,
independientemente del tipo de medio y del método de siembra. El
calor emitido por la flama reduce el número de microorganismos
presentes en las inmediaciones.
• No hablar ni toser al ejecutar el procedimiento.
29
MÉTODOS DE SIEMBRA.
El método de siembra a emplear dependerá de los objetivos que se pretendan
alcanzar con el cultivo, ya que en ocasiones se requiere que el desarrollo de los
microorganismos se produzca en forma masiva, mientras que en otras resulta
indispensable que las colonias queden aisladas o que las manifestaciones del
metabolismo tengan lugar con tensiones reducidas o privadas de oxígeno.
Para el aislamiento de microorganismos se cuenta con varios procedimientos,
entre los que figuran:
• Siembra por estrías: Aquí se incluyen los métodos de estría cruzada, estría
simple y estría en costilla (para recuentos semicuantitativos).
• Vaciado en placa (Pour plate).
• Diluciones (extensión con varilla).
• Procedimiento de Petrifilm.
Inoculación de placas Petri con gelosa con siembra por estría.

Ofrece un método práctico para obtener cultivos puros. Pueden prepararse las
cajas con anterioridad y mantener en el refrigerador hasta que se utilicen. La
superficie de la agarosa debe estar libre de agua de condensación antes de
sembrarse esto puede lograr invirtiendo la caja y destapándola.
Cuando una célula aislada e inmóvil comienza a crecer sobre un substrato sólido,
el resultado del crecimiento al cabo del tiempo es una colonia. Por consiguiente,
se denomina unidad formadora de colonia (UFC) a una célula bacteriana viva y
aislada que si se encuentra en condiciones de substrato y ambientales adecuadas
da lugar a la producción de una colonia en un breve lapso de tiempo.
Estría cruzada. La superficie de los medios de agarosa en placas de Petri puede
inocularse con la muestra por medio de varios métodos. La inoculación primaria
puede hacerse con un asa, hisopo u otros dispositivos. El procedimiento de estría
cruzada consiste en depositar en un área de la placa de gelosa, una asada de la
muestra o cultivo mixto que sirve de inóculo, se extiende el inóculo con el asa
haciendo varios trazos en forma de zigzag de la orilla hacia el centro pero
solamente a una distancia de 1 a 2 cm de la orilla. Se esteriliza el asa, se deja
enfriar o se introduce en el medio en un lugar que no interfiera con las siguientes
estrías. Se gira la caja de Petri 1/5 de vuelta y con el asa esterilizada se hace una
serie de estrías que deben extender una pequeña porción de la primera serie en
forma similar con trazos que vayan de la orilla hacia el centro. La operación se
repite dos veces más y en la quinta se hace una serie de estría abiertas que
terminen en o cerca del centro, cuidando que no se toquen las estrías anteriores.
30
Estría simple. En éste procedimiento se toma la muestra con el asa previamente

esterilizada y se extiende sobre la superficie de la placa de gelosa haciendo
movimientos rectos en zigzag.
Estría en costilla. El procedimiento se aplica cuando se requiere hacer un estudio
de tipo semicuantitativo; para ello se requiere tomar muestra con un asa calibrada
para contener 0,01 o 0,001ml de muestra de orina no centrifugada. Se toma una
asada de la muestra y esta de inocula en la superficie de la placa con gelosa
haciendo una línea recta, posteriormente se hace la diseminación del inóculo
haciendo un primeramente un giro de 90° y luego se hace sobre la línea primaria
de inoculación una estría simple hasta cubrir toda la superficie de la gelosa.
Patrones de estrías para inocular placas para aislamiento de colonias bacterianas.
Estría masiva. Puede realizarse con hisopo cuando se trata de cultivos primarios.
Se coloca en inóculo en un punto de la periferia de la superficie del agar y se
procede a realizar la diseminación del inóculo con el asa haciendo estrías con
escasa separación entre ellas, se gira la placa de Petri 90° y se realiza el mismo
procedimiento.
31
Inoculación de tubos con medio de cultivo.

Inoculación de tubos con medio de cultivo en plano inclinado. Los tubos de
ensaye en plano inclinados o pico de flauta se inoculan utilizando el asa en punta,
se toma muestra de colonia y se atraviesa el fondo de la agarosa, se saca la aguja
tratando procurando sacarla del medio por el sitio de inoculación. Se termina la
inoculación del medio con una estría simple con el alambre de inoculación y luego
se realiza una estría simple, algunos medios no requieren de la estría en la
superficie.
Pasos para la inoculación de tubos con medio en plano inclinado.
Inoculación de tubos con medio semisólido.

Cuando se siembra un medio semisólido en un tubo para pruebas de motilidad, es
importante que el alambre de inoculación sea retirado a largo de la línea de la
picadura inicial, ya que un movimiento en abanico dará lugar a un patrón de
crecimiento en la línea de picadura que pueda interpretarse como motilidad
bacteriana. Importante es que el asa no se inserte hasta el fondo del tubo.
32
Inoculación de tubos con medio líquido. Se toma el asa y se inserta en el

medio líquido, se disemina el inóculo rotando el asa de izquierda a derecha sobre
el eje del asa. Técnica de inoculación con asa suspendida.
Vaciado en placa. Este método proporciona por lo general placas con un número
apropiadode colonias y se basa en la dilución semicuantitativa de la muestra
original en un medio sólido.
Diluciones. Este método consiste en realizar dilucioes seriadas sucesivas de la
muestra con el objetivo de sembrar después cantidades conocidas de estas
diluciones en placas de Petri. Este método permite conocer el número de
microorganismos viables. La viabilidad en microbiología se define como la
capacidad del microorganismo para multiplicarse en un medio de cultivo.
Características de crecimiento de los medios sólidos.
33
 Crecimiento en medios líquidos.
1. Sin crecimiento.
2. Turbio.
3. Floculante.
4. Membrana o velo.
5. Membrana con anillo.
 Crecimiento en presencia de oxígeno.
1. Aerobio estricto.
2. Anaerobio estricto.
3. Facultativo.
4. Microaerófilo.
5. Aerotolerante (anaerobio).
34
Material.
1. Cepa problema 1: Escherichia coli.
2. Cepa problema 2: Staphylococcus aureus.
3. Cepa problema 3: Bacillus subtilis.
4. 1 caja de Petri con Gelosa Nutritiva (G.N.).
5. 1 caja de Petri con Gelosa Base Sangre (G.S.).
6. 1 caja de Petri con Gelosa Chocolate (G.Ch.).
7. 2 tubos de ensaye con medio semisólido Movilidad-Indol-Ornitina (M.I.O.) o
medios SIM.
8. 3 tubos de ensaye con caldo nutritivo (C.N.) o de caldo infusión-cerebro-
corazón. (B.H.I).
9. 3 tubos con gelosa nutritiva en plano inclinado.
10. Asa bacteriológica de punta.
11. Asa bacteriológica de aro.
12. Mechero Bunsen.
13. Tapones de algodón.
14. Cinta masking.
15. Encendedor.
16. Marcador.
Métodología.
Medidas generales:
 En todos los casos para la inoculación, esterilizar previamente el asa
bacteriológica en el mechero, y dejarla enfriar antes de tomar muestra.
 Trabajar cerca del área aséptica del mechero.
 Las formas de inoculación que se utilizarán en la práctica se describen
claramente en la introducción.
 Flamear la boca de los tubos antes y después de inocularlos, tapar
inmediatamente.
 De las placas con cepas problema tomar colonias aisladas para inocularlas
en los medios.
 En el caso de las placas de Petri, colocarlas con las tapas hacia abajo.
 Rotular tubos y placas antes de entregarlos.
 Incubar a 35°C por 24 horas y reportar resultados.
 Realizar una secuencia esquematizada de todos y cada uno de los pasos
anotando también las observaciones de los procedimientos realizados.
35
Inoculación de placas con gelosa nutritiva.

1. Tomar la placa de G.N. e inocularla con la cepa problema 1 mediante estría
masiva, usar el asa bacteriológica de aro previamente esterilizada,
realizar el procedimiento de acuerdo a las indicaciones anteriormente
descritas.
2. Enseguida inocular la placa de G.S. utilizando el método de estría cruzada
con el asa de aro empleando muestra de la cepa problema 2.
3. Por último, inocular la placa con gelosa chocolate con la cepa problema 3
utilizando el método de estría simple.
4. Identificar claramente todas placas escribiendo en la base de cada una el
nombre del M.O. con que lo inoculó, la sección, fecha y procedimiento a
realizar en este caso, incubación.
5. Entregar las placas para su incubación a 35°C por 24 horas y reportar
resultados.
Inoculación de tubos con medio semisólidos.

1. Rotular dos tubos de medio MIO o SIM y enumerándolos de manera
consecutiva.
2. Utilizando el asa bacteriológica de punta previamente esterilizada, tomar
muestra de la placa con la cepa problema 1.
3. Destapar el tubo marcado como 1.
4. Flamear la boca del mismo en el mechero.
5. Inocular la muestra en el tubo por la técnica de picadura introduciendo el
asa de forma verticalmente sin llegar hasta el fondo del tubo (introducir
aproximadamente hasta ¾ partes del medio), y retirar el asa de tal forma
que salga por el mismo camino de la picadura inicial.
6. Flamear el tubo nuevamente.
7. Colocar el tapón.
8. Esterilizar el asa.
9. Tomar el tubo 2 e inocularlo con la cepa problema 2 siguiendo los pasos del
4 al 8.
10. Al terminar, identificar cada uno de los tubos escribiendo en su etiqueta el
realizar en este caso, incubación a 35°C por 24 horas y reportar resultados.
Inoculación de tubos con medios líquidos.

1. Tomar 3 tubos de caldo nutritivo o caldo BHI y enumerarlos de manera
consecutiva.
36
2. Utilizando el asa bacteriológica de aro previamente esterilizada, tomar

5. Inocular la muestra en el tubo por la técnica de inoculación con asa
suspendida introduciendo el asa de forma verticalmente y una vez en el
centro rotar el asa de izquierda a derecha hasta que se suspenda el inóculo
en el medio.
4 al 8.
10. Inocular el tubo 3 con la cepa problema 3, seguir metodología de los pasos
4 al 8.
Inoculación de tubos con medio sólido en pico de flauta.

1. Rotular cada uno de los tres tubos con gelosa nutritiva, enumerándolos
consecutivamente.
2. Utilizando el asa bacteriológica de punta previamente esterilizada, tomar
5. Inocular la muestra en el tubo primeramente por la técnica de picadura
introduciendo el asa de forma verticalmente sin llegar hasta el fondo del
tubo (introducir aproximadamente hasta ¾ partes del medio), y retirar el asa
de tal forma que salga por el mismo camino de la picadura inicial.
6. Sin esterilizar el asa, realizar una estría simple sobre la superficie del
pico de flauta iniciando por la base del pico y terminado en el extremo
cercano a la boca del tubo.
4 al 9.
37
11. Inocular el tubo 3 con la cepa problema 3, seguir metodología de los pasos
4 al 9.
REPORTE DE RESULTADOS.
1. Dibujar al crecimiento observado en las cajas de Petri con gelosa nutritiva

después de la incubación.
Estría cruzada. Estría simple. Estría masiva.
M.O:___________________ ___________________ _________________
2. Seleccionar una colonia aislada de cada uno de los microorganismos que

se sembraron en la práctica y realizar la evaluación de la morfología
colonial.
Características a evaluar en la Microorganismo:

morfología colonial: E. coli S. aureus B. subtillis
Forma.
Tamaño.
Color.
Pigmento.
Borde.
Elevación.
Superficie.
38
Aspecto
Luz reflejada.
Luz transmitida.
Consistencia.
Otros.
Crecimiento en tubos de medios semisólidos.
Medios MIO o SIM.
Características a evaluar en Microorganismo:

los medios semisólidos: E. coli S. aureus B. subtillis
Medio Movilidad.
MIO o Línea de picadura.
SIM. Pigmento.
Crecimiento en tubos con medios líquidos.
39
Tubos con caldo B.H.I. o caldo nutritivo.

los medios líquidos: E. coli S. aureus B. subtillis
Película.
Turbidez.
Sedimento.
Pigmento.
Otros.
Crecimiento en tubos con gelosa en plano inclinado.
Tubos con medio B.A.B en plano inclinado.

los medios líquidos: E. coli S. aureus B. subtillis
Cantidad de crecimiento.
Pigmento.
Forma del crecimiento.
Consistencia.
Otros.
40
CUESTIONARIO.
1. Mencione la utilidad de los siguiente métodos de aislamiento:
 Estría.
 Dilución por vaciado en placa.
 Dilución por extensión por varilla.
2. ¿Por qué es importante el método de la estría cruzada para verificar la
pureza de un cultivo?
3. ¿Por qué las cajas de Petri con un medio de cultivo sólido deben incubarse
con la tapa hacia abajo?
4. ¿Por qué es importante lograr un buen aislamiento de las colonias?
5. Menciona cuál es el área de esterilidad que proporciona el mechero
Bunsen.
OBSERVACIONES.
CONCLUSIONES.
BIBLIOGRAFÍA.
41
Segundo bloque de evaluación.

Práctica No. 6. Microscopia.
Práctica No. 7. Tinción simple. (Forma y tamaño).
Práctica No. 8. Tinción diferencial Gram.
Práctica No. 9. Tinción diferencial de Zielh Neelsen.
Práctica No. 10. Tinción selectiva. (Cápsula y esporas).
.
42
PRÁCTICA No. 6.
MICROSCOPÍA.
OBJETIVO.
Conocer los principios básicos y la importancia de la microscopia como
herramienta fundamental en el campo de la Microbiología.
INTRODUCCIÓN.
La Microbiología es una disciplina que se ocupa de organismos tan pequeños que
el ojo humano no puede observarlos a simple vista, por esta razón dentro de la
práctica de los procesos microbiológicos se hace indispensable el uso y manejo
del microscopio. Para los químicos del área de microbiología es fundamental
conocer y comprender el funcionamiento del microscopio.
La microscopía se define como el empleo de un microscopio para aumentar de
tamaño (agrandamiento visual) objetos demasiado pequeños.
La microscopia ocupa un lugar central en el laboratorio. Los microscopios y
métodos de observación por microscopio son varios, los tipos de microorganismos
a detectar, identificar y caracterizar determinan los tipos de microscopia más
apropiados a ampliar.
A continuación de describen algunas de las aplicaciones de la microscopia en el
diagnóstico microbiológico.
 Identificación preliminar rápida de los microorganismos por la visualización
directa en muestras del paciente.
 Identificación final rápida de ciertos microorganismos por visualización
directa en las muestras del paciente.
 Detección de diferentes microorganismos presentes en la misma muestra
 Detección de microorganismos no cultivables con facilidad en el laboratorio.
 Evaluación de muestras del paciente para la presencia de células
indicadoras de inflamación o contaminación.
 Determinación de la importancia clínica de un microorganismo.
 Proporciona información previa a los cultivos acerca de qué tipos de
microorganismos podrían esperarse en los cultivos de modo tal que sean
utilizadas las técnicas de cultivo apropiadas.
43
 Determina qué pruebas y métodos deberían utilizarse para identificar y

caracterizar los microorganismos cultivados.
 Proporciona un método para la investigación no habitual o resultados de
pruebas de laboratorio no esperados.
Las dimensiones de las bacterias patógenas son aproximadamente de 0.4 a 4.0

µm. El examen por microscópico ocular, la luz blanca, necesita de dispositivos que
den un aumento de 1000 a 2000 veces.
El microscopio.
El microscopio se compone de una parte mecánica y una óptica:
Parte mecánica.
La base del microscopio, suficientemente pesada para ser estable, soporta la
platina fija, sobre la que se coloca la preparación a observar. La preparación se
mantiene por un carro, con desplazamientos rectangulares, con un vernier. En
algunos aparatos la platina puede tener desplazamientos verticales gracias a una
cremallera (tornillos macro y micrométricos) que regulan la puesta a punto. En
otros casos la platina solo se desplaza horizontalmente.
El brazo, es una parte rígida que soporta el dispositivo porta-ocular y el revólver o

porta-objetivos. En el microscopio monocular los dos dispositivos están separados
por un tubo, de manera que la distancia entre el ocular y el objetivo sea de 170
mm. En los binoculares, un sistema de prismas reemplaza al tubo.
El dispositivo porta-ocular es un tubo simple en el monocular o en el binocular, es
donde se encuentran los prismas. Los dos oculares se pueden desplazar de
acuerdo a la distancia entre ambas pupilas del observador, y además uno de los
oculares es móvil sobre su eje para corregir las diferencias de convergencia entre
los dos ojos.
El porta-objetivo o revólver, permite su desplazamiento por rotación y permite
sustituirlos. Bajo la platina se encuentra el porta-condensador móvil, conteniendo
el diafragma. Debajo de él, un espejo permite regular la fuente luminosa.
Parte óptica.
La fuente luminosa, es de filamento de Túngsteno. El espejo, que tiene una cara
plana y la otra cóncava, debe, a partir de una fuente luminosa, enviar un haz de
rayos paralelos al eje óptico del microscopio.
44
El condensador, es una lente que enfoca la luz en el preparado permitiendo la

formación de un cono con el vértice en el preparado y la base en el lente frontal
del objetivo. La entrada de luz se regula con el diafragma iris. El diámetro de
abertura del diafragma depende del campo y debe coincidir con él.
La abertura de luz debe ser menor a la abertura del objetivo usado. Se regula por
medio de diafragmas anulares.
Los objetivos, sus características son:

a) Apertura Numérica (AN). Seno del semi-ángulo máximo formado por los
rayos que pueden penetrar en el lente frontal del objetivo.
𝐴𝑁 = 𝑛 ∙ 𝑠𝑒𝑛 ∙ 𝜃 ∝
n= índice de refracción del medio a través del cual pasa la luz desde el
porta al objetivo.
b) Aumento. Agrandamiento de la imagen introducida por el objetivo. El

objetivo produce una imagen real del preparado, dentro del microscopio. El
aumento se mide en diámetros (x). hay objetivos de 10x, 25x, 40, y 100x
(inmersión).
45
c) Corrección de aberraciones. Para formar una imagen clara, el lente debe

enfocar cada rayo de luz desde un punto del preparado dando un punto de
la imagen. Cuando esto falla, se llama aberración.
Las dos principales aberraciones son:

La aberración cromática, que separa los componentes del espectro.
La aberración esférica, que separa los puntos de la imagen en su

distancia de la lente.
Para corregirlas se han desarrollado objetivos especiales:

 Objetivos acromáticos, que corrigen las aberraciones cromáticas para las
longitudes de onda de máxima sensibilidad visual.
 Objetivos apocromáticos, que no presentan aberración cromática en toda
la escala del espectro visible, siempre que haya una distancia óptima entre
el objeto y la lente del objetivo. Son designados por esa distancia en mm o
en fracciones de mm.
 Objetivos a campo plano, que corrigen la aberración esférica.
d) Objetivo de inmersión. El objetivo a seco tienen separado el lente frontal

de la preparación por aire, cuyo índice de refracción (n)= 1.000.
46
El índice de refracción del vidrio es (n)=1.510 como resultado de ello los

rayos de luz sufren una reflexión al pasar del vidrio al aire, y algunos caen
fuera del campo visual del objetivo.
Si se interpone entre el portaobjetos y el objetivo un líquido con el (n)
semejante al vidrio, como por ejemplo el aceite de cedro cuyo (n) es de
1.514, los rayos no sufren es reflexión.
Si todos los rayos que pasan por el objeto penetran en el objetivo la
luminosidad es mayor, y el poder resolutivo mayor.
Los objetivos acromáticos a inmersión llevan como indicación su distancia
focal expresada en mm y su aumento.
El ocular, está formado por dos lentes simples o compuestas montadas en las dos
extremidades de un tubo. La lente inferior se llama colectora o vidrio de campo y
se encarga de aplanar y aclarar la imagen real obtenida por el objetivo y completa
por lo tanto la acción del objetivo. La lente superior agranda esa imagen dando
una imagen virtual.
Si el aumento del ocular es de 10x y la del objetivo de 40x, el aumento total de
400x.
Poder resolvente del microscopio (d), es la capacidad de ver dos puntos como
objetos separados. Cuanto menos es la distancia entre esos dos puntos, mayor es
el poder resolvente del microscopio.
Fórmula de Abbe:
𝑘∙𝜆
𝑑=
2 𝐴𝑁
𝜆= longitud de onda
AN= apertura numérica =n senϴ
k= constante
Cuanto menor es la longitud de onda y mayor la AN, mejor es el poder resolvente,

o sea, menos la distancia mínima entre dos puntos para que se aprecien como
tales. Aumentando el índice de refracción del material, intermedio entre el
preparado, (d) mejora.
47
Longitud de onda:
Teóricamente (d) es mejor con luz azul que verde, pero la agudeza visual del ojo
humano es mayor con luz verde.
Resumen.
El objetivo produce una imagen del preparado dentro del microscopio. El
observador mira esa imagen a través de un ocular. Así, si el objetivo aumenta la
imagen 100 diámetros (100x) y el ocular otros 5x (diámetros), el aumento total es
de 500x.
El poder resolvente del microscopio es la capacidad de ver como objetos
separados dos puntos. Cuanto más cercanos estén esos puntos, mejor es el poder
resolvente. El ojo humano a 25 cm puede distinguir la separación de 0.1 mm
(100mu). El microscopio ocular ±0.2 mm= 200mu.
Para formar una imagen clara el lente debe enfocar cada rayo de luz desde un
punto del preparado dando un punto de la imagen. Cuando falla se llama
aberración. Si es cromática separa los componentes del espectro, si es esférica
separa los puntos de la imagen en su distancia de la lente.
MICROSCOPIO ELECTRÓNICO
El microscopio, depende de la longitud de onda de la luz visible (0.4 a 0.7µ). Sea
cual sea el sistema de lentes utilizado, no puede emplearse la luz para distinguir
netamente la estructura de objetos que no están separados entre sí por distancia
mayor de la mitad de la longitud de onda (pongamos 0.2µ).
Como el ojo a simple vista puede distinguir líneas finas separadas en
aproximadamente 0.2 mm, no interesa mucho emplear una amplificación mayor de
1000 veces con el microscopio del luz, porque el ojo humano con esta
amplificación puede distinguir lo que revela la luz de la misma longitud de onda
(0.2µ x 1000 = 0.2 mm). Amplificaciones mayores de 1000 brindan imágenes de
mayores dimensiones, pero no muestran más detalles.
48
El desarrollo revolucionario del microscopio que aumento su poder de resolución

más de cien veces, solo se logró después que los físicos, contrariados por las
limitaciones que les imponían las longitudes de onda luminosa se dirigieron a los
electrones. La longitud de onda de estos es muy corta, tanto que hasta hoy este
factor no ha limitado el poder de resolución del nuevo instrumento.
Para obtener una imagen ampliada con el microscopio de luz, se aprovecha el
hecho de que, en general, los rayos de luz se desvían cuando pasan de un medio
a otro con diferente índice de refracción. Utilizando vidrios con superficies curvas
(lentes), la luz proveniente de un objeto pequeño puede desviarse de manera que
produzca una imagen voluminosa. En el microscopio electrónico se recurre al
hecho de que las vías seguidas por los electrones pueden influirse de manera
similar por campos magnéticos: la fuerza de estos puede variarse según la
intensidad de corriente que pasa a través de las bobinas que excitan dichos
campos.
Para describir el microscopio electrónico conviene comparar su sistema de lentes
con los que tienen el microscopio de luz.
En el microscopio ordinario, la luz de una fuente adecuada se enfoca mediante
una fuente condensadora. La lente del condensador dirige un haz poderoso de luz
a través de la abertura de la platina y a través de la muestra, por ejemplo, un corte
teñido situado en dicha platina: la muestra recibe el nombre de objeto. La luz que
ha atravesado la muestra se enfoca luego por el objetivo. Tal objetivo proporciona
una imagen del objeto en el foco, a cierta distancia entre el objetivo y la lente de
proyección. La lente de proyección, una de las que hay en el ocular del
microscopio ordinario, puede ampliar más la imagen todavía, hasta 10 a 15 veces,
y utilizarse para enfocar la imagen agrandada sobre una pantalla.
La óptica de un microscopio electrónico es sencilla: el instrumento es esencia es
un tubo de rayos catódicos desmontable, en el cual debe mantenerse el vacío por
bombeo constante. Desde el cátodo, un filamento de tungsteno en forma de V que
puede calentarse eléctricamente, se emiten electrones que son atraídos hacia el
ánodo (por una diferencia de potencial de 50,000 a 100,000voltios). El ánodo tiene
una abertura, de manera que es atravesado por un haz divergente de electrones.
El haz divergente es enfocado por la lente condensadora (un campo magnético) y
dirigido hacia el objeto, cuando los electrones atraviesan la preparación unos son
desviados más que otros. El haz de electrones que sale del objetivo es enfocado
primeramente por la lente objetiva y se obtienen una imagen aumentada del
objeto. Esta imagen se agranda más todavía por la lente de proyección.
Al igual que la luz ultravioleta y los rayos X, los electrones no afectan el ojo como
lo hace la luz. Sin embargo, al igual que aquellos producen fluorescencia en
determinadas substancias y también afectan películas fotográficas. Así pues,
49
(como en el caso del microscopio ultravioleta) debe utilizarse una pantalla

fluorescente para enfocar la imagen obtenida con el microscopio electrónico, y
dicha imagen puede fotografiarse.
Las partes de la imagen final correspondientes a zonas del objeto donde los
electrones han sido muy desviados no resultaran muy intensas en la pantalla
fluorescente, serán ligeras en el negativo fotográfico y de color obscuro en el
positivo. Inversamente, las partes de la imagen del objeto correspondientes a
porciones que no desvían mucho los electrones darán imagen brillante sobre la
pantalla fluorescente, serán negras en el negativo y claras en el positivo.
Los electrones atraviesan tan poco la materia que no pueden franquear ni los
objetos más finos utilizados con el microscopio de luz. Para el microscopio
electrónico los objetos deben tener menos de 1/10 de micra de espesor de
preferencia 1/40 de micra (casi exactamente la millonésima parte de una pulgada)
para obtener los mejores resultados.
Como el microscopio electrónico resuelve detalles tan finos, tiene gran interés que
el objeto a observar sea fijado de la manera más perfecta posible. Hace un tiempo
se comprobó por Strangeways y Candi que la mayor parte de fijadores causan
precipitación macroscópica de la proteína en las células, y grados variables de
formación de los componentes celulares. De todos los fijadores ensayados
comprobaron que el que menos alteraba la célula era el tetraóxido de osmio. Estos
resultados fueron confirmados plenamente en los primeros estudios del
microscopio electrónico; desde entonces se han utilizado soluciones tampón de
tetraóxido de osmio como fijador de elección.
Aunque el técnico que emplea el microscopio electrónico no goza de la ventaja
que tienen quien emplea el microscopio de luz, dependiendo del empleo de
colorantes que tiñen los diversos preparados en forma selectiva, se puede realizar
el contraste entre los diferentes componentes observados con el microscopio
electrónico utilizando productos químicos que son densamente electrónicos y que
se fijan en grado diverso a los componentes observados.
El tetraóxido de osmio actúa en esta forma porque el osmio, que dispersa los
electrones fuertemente, es captado con intensidad diferente por los diversos
componentes del objeto observado. Otras sales de metales pesados actúan en
forma similar y se utilizan para aumentar el contraste tales soluciones se
denominan “colorantes electrónicos”. Uno que ha alcanzado amplia aplicación es
el hidróxido de plomo.
Otro perfeccionamiento reciente es el de la “tinción negativa”. Esa técnica incluye
el uso de una solución química densa en electrones (suele utilizarse para este fin
el ácido fosfotúngstico) en el cual se sumerge el preparado; este en lugar de
50
combinarse específicamente con ingredientes orgánicos determinados del

material, llena todos los intersticios que hay entre las diferentes partes del material
y lo deja relativamente intacto. Por lo tanto, en una micrografía electrónica de
material preparado en esta forma se obtiene una imagen negativa en lugar de una
imagen positiva del material. Este método tiene particular valor para demostrar el
contorno superficial de cuerpos de índole delicada, pues ellos por si mismos no
captarían suficiente colorante electrónico para quedar netamente dibujados; pero
si sus espacios se llenan de electrones por tinción negativa, sus siluetas quedan
netamente delimitadas.
MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA
La fluorescencia es la propiedad que tienen algunas substancias
(fluorocromos) de poder absorber energía lumínica de una determinada longitud
de onda y emitir energía lumínica de onda de mayor longitud. Por lo tanto, pueden
utilizarse substancias fluorescentes para descubrir los rayos ultravioletas y los
rayos X invisibles, porque substancias fluorescentes adecuadas expuestas a las
ondas relativamente cortas de la luz ultravioleta, o a las más cortas de los rayos X,
las absorben y emiten ondas más largas de luz visible. Ejemplo: Auramina recibe
luz azul (400-490mu) y emite verde-amarillo (560-590mu).
Hay varios colorantes como el anaranjado de acridina que presentan fluorescencia
y pueden utilizarse para teñir componentes celulares y tisulares que de ordinario
no tienen fluorescencia, de manera que estos últimos pueden después ser
demostrados. Otros colorantes fluorescentes utilizados con fines determinados
son la tioflavina S, la tioflavina T, la rodamina B y la primulina.
Para localizar zonas de fluorescencia con el microscopio, no se requieren tipos
especiales de objetivos y oculares de cuarzo de otros material que transmitan la
luz ultravioleta, pues el observador que busca la fluorescencia descubre la luz
visible emitida por diversos puntos del corte y, claro está, esta luz visible es
perfectamente transmitida por objetivos y oculares corrientes. Sin embargo, si
estos puntos del objeto deben hacerse fluorescentes, hay que iluminarlos desde
abajo con luz de longitud de onda menor que la que ellos emiten. En
consecuencia, la fuente de luz que se utiliza ha de emitir luz ultravioleta.
Toda la luz ultravioleta emitida debe filtrarse; de hecho, mediante filtros
especiales, pueden seleccionarse luces en varias partes de las longitudes de
ondas más breves. Las longitudes de onda del espectro ultravioleta que se utilizan
en el microscopio de fluorescencia suelen ser suficientemente grandes para pasar
en cantidades considerables a través de un condensador ordinario y uno del tipo
de campo obscuro como los generalmente utilizados, de manera que los puntos
51
fluorescentes puedan verse fácilmente sobre fondo negro. Como utilizamos luz
ultravioleta para iluminar el objeto, parte de la misma después de atravesar las
pociones no fluorescentes del objeto pueden seguir a través de objetivos y
oculares. En consecuencia, para evitar la lesión de los ojos por esta luz invisible,
hay que insertar en el ocular filtros que impida el paso de los rayos ultravioletas
permitan el paso de luz del espectro visible (filtro amarillo).
MANEJO DEL MICROSCOPIO

Debe ajustarse a las siguientes normas:
1. La preparación u objeto a examinar, debe colocarse en el centro de la
laminilla porta-objetos y debe ser lo suficiente delgada para permitir a su
través el paso de la luz.
2. La generalidad de las preparaciones deben cubrirse con agua (unas gotas)
sobre la cual a su vez se deposita un cubre-objetos, procurando que no se
formen burbujas de aire.
3. La laminilla porta-objetos, ya lista, debe colocarse en la platina procurando
que la preparación quede en el centro del orificio de la misma platina, con
ellos se conseguirá quede en el centro la preparación, en el centro de la
lente objetiva.
4. La observación inicial debe hacerse, rutinariamente, con el objetivo de
menor aumento (10x) así cuidara que este objetivo se halle en el eje óptico
del microscopio.
5. Enseguida se bajará el tubo del microscopio, accionando los tornillos o
botones macrométricos o rápidos, lo más bajo posible, hasta poner el
objetivo casi en contacto con la preparación. Con el fin de evitar el bajar
demasiado, hasta el punto de que toque el objetivo con la preparación, es
necesario que la maniobra anterior, se realice observando por un lado (no
se debe bajar el tubo estando mirando por el ocular). Este tiempo es
importante.
6. Se procede a iluminar el campo. Procurar que el campo quede bien
uniformemente iluminado, para ellos es necesario recordar que exista el
condensador y exista el diafragma; se subirá el condensador, procurando
obtener una luz de intensidad media; se abrirá y se cerrara el diafragma con
el mismo propósito.
7. Acto seguido asomándose al microscopio, mediante los botones se subirá
lentamente el tubo del microscopio hasta encontrar la imagen deseada.
52
8. Se afinará entonces el enfoque mediante el tornillo micrométrico lentamente

y se ajustara nuevamente la iluminación, subiendo o bajando el
condensador y abriendo o cerrando el diafragma. Se tendrá en cuenta
también, la presencia del filtro, la interposición o evitando su uso.
Igualmente se tendrá mucho cuidado de utilizar la luz adecuada del espejo
(la cóncava para la luz difusa de la una ventana o para la luz próxima de
una lámpara, en ausencia del condensador).
9. Obtenida una buena visión, (buen enfoque y buena iluminación) se
procederá a echar una ojeada a toda la preparación en busca del campo de
mayor interés (especies animales o vegetales buscadas, estructuras, zonas
delgadas, etc.). para ello se moverá la laminilla porta-objetos con los dedos
de ambas manos, teniéndose cuidado de accionar el tornillo micrométrico
para conservar siempre un buen enfoque.
10. Encontrando el objeto, si es pequeño, se procurará centrarlo en el campo y
se rectificara el enfoque y la iluminación. Conseguido ellos, se observan
con detención sus detalles (forma, aspecto, color, brillo, estructura,
movimiento, etc.) haciendo un verdadero análisis del objeto, estudiándolo
ordenadamente y por todas partes. Conforme se hace le examen es
conveniente ir anotando en una hoja especial las observaciones practicadas
y hacer los dibujos correspondientes.
11. Practicada la observación anterior y colocando el objeto en el centro del
campo, puede hacerse necesario un examen con mayor aumento, para lo
cual bastara dar vuelta al revolver y colocar en el eje óptico del microscopio
el objetivo requerido. La preparación quedara casi en el foco y bastara una
media vuelta al tornillo lento para hacer la afinación necesaria. Se volverá
entonces a rectificar la iluminación y se hará un nuevo examen de la
preparación. Todas las observaciones que se hagan deberán,
invariablemente ser anotadas en la hoja especial, para ello.
Para el uso del objetivo de inmersión, se colocara encima del cubreobjetos
una gota de aceite de cedro.
12. El instructor le proporcionara preparaciones fijas para que aprenda a utilizar
“correctamente” el microscopio.
CUIDADOS BÁSICOS DEL MICROSCOPIO
1) Si no lo usa déjelo dentro de su caja, o en su cubierta plástica protegido del

polvo.
53
2) No deben haber cerca del microscopio ni reactivos químicos, ni gases

corrosivos.
3) No deben quedar restos de aceite de inmersión en la platina.
4) Se cuidara que los objetivos a seco no estén en contacto con el aceite de
inmersión, si ellos ocurriera, limpiarlos bien inmediatamente.
5) Cuando se limpie el objetivo de inmersión usar papel especial (papel seda)
para lentes o un trozo de algodón suave ligeramente impregnado de xilol
(xilene) y dejarlo secar.
6) El microscopio no debe desmontarse. Si falla, llame al técnico.
7) Al final de la jornada las partes ópticas del microscopio deben limpiarse
cuidadosamente, en especial el objetivo de inmersión.
MATERIAL.
1. Microscopio óptico.
2. Frotes teñidos.
3. Aceite de inmersión.
METODOLOGÍA.
1. Hacer la observación de laminillas, siguiendo las instrucciones descritas
anteriormente.
2. Dibujar los objetivos y escribir la información que se encuentra detallada en
cada uno de los objetivos.
3. Anotar observaciones.
ACTIVIDADES.
1. Dibuja un microscopio e identifica cada una de sus partes.
CUESTIONARIO.
1. ¿Qué se podría emplear para calibrar el micrómetro ocular, cuando no se
dispone de un portaobjetos micrométrico? Explicarlo.
2. Describir cada una de las características de los diferentes objetivos y su
aplicación.
3. Investigar las diferentes variedades de los aceites de inmersión.
54
4. ¿Cuántos aumentos (x), totales se tienen si se hace la observación con el

ocular de 10x y objetivo de 40x?
CONCLUSIONES.
BIBLIOGRAFIA.
55
PRÁCTICA No. 7
TINCIÓN SIMPLE. (FORMA Y TAMAÑO)
OBJETIVO.
 Realizar las técnicas de preparaciones de frotis y de tinción simple para la
observación de algunas formas y agrupaciones de los microorganismos.
INTRODUCCION
Las técnicas de tinción que se usan en Microbiología se desarrollaron como una
necesidad para poner de manifiesto a las bacterias y sus estructuras, como ya se
había hecho en la observación de las células y tejidos diversos desde mucho
tiempo antes. Los colorantes fueron usados para mejorar el contraste de los
objetos que se observan al microscopio y el medio que los rodeaba. De tal modo
que se desarrollaron procedimientos de fijación que favorecían la unión de los
colorantes con las estructuras celulares y procedimientos adicionales con el
mismo propósito para el cual se aplicaban ciertas sustancias, como los taninos, a
los que se denominó mordentes, las cuales favorecían a la tinción. Se
desarrollaron técnicas muy variadas, que tuvieron un fuerte impacto en las
observaciones microscópicas, pues se utilizaron con gran éxito en las tinciones de
la célula, que tomaban las sustancias colorantes permitiendo distinguir no solo las
células sino, a muchas de las estructuras intracitoplásmicas en numerosos tejidos
animales, vegetales y organismos microscópicos, lo que propicio un gran avance
en las ramas del saber cómo la histología, patología, botánica, zoología y
protozoología.
Tomando en cuenta que las bacterias son células pequeñas y casi transparentes,
que escapan a la observación microscópica, su tinción es indispensable para
conocer su forma, tamaño y agrupación.
Los colorantes son sustancias que originalmente se derivaron de anilina o del
alquitrán; químicamente están constituidos por uno o más anillos aromáticos. Los
cuales tienen sustituyentes diversos llamados cromóforos, que dan la cualidad del
color; a estos compuestos se les llama cromógenos; además tienen un grupo
funcional ionizable, llamado auxócromo, que permite su unión a componentes de
carga contraria presentes en las estructuras celulares y tejidos que se desea
observar. Algunos ejemplos de colorantes usados en las técnicas microbiológicas
son los siguientes: cristal violeta, azul metileno, verde de malaquita, safranina,
fucsina, azul de algodón, rojo Congo, y algunos que no se usan para visualizar
56
directamente bacterias pero se utilizan para contrastar estructuras en otros tipos

de células son el ácido pícrico, el rojo neutro, y la eosina. Se utilizan
preferentemente algunos colorantes porque son básicos, es decir, al ionizarse la
porción de la molécula que tiene color está cargada positivamente, lo cual le da
afinidad por las estructuras celulares de carga negativa; las bacterias en superficie
tienen una carga neta negativa en medio neutro o alcalino, por lo cual los
colorantes ácidos no son adecuados para teñirlas.
La tinción simple es aquella en la que se aplica un solo colorante. Las
soluciones empleadas para teñir las bacterias son generalmente acuosas. En
ocasiones se prepara una solución concentrada en alcohol para favorecer la
rápida disolución del colorante y después se diluye con agua. La concentración
final del colorante varía de 0.5 hasta el 5%, según sea la intensidad del color. Se
obtienen mejores resultados de coloración si se utilizan soluciones de baja
concentración por un tiempo largo en vez de soluciones concentradas por un
tiempo corto.
MATERIAL.
1. Soluciones de cristal violeta, safranina, azul metileno y fucsina básica.
2. Portaobjetos.
3. Puentes de coloración.
4. Cepas: Escherichia coli, Staphylococcus aureus,
METODOLOGÍA.
I. Frotis a partir de un medio sólido.
1. Marcar un extremo del portaobjetos limpio y desengrasado.
2. Colocar con el asa una pequeña gota de solución salina (SS) y depositar en
el centro del portaobjetos.
3. Tomar en el asa estéril una porción muy pequeña del crecimiento y hacer
una suspensión homogénea en la gota de (SS), extender para formar una
película fina.
4. Dejar secar al aire.
5. Fijar el frotis con calor, para lo cual se calienta suavemente pasando
rápidamente la parte posterior del portaobjetos dos o tres veces por la flama
del mechero, hasta alcanzar una temperatura que sea soportable en el
dorso de la mano.
57
II. Frotis a partir de un cultivo en medio líquido.

1. Marcar un extremo del portaobjetos limpio y desengrasado.
2. Sin poner SS, tomar con el asa estéril dos o tres gotas de cultivo y
colocarlas en el centro del portaobjetos, extender para formar una película
delgada y uniforme.
4. Fijar al calor, como se indicó arriba.
III. Tinción simple de los frotis.

1. Colocar los portaobjetos con los frotis sobre el puente de coloración.
2. Cubrir el frotis con unas gotas de colorante y dejar actuar durante un
minuto.
3. Con las pinzas de disección tomar el portaobjetos por un extremo y escurrir
el colorante.
4. Lavar el exceso de colorante con un chorro suave de agua.
IV. Observación microscópica de los frotis.
1. Examinar las preparaciones con el objetivo de inmersión.
Tabla 5.1
Diversidad de formas y agrupaciones de organismos procarióticos.
Forma Agrupación Ejemplo
Pares (diplococos) Neisseria
Racimos (estafilococos) Staphylococcus
Esféricas (cocos) Cadenas (estreptococos) Streptococcus
Tétradas Pediococcus
Cubos de 8 (sarcinas) Micrococcus
Láminas Lampropedia
Bacilos cortos aislados Escherichia
Bacilos largos en pares Bacillus
Bacilos largos en cadenas Bacillus, Lactobacillus
Cilíndrica Bacilos largos en empalizada Corynebacterium
Bacilos fusiformes aislados Caulobacter
Helicoidal Aislado Treponema
Curva Aislado Vibrio
Espiral Aislado Beggiatoa
Plana Mosaicos cuadrados Haloarcula
Estrella Aislado Stella
58
Figura 8.1 Agrupación de las bacterias.
ACTIVIDADES
1. De acuerdo con sus observaciones, indique en la siguiente tabla la
morfología microscópica de cada microorganismo.
Morfología microscópica.
Microorganismo Forma Agrupación Esporas
Escherichia coli
Staphylococcus aureus
2. Hacer esquemas a colores de cada una de las preparaciones observadas e

indique sus características.
A B C
59
CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es el propósito de fijar los frotis con calor?
2. ¿Qué otros procedimientos de fijación se pueden emplear?
3. ¿Cuáles son las características que debe tener un frotis bacteriano de
buena calidad?
4. ¿En qué casos se aplica la técnica de tinción simple?
5. Desde el punto de vista molecular, ¿a qué debe un colorante su color?
6. Definición de tinte o colorante
7. ¿A qué se le llama colorante ácido y a qué colorante básico?
8. De 2 ejemplos de colorantes ácidos y 2 de colorantes básicos
9. ¿Qué diferencia existe entre un tinte y un cromógeno?
CONCLUSIONES.
BIBLIOGRAFÍAS.
60
PRÁCTICA No. 8
TINCIONES DIFERENCIALES.
TINCION GRAM.
Objetivo.
 Conocer el fundamento de la tinción Gram.
 Realizar el procedimiento de coloración de Gram con especies bacterianas

conocidas, así mismo observar las variaciones del procedimiento.
Introducción.
La observación microscópica de las bacterias es más fácil cuando se tiñen.
Sin embargo, es fácil confundir un punto o bastón teñido sobre un fondo del mismo
color con algún artefacto. Este problema apareció cuando las muestras de tejido
infectados se teñían con azul de metileno incluidas las bacterias. El primer intento
para resolver el problema fue decolorar los cortes después de la coloración. En los
tejidos que tenían el bacilo tuberculoso, esto fue efectivo pero en otros las
bacterias se decoloraban igual que los tejidos y no se ganaba nada. El problema
fue resuelto por Hans Christian Gram, patólogo danés que en 1884 introdujo un
colorante de contraste después de la decoloración. En esta tinción diferencial las
bacterias se teñían de color púrpura obscuro usando la llamada solución de
Ehrlich, violeta de genciana con anilina y los tejidos circundantes con café de
Bismarck o vesuvina. Originalmente la coloración Gram se desarrolló para
visualizar las bacterias en los tejidos animales pero pronto se advirtió que era útil
para la diferenciación de bacterias teñidas por esta coloración y se dividen en dos
grupos: las que requieren el violeta de genciana o cristal violeta o Gram positivas y
las que se decoloran y se tiñen con el colorante de contraste (generalmente) de
color rojo como la safranina o la fucsina básica aunque puede usarse verde de
malaquita para los observadores daltónicos o Gram negativas.
La afinidad tintorial seguramente se debe a numerosas diferencias en la

estructura y composición química de muchos componentes celulares entre los que
destaca la pared celular. Las bacterias Gram positivas tienen una pared
compuesta principalmente de una capa de peptidoglicano relativamente gruesa
(20-80 nm). En cambio, las Gram negativas tienen una capa de peptidoglicano
delgada (5-10 nm) además de una membrana externa constituida de fosfolípidos y
lipolisacárido.
61
En general, las bacterias Gram positivas son susceptibles a la penicilina y

varios agentes químicos y son más resistentes a la desintegración por tratamiento
mecánico que las Gram negativas, que como grupo, son más susceptibles a otros
antibióticos como la estreptomicina. Las diferencias básicas en las estructuras
superficiales de las bacterias Gram positivas y las Gram negativas contribuyen a
aclarar la diferencia en la respuesta de la coloración de Gram. Durante la tinción
Gram, ambos grupos de bacterias se tiñen con el colorante primario (Cristal
violeta) y mordente (yodo). El complejo formado colorante-mordente, es atrapado
por la célula Gram positiva, por la deshidratación y la porosidad reducida de la
gruesa pared celular, posterior a ello se realiza un lavado diferencial con etanol al
95% y la célula Gram positiva tiene la capacidad de retener el complejo y las Gram
negativas por la delgada capa se decoloran. Al adicionar el colorante secundario
(safranina), las células decoloradas ahora se tiñen fácilmente con el colorante de
contraste, Gram negativas.
MATERIAL.
1. Solución de cristal violeta.
2. Solución de lugol.
3. Solución de alcohol acetona.
4. Solución de safranina.
5. Portaobjetos.
6. Microscopio.
7. Asa.
8. Puentes de coloración.
9. Cepas: Escherichia coli, bacillus subtilis y Staphylococcus epidermidis.
METODOLOGÍA.
I. Tinción Gram.
1. Hacer frotis de cada bacteria y fijarlos con calor.

2. Cubrir los frotis con cristal violeta y dejarlo actuar durante un minuto.
Escurrir el colorante y lavar con un chorro suave de agua.
3. Cubrir los frotis con solución de Lugol y dejarlo actuar durante un minuto.
Escurrir el reactivo y lavar con un chorro suave de agua.
4. Colocar el frotis en forma vertical y usando un fondo blanco, decolorar
añadiendo gota a gota el alcohol-acetona durante 5 a 15 segundos. El
momento exacto para terminar la decoloración con agua es cuando de fluir
62
“hilos de colorante” por el frotis. Este es el paso crítico de la tinción. Lavar

inmediatamente con un chorro suave de agua.
5. Cubrir los frotis con safranina y dejarla actuar durante un minuto. Escurrir el
colorante y lavar con un chorro suave de agua. Dejar secar al, aire.
6. Observar al microscopio con el objeto de inmersión.
ACTIVIDADES.
1.- Después de aplicar la técnica de Gram a las cepas proporcionadas y de
acuerdo con sus observaciones, indique en la tabla siguiente:
Morfología microscópica.
Microorganismo. Forma. Agrupación. Gram.
Escherichia coli
Bacillus subtilis
Staphylococcus epidermidis.
2.- Elabore esquemas de cada una de las preparaciones observadas en el punto 1.
Escherichia coli Bacillus subtilis Staphylococcus epidermidis.
3.- Elabore esquemas a colores de cada una de las preparaciones observadas en el

punto II.
Escherichia coli Bacillus subtilis Staphylococcus epidermidis.
63
4.- Elabore esquemas a colores de cada una de las preparaciones observadas en el

punto III.
Frotis 1 Frotis 2
Cristal violeta. Gram violeta + lugol.
Frotis 3 Frotis 4
Cristal violeta + Lugol + decoloración Gram completo.
CUESTIONARIO.
1.- Podrías sustituir el colorante primario por algún otro colorante ¿si ó no?
¿Porqué?
64
2.- ¿ Cuál es la composición de la pared bacteriana en una Gram positiva y como

es en una Gram negativa?
3.- ¿Cuál es la función del Lugol en la tinción Gram?
4.- ¿Cuál es la formula química semidesarrollada del cristal violeta?
5.-¿Qué otros colorantes se pueden emplear en lugar de safranina?
6.-¿Qué sucedería si agregara el colorante secundario más concentrado o por un
tiempo más prolongado?
7.- ¿Qué inconveniente encontraría si agregase primero la safranina en la técnica?
8.- Escriba la formula química semidesarrollada de la safranina.
9.- ¿Qué es una coloración supravital?
CONCLUSIONES.
BIBLIOGRAFÍA.
65
Práctica No. 9
TINCIÓN ZIEHL- NEELSEN.
OBJETIVOS.
 Conocer el fundamento de la tinción Ziehl-Neelsen.
 Realizar el procedimiento de coloración de Ziehl-Neelsen para la
diferenciación de bacterias ácido-alcohol resistentes.
INTRODUCCIÓN.
La tinción de Ziehl-Neelsen es un tipo de coloración diferencial que fue

desarrollado inicialmente por Paul Ehrlich para poner de manifiesto la presencia de
los bacilos causantes de la tuberculosis en muestras clínicas de pacientes.
Roberto Koch usaba tejidos previamente fijados en soluciones diversas. Ehrlich
modificó este procedimiento para observar bacilos en preparaciones de esputo las
cuales fijaba por medio de calentamiento en horno de 100 a 110°C ó directamente
a la flama del mechero y los teñía de 15 a 30 minutos en una solución saturada de
anilina a la que añadía fucsina o violeta de metilo. La decoloración con vesuvina
era muy lenta, por lo que recurrió al uso de soluciones concentradas de ácido
nítrico. Como era difícil observar a las bacterias teñidas por su escasez y por todo
el material incoloro que lo rodeaba, procedió a contrastar el fondo, es decir si la
tinción inicial era de color violeta lo contrastaba con un colorante amarillo ó si la
tinción inicial era de color rojo, el colorante de contraste es azul. La técnica de
Ziehl-Neelsen usada actualmente es una ligera modificación de la original de
Ehrlich.
La técnica de tinción de Ziehl-Neelsen aprovecha las cualidades peculiares de las
bacterias de los géneros Mycobacterium y Nocardia que son decoloradas por
soluciones de alcohol ácido, pero que se pueden teñir con muy diversos
colorantes si éstos se aplican en soluciones alcalinas con una pequeña cantidad
de fenol y calentando suavemente por unos pocos minutos.
Los géneros mencionados presentan en su estructura un alto contenido de ácidos
grasos de cadena muy larga constituidos en ceras y ácidos micólicos y nocárdicos,
respectivamente. Estas ceras parecen jugar un papel importante en la respuesta
de las bacterias a la coloración. Se ha postulado que el alto contenido de ácidos
grasos interviene decisivamente en la coloración ya que al calentar la preparación
con el colorante primario hasta emisión de vapores se favorece la fusión de ceras
66
y se aumenta la energía cinética de las moléculas, ambos fenómenos facilitan la

penetración del colorante a la célula; al suspender el calentamiento y lavar con
agua fría se provoca la solidificación de las ceras, de modo que el colorante ya no
puede salir. También se ha postulado que la mezcla de colorante con fenol es más
soluble en lípidos bacterianos que en el agente decolorante, lo cual contribuye a
su permanencia en el interior de las células. Puesto que el proceso de
decoloración es muy enérgico, cualquier bacteria que no contenga abundantes
lípidos como los de Mycobacterium y Nocardia perderá el colorante primario
durante la decoloración y tomará el colorante de contraste que es el azul de
metileno.
Las bacterias que resisten la decoloración por alcohol ácido, se denominan bacilos
ácido-alcohol resistentes (BAAR).
Actualmente la tinción de Ziehl-Neelsen tiene gran importancia como una de las
pruebas en el diagnóstico de Mycobacterium tuberculosis, agente causal de la
tuberculosis, enfermedad cuya incidencia está aumentando recientemente.
MATERIAL.
1. Muestra problema.
2. Fucsina fenicada.
3. Alcohol-ácido.
4. Azul de metileno.
5. Portaobjetos.
6. Papel filtro.
7. Aplicador de madera.
8. Mechero de Bunsen.
9. Solución desinfectante.
10. Charola para la tinción.
11. Puente de tinción.
METODOLOGÍA.
1. Hacer un frotis de la muestra problema. Dejar secar al aire y fijar al calor.
2. Colocar portaobjetos en charola de tinción y colocar el papel filtro sobre el
frotis de muestra.
3. Agregar la fucsina fenicada hasta cubrir totalmente el papel filtro.
67
4. Con el mechero calentar hasta la emisión de vapores, manteniéndose así

durante 5 a 10 minutos, agregar varias veces colorante de fucsina fenicada
sobre la laminilla para evitar que se deseque.
5. Lavar con chorro de agua suavemente.
6. Decolorar con alcohol-ácido por 30 segundos.
7. Lavar abundantemente.
8. Agregar azul de metileno y dejar actuar entre 30 segundos y un minuto.
9. Lavar con chorro de agua suave.
10. Secar al ambiente.
11. Observar en el microscopio.
ACTIVIDADES.
1. Realizar secuencia esquematizada de la tinción realizada y de lo observado

en el microscopio.
Observación a:______x
2. Elabore un esquema que represente la pared celular de los BAAR

destacando las partes que lo constituyen.
68
CUESTIONARIO.
1. ¿Qué es una coloración diferencial?
2. ¿La tinción de Gram, es una sustitución adecuada para teñir bacilos ácido-
alcohol resistente?. Si no, ¿por qué?
3. ¿Qué coloración toma el BAAR y cuál el resto del campo?
4. ¿A qué se le atribuye la facultad del ácido-alcohol resistencia?
5. ¿Cuál es el mordente en la técnica de Ziehl-Neelsen y por qué se le
considera así?
6. En el Mycobacterium tuberculosis encontramos lípidos estructurales,
menciónelos:
7. Además de los lípidos, ¿Qué otros componentes se han encontrado en el
mismo microorganismo?
CONCLUSIONES.
BIBLIOGRAFÍA.
69
Práctica No. 10
TINCIONES SELECTIVAS.
(CÁPSULA Y ESPORAS).
OBJETIVOS.
 Conocer el fundamento de algunas coloraciones selectivas que le permitan

observar estructuras bacterianas.
 Efectuar varios procesos de coloraciones selectivas que le permitan
observar las estructuras bacterianas.
INTRODUCCIÓN.
Algunas estructuras bacterianas superficiales como: la cápsula o los

flagelos y los componentes interiores como: esporas, gránulos, gránulos
metacromáticos. Pueden tener un valor taxonómico y ayudar a la identificación de
los microorganismos conforme a la presencia de estas estructuras.
Para poder observarse se utilizan técnicas de coloración especiales.
A) ESPORAS (METODO DE SHAFFER – FULTON).
Algunos géneros bacterianos entre los que destacan Clostridium y Bacillus,

producen en su interior formas de resistencia denominadas esporas. Se producen
cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los
nutrientes, temperaturas extremas, compuestos tóxicos, etc.), estas bacterias
pueden pasar de un estado vegetativo a un estado latente o espora.
Las esporas poseen unas cubiertas exclusivas y la localización en el interior de la

célula constituye una característica de cada bacteria, las esporas aparecen en el
microscopio óptico como estructuras refringentes y de difícil tinción.
Ciertas bacterias responden a los cambios desfavorables del medio ambiente. El

grupo de bacterias que presentan tal capacidad son: bacilos gram positivos
aerobios y anaerobios facultativos del género Bacillus entre los se encuentran: B.
subtilis, B. cereus, B. anthracis; y los bacilos gram positivos anaerobios estrictos
del género Clostridium: C. perfringens, C. botulinum, C. difficile.
70
Las esporas de estos grupos pueden encontrarse situadas a diferentes distancias

dentro del bacilo: para poder distinguirlas se acude a diversas técnicas de
coloración. La forma más simple de observar a las esporas es como cuerpos
refringentes intracelulares, en suspensiones de bacterias sin teñir o como áreas
incoloras dentro de las células bacterianas, teñidas con los métodos habituales. La
pared de la espora es relativamente impermeable, no obstante los colorantes
pueden penetrar si se calienta la preparación.
La tinción específica de esporas, requiere dos colorantes:
Verde de malaquita: capaz de teñir las esporas en caliente y en frío por un tiempo
más prolongado.
Safranina: colorante de contraste que tiñe las formas vegetativas.
Las esporas, tras la primera tinción no perderán el colorante en el lavado con agua
y si lo harán las formas vegetativas, las cuales quedarán teñidas con el segundo
colorante.
B) TINCIÓN NEGATIVA. (CAPSULA).
La cápsula de las bacterias que la presentan, sirve como mecanismo de defensa

contra algunas células fagocitarias por lo que constituye un importante factor de
virulencia y adherencia para las bacterias que la poseen. Esta estructura
superficial es una secreción mucilaginosa generalmente formada por
polisacáridos. No tiene la misma afinidad por los colorantes que otros
componentes somáticos, por ellos algunas técnicas tiñen la célula bacteriana y el
campo, pero no la cápsula, y se observa por contraste, ya que realmente se tiñe el
fondo sobre el que está el microorganismo y pero no se van a teñir. Se puede
emplear para ver la cápsula de S. pneumoniae y Cryptococcus neoformans en el
LCR.
La mejor técnica para visualizar cápsulas se basa en realizar una tinción negativa
utilizando tinta china o nigrosina, colorante que no penetra la célula sino que
ennegrece el medio (efecto cielo estrellado) y los microorganismos aparecen
refringentes sobre el fondo negro. Es un modo satisfactorio de aumentar el
contraste de los microorganismos en la microscopia óptica, pero su máxima
utilidad está en revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células
bacterianas.
MATERIAL PARA TINCIÓN DE ESPORAS.

1. Cepas de Bacillus subtilis.
71
2. Solución de Verde de Malaquita al 5%

3. Eosina al 2.5%
4. Safranina al 0.5%
5. Portaobjetos
6. Asa
7. Mechero
8. Microscopio óptico
METODOLOGÍA.
1. Hacer un frotis, dejar secar y fijar al calor.

2. Cubrir el frotis completamente con la solución de Verde de Malaquita al 5%;
Hervir por 20 segundos, cubriendo de colorante la preparación para no
dejar secar. Seguir por 30 segundos más, hasta completar 3 minutos.
3. Dejar enfriar.
4. Lavar con agua corriente por 30 segundos.
5. Cubrir el frotis con la solución de Eosina al 2.5%
6. Lavar y dejar secar al ambiente.
7. Se cubre con Safranina al 0.5% por 30 segundos.
8. Se lava y se deja secar al ambiente.
9. Observar al microscopio.
MATERIAL PARA TINCIÓN DE CAPSULA.
1. Cultivo de 24 horas de cepa capsulada problema.

2. Tinta china negra.
3. Portaobjetos.
4. Asa.
5. Mechero.
6. Microscopio.
METODOLOGÍA:
1. Colocar en un portaobjetos una gota de tinta china
2. Tomar muestra de la cepa problema e inocular directamente sobre la tinta
china.
72
3. Colocar un cubreobjetos.
4. Observar a 40x.
ACTIVIDADES.
1. Esquematizar los pasos de la tinción de esporas y la tinción negativa.
2. Dibujar e identificar la forma y posición de la espora en la tinción realizada.
3. Dibujar lo que se observo en la tinción negativa.
CUESTIONARIO.
1.¿Qué es una tinción especial?
2.¿Qué función desempeña la cápsula en la infertilidad de un organismo?
3-¿Se puede correlacionar siempre la presencia de cápsula en una especie
patógena con la virulencia?
4.¿Qué tipo de monosacáridos se encuentran formando la cápsula?
5. Hacer una lista de varias especies patógenas aerobias y anaerobias que formen
esporas así como enfermedades que ocasionan:
6. ¿Cuál es la función de las esporas?
7. El primer organismo que era agente etiológico de una enfermedad fue formador
de esporas, ¿De cuál se trata?¿Cómo y quién lo descubrió?
CONCLUSIONES.
BIBLIOGRAFIA.
73

Manual Nuevo 1 Y 2 Bloque

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Manual Nuevo 1 Y 2 Bloque

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Facultad de Químico Farmacobiología UMSNH.

Laboratorio de Microbiología. Manual de Microbiología I.

El presente manual incluye ejercicios de laboratorio tendientes a proporcionar una

REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA.

1. El estudiante debe ingresar al laboratorio con bata puesta, limpia y

15. Cuando de manera accidental se derrame material contaminado, deberá

Primer bloque de evaluación.

Segundo bloque de evaluación.

Tercer bloque de evaluación.

Primer bloque de evaluación

Revisión de la NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002. Protección ambiental –

El Congreso de Estados Unidos elaboró y aprobó un acta donde se establecieron

lineamientos de carácter recomendatorio, pero una vez adoptadas son

El 14 de septiembre de 2005 se publicaron en el Diario Oficial de la Federación,

6. Según la NOM, ¿cuáles son los niveles en que se clasifican los

Esterilización por calor

Procedimientos por calor húmedo: Ebullición.

La esterilización sirve para objetos y productos inanimados, ya que su

Varios materiales, por ejemplo; ciertos azúcares y los sueros sanguíneos, se

Métodos de validación de la esterilización.

Controles químicos: Se utilizan sustancias químicas que viran de color

en contacto con el agente esterilizante.

 Internos: Detectan la correcta penetración del agente

Controles biológicos: Son dispositivos inoculados con bacterias, por

1. Mostrar el material comúnmente utilizado en el laboratorio de Microbiología.

2. Realizar el etiquetado del material para su almacenamiento o esterilización.

 Comprender porque no todos los microorganismos tienen la capacidad para

vitaminas o sales minerales. Ejemplos específicos de tales componentes de los

Son medios simples que contienen en general los nutrientes esenciales

3. Medios Selectivos o Inhibitorios:

Cuando una muestra contiene una contiene gran cantidad de M.O., su

Se logra un medio selectivo variando la temperatura, Atmósfera, pH, o

Contienen sustancias químicas o indicadores que permiten identificar con

Son muy utilizados en bacteriología del tracto intestinal. Son generalmente

7. Medios para Conservación:

Son medios de cultivo por lo general medios basales, destinados para el

1. Agar base para sangre.

11. Mechero de Bunsen.

 Preparar 65 ml de Agar Nutritivo como lo indica el frasco. Calentar hasta

 Observar, familiarizarse y aprender a distinguir las formas de crecimiento de

 Identificar los componentes del medio que proporcionan las características

se encontrarán un solo tipo de microorganismos. Si se quiere trabajar con un

2. Rotular placas e incubar todas las cajas a 35°C/ 24 h y reportar resultados.

En el siguiente esquema se muestra algunas propiedades de crecimiento de las

Figura 4.1 Morfología colonial macroscópica.

1. Comprobar el crecimiento en los medios de cultivo.

OBJETIVO: Conocer los métodos de inoculación empleados en los medios de

Esterilización del asa bacteriológica

aproximadamente; se inicia el calentamiento por la base del mango y se

Medidas generales para la inoculación de medios de cultivo.

Inoculación de placas Petri con gelosa con siembra por estría.

Estría simple. En éste procedimiento se toma la muestra con el asa previamente

Inoculación de tubos con medio de cultivo.

Pasos para la inoculación de tubos con medio en plano inclinado.

Inoculación de tubos con medio semisólido.

Inoculación de tubos con medio líquido. Se toma el asa y se inserta en el

Características de crecimiento de los medios sólidos.

 Crecimiento en medios líquidos.

 Crecimiento en presencia de oxígeno.

Inoculación de placas con gelosa nutritiva.

Inoculación de tubos con medio semisólidos.

Inoculación de tubos con medios líquidos.

2. Utilizando el asa bacteriológica de aro previamente esterilizada, tomar

M.O:_________ _ _________